[논문]Paenibacillus woosongensis의 Xylanase 유전자 클로닝과 특성분석

윤기홍

doi:10.7845/kjm.2012.48.2.141

Paenibacillus woosongensis의 Xylanase 유전자 클로닝과 특성분석
Cloning and Characterization of Xylanase Gene from Paenibacillus woosongensis 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.48 no.2, 2012년, pp.141 - 146

초록
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Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 대장균에 클로닝하였다. Xylanase 유전자는 211 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 633 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 xylanase는 glycosyl hydrolase family 11에 속하며 Paenibacillus의 xylanase와 85-89% 상동성을 보였다. Xylanase 유전자를 T7 promoter로 과잉발현한 결과 그 발현량이 높지 않았으며, 균체내 외에서 모두 효소활성이 관찰되었다. 재조합 대장균의 균체파쇄상등액을 사용하여 효소 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 $60^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였다. 한편 xylanase의 기질로 xylan과 xylooligosaccharides를 사용하였을 때 xylose와 xylotriose가 주된 최종 반응산물로 관찰되었으며 xylobiose는 분해하지 못하였으나 이보다 중합도가 큰 xylooligosaccharides는 분해하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

A gene encoding the xylanase (XynA) predicted from partial genomic sequence of Paenibacillus woosongensis was cloned into Escherichia coli by PCR. This xynA gene consisted of 633 nucleotides, encoding a polypeptide of 211 amino acid residues. The deduced amino acid sequence exhibited 85-89% identity with those of several Paenibacillus xylanases, belonging to the glycosyl hydrolase family 11. As a results of expression of the structural gene by T7 promoter of a pET23a(+) expression vector, xylanase activity was higher in cell-free extract than culture filtrate of a recombinant Escherichia coli BL21(DE3) CodonPlus. However, the expression level of xylanase was not sufficient be detected by SDS-PAGE. The cell-free extract showed maximal xylanase activity at $60^{\circ}C$ and pH 5.5. The predominant products resulting from xylan and xylooligosaccharide hydrolysis were xylose and xylotriose. The enzyme could hydrolyze xylooligosaccharides larger than xylbiose.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

woosongensis 균체로부터 총 염색체 DNA를 분리하기 위해서는 Genomic DNA prep kit (Solgent, Korea)를 사용하였다. Genome Sequencer FLX Titanium (Roche, Germany)으로 총 염색체 염기서열을 분석하고 GS FLX Titanium Cluster (PSSC Labs, USA)로 조합하여 86 contigs로구성된 5,651 kb의 서열을 결정하였다 (Solgent, Korea). Xylanase 유전자를 클로닝하기 위해서는 유전체의 염기서열을 활용하여 제조한 upper (CATTAACATACCTTCAATGTGTATC)와 lower primer (GTTCCACCCTGGACGAACACA)로 95℃ (25초), 60℃ (40초), 72℃ (2분)의 조건에서 pfu DNA polymerase를 사용하여 PCR 반응을 실시하였으며 증폭된 DNA 단편을 HincII로 절단한 pUC19에 도입하였다.
Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 대장균에 클로닝하였다. Xylanase 유전자는 211 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 633 뉴클레오티드로 이루어졌다.
TSB 액체배지에서 배양한 P. woosongensis 균체로부터 총 염색체 DNA를 분리하기 위해서는 Genomic DNA prep kit (Solgent, Korea)를 사용하였다. Genome Sequencer FLX Titanium (Roche, Germany)으로 총 염색체 염기서열을 분석하고 GS FLX Titanium Cluster (PSSC Labs, USA)로 조합하여 86 contigs로구성된 5,651 kb의 서열을 결정하였다 (Solgent, Korea).
0)에서 배양하였다. Xylanase 유전자를 과잉 발현하기 시키기 위해서는 평판배지에서 자란 콜로니를 항생제를 첨가한 LB에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 동일배지 100 ml을 함유한 baffled flask에 배양액을 1%가 되도록 접종하고 30℃에서 진탕 배양하면서 흡광도(OD600)가 0.6에 도달했을 때 IPTG를 0.5 mM이 되도록 첨가하여 25℃에서 5시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 배양균체를 초음파 파쇄하고 이를 다시 원심분리하여 상등액을 xylanase 조효소액으로 사용하였다.
Xylanase 유전자를 과잉발현 시키기 위해 구조유전자를 pET23a의 T7 promoter 하단에 도입하였다. Xylanase의 구조유전자내에 NdeI 절단위치 서열이 있으므로 pET23a(+)의 NdeI과 XhoI 사이에 유전자를 도입하기 위해 4종류의 primers를 이용하여 재조합 플라스미드를 제조하였다.
Genome Sequencer FLX Titanium (Roche, Germany)으로 총 염색체 염기서열을 분석하고 GS FLX Titanium Cluster (PSSC Labs, USA)로 조합하여 86 contigs로구성된 5,651 kb의 서열을 결정하였다 (Solgent, Korea). Xylanase 유전자를 클로닝하기 위해서는 유전체의 염기서열을 활용하여 제조한 upper (CATTAACATACCTTCAATGTGTATC)와 lower primer (GTTCCACCCTGGACGAACACA)로 95℃ (25초), 60℃ (40초), 72℃ (2분)의 조건에서 pfu DNA polymerase를 사용하여 PCR 반응을 실시하였으며 증폭된 DNA 단편을 HincII로 절단한 pUC19에 도입하였다. 이를 E.
0의 범위에서는 Tris 완충용액을 각각 사용하였다. Xylanase에 의한 xylan 가수분해 산물을 분석하기 위해서 xylan과 xylooligosacharides를 기질로 하여 과량의 효소를 첨가하고 반응액의 pH는 최적으로 조절하여 40℃에서 5시간 반응을 수행한 후 95℃에서 3분간 열처리하고 원심분리하여 얻은 상등액을 적정량 취해 chloroform, acetic acid와 증류수[4.3:5:0.7, (v/v)] 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck Kiesegel, No. 5748)에서 전개하였다. 발색제(para-anisaldehyde 0.
Xylanase 유전자를 과잉발현 시키기 위해 구조유전자를 pET23a의 T7 promoter 하단에 도입하였다. Xylanase의 구조유전자내에 NdeI 절단위치 서열이 있으므로 pET23a(+)의 NdeI과 XhoI 사이에 유전자를 도입하기 위해 4종류의 primers를 이용하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. Primers Ns-F (GTAGGTCATATGTTTAAGTTCAAGAAGAAAATGC)와 X-R (GGCCAGTCTCGAGTTACCACACTGTTACGTTAGAGC)에는 크로닝을 위한 NdeI과 XhoI 절단위치를 각각 도입하였고, Nm-R (TATACATCATATGTGCCCCCATC)과 Nm-F(GGGGGCACATATGATGTATACAC)는 구조유전자의 NdeI 절단위치 지역에 해당한다.
Primers Ns-F (GTAGGTCATATGTTTAAGTTCAAGAAGAAAATGC)와 X-R (GGCCAGTCTCGAGTTACCACACTGTTACGTTAGAGC)에는 크로닝을 위한 NdeI과 XhoI 절단위치를 각각 도입하였고, Nm-R (TATACATCATATGTGCCCCCATC)과 Nm-F(GGGGGCACATATGATGTATACAC)는 구조유전자의 NdeI 절단위치 지역에 해당한다. 먼저 primer Nm-F와 X-R을 사용하여 증폭한 xylanase 유전자 하반부분을 NdeI과 XhoI으로 절단하여 pET23a(+)에 도입한 재조합 플라스미드를 제조한 후, Ns-F와 Nm-R을 사용하여 증폭한 xylanase 유전자 상반부분을 NdeI으로 절단하여 앞 단계에서 제조된 재조합 플라스미드의 NdeI 위치에 삽입함으로써 pEYX137을 제조하였다. 재조합 플라스미드 pEYX137에 의해 얻은 E.
5748)에서 전개하였다. 발색제(para-anisaldehyde 0.5 ml, conc. H₂SO₄ 0.5 ml, 95% ethanol 9 ml, glacial acetate 2-4방울)를 뿌려 120℃에서 10분간 방치함으로써 전개된 물질을 발색시켜 관찰하였다.
본 연구에서는 P. woosongensis xylanase의 유전자로 유추되는 orf 중 그 크기가 가장 작으며 GH11에 속하는 xylanase (xynA) 유전자로 예상되는 DNA 단편을 PCR로 증폭한 후 E. coli DH5α에 도입함으로써 oat spelt xylan을 첨가한 평판배지에서 투명한 분해환을 보이는 형질전환주를 얻었다.
최근 β-xylosidase/α-arabinofuranosidase 기능을 동시에 보이는 효소와 그 유전자에 대한 특성이 보고된 바 있다(Kim and Yoon, 2010). 본 연구에서는 P. woosongensis로부터 GH11 xylanase 유전자를 크로닝하여 효소 반응특성을 분석하였다.
이를 E. coli DH5α에 형질전환하고 oat spelt xylan (0.5%)와 ampicillin을 첨가한 LB 배지에 도말한 후 xylan 분해환을 갖는 형질전환주를 선발하였다.
플라스미드 pUC19에 클로닝된 xynA는 재조합 대장균에서 그 발현량이 매우 낮아 XynA의 생산성을 높이기 위해 xynA 구조유전자를 pET23a의 T7 promoter 하단에 도입한 재조합 플라스미드 pEYX137을 제조하였다. 이를 E.
효소 활성에 미치는 반응 온도의 영향을 조사하기 위하여 반응 pH를 5.5로 고정하고 30–70℃ 범위의 온도에서 반응을 수행하였으며, 반응 pH의 영향을 조사하기 위해서는 반응온도를 55℃로 고정하고 pH 3.5–9.0의 범위에서 반응을 수행하여 xylanase 활성을 각각 측정하였다.

대상 데이터

P. woosongensis KCTC 3953 (DSM 16972)은 유전자 제공원으로 사용되었고 tryptic soy broth (TSB; 17 g of tryptone, 3 g of soytone, 2.5 g of dextrose, 5 g of NaCl, 2.5 g of K₂HPO₄ per L, pH 7.2)를 사용하여 37℃에서 배양하였다. 유전자조작을 위한 숙주와 vector로는 Escherichia coli DH5α와 플라스미드 pUC19, xylanase 유전자의 과잉발현을 위해서는 E.
유전자조작을 위한 숙주와 vector로는 Escherichia coli DH5α와 플라스미드 pUC19, xylanase 유전자의 과잉발현을 위해서는 E. coli BL21(DE3) CodonPlus와 pET23a(+)을 각각 사용하였다.

성능/효과

JDR-2 (ACT03278), Paenibacillus sp. DG-22 (ABI96991) 등 다수의 Paenibacillus 속 균주 및 Aeromonas punctata (BAA06837) 유래의 xylanases 와 85-89% 수준의 상동성을 보였고 이들은 모두 211 아미노산 잔기로 구성된 효소로 아미노 말단의 28 잔기가 signal peptide로 예측되었다. 또한 82%의 상동성을 보이는 B.
Xylanase의 구조유전자내에 NdeI 절단위치 서열이 있으므로 pET23a(+)의 NdeI과 XhoI 사이에 유전자를 도입하기 위해 4종류의 primers를 이용하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. Primers Ns-F (GTAGGTCATATGTTTAAGTTCAAGAAGAAAATGC)와 X-R (GGCCAGTCTCGAGTTACCACACTGTTACGTTAGAGC)에는 크로닝을 위한 NdeI과 XhoI 절단위치를 각각 도입하였고, Nm-R (TATACATCATATGTGCCCCCATC)과 Nm-F(GGGGGCACATATGATGTATACAC)는 구조유전자의 NdeI 절단위치 지역에 해당한다. 먼저 primer Nm-F와 X-R을 사용하여 증폭한 xylanase 유전자 하반부분을 NdeI과 XhoI으로 절단하여 pET23a(+)에 도입한 재조합 플라스미드를 제조한 후, Ns-F와 Nm-R을 사용하여 증폭한 xylanase 유전자 상반부분을 NdeI으로 절단하여 앞 단계에서 제조된 재조합 플라스미드의 NdeI 위치에 삽입함으로써 pEYX137을 제조하였다.
아미노산 잔기배열을 분석한 결과 xylanase는 glycosyl hydrolase family 11에 속하며 Paenibacillus의 xylanase와 85–89% 상동성을 보였다. Xylanase 유전자를 T7 promoter로 과잉발현한 결과 그 발현량이 높지 않았으며, 균체내ㆍ외에서 모두 효소활성이 관찰되었다. 재조합 대장균의 균체파쇄상등액을 사용하여 효소 반응특성을 조사한 결과 pH 5.
XynA에 의한 oat spelt xylan과 birchwood xylan 및 xylobiose, xylotriose, xylotetraose와 xylopentaose의 가수분해 산물을 TLC로 분석한 결과 xylobiose는 분해하지 못하였으나(결과 미제시), xylotriose 이상의 중합도를 갖는 올리고당은 분해하는 것으로 나타났으며 또한 xylopentaose가 xylotetraose보다는 더 잘 분해되는 양상을 보였다(Fig. 3). 그리고 xylan과 xylo 올리고당의 분해산물로 xylose가 가장 많이 관찰되었으며, xylotriose와 xylobiose뿐 아니라 이보다 중합도가 큰 올리고당이 생성된 것으로 보아 XynA는 endoxylanase로 판단되었다.
또한 기질에 따른 반응성을 조사한 결과 XynA는 carboxymethyl cellulose, locust bean gum과 같이 xylan이 아닌 섬유질계 물질을 분해하지 못하였고 para-nitrophenyl-β-xyloside나 para-nitrophenyl-β-glucoside도 분해하지 못하였다. 그리고 oat spelt xylan 대비 birchwood xylan의 분해능은 약 76% 정도 수준으로 나타났다.
3). 그리고 xylan과 xylo 올리고당의 분해산물로 xylose가 가장 많이 관찰되었으며, xylotriose와 xylobiose뿐 아니라 이보다 중합도가 큰 올리고당이 생성된 것으로 보아 XynA는 endoxylanase로 판단되었다. P.
따라서 효소활성이 높은 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액을 조효소액으로 사용하여 반응온도와 pH가 xylanase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과 Fig. 2A에 보인 바와 같이 60℃와 pH 5.5에서 최대활성을 보였으며 pH 3.5에서도 최대활성의 30% 이상의 활성을 나타냈다. 열안정성 조사를 위해 조효소액을 여러 온도에서 1시간 방치 후 잔존활성을 측정하였는데 40℃이하에서는 안정하였으나, 50℃에서는 약 50% 정도의 활성을 유지하였으며, 55℃ 이상에서는 급격히 실활되었다(Fig.
아미노산 잔기배열을 분석한 결과 xylanase는 glycosyl hydrolase family 11에 속하며 Paenibacillus의 xylanase와 85–89% 상동성을 보였다.
5에서도 최대활성의 30% 이상의 활성을 나타냈다. 열안정성 조사를 위해 조효소액을 여러 온도에서 1시간 방치 후 잔존활성을 측정하였는데 40℃이하에서는 안정하였으나, 50℃에서는 약 50% 정도의 활성을 유지하였으며, 55℃ 이상에서는 급격히 실활되었다(Fig. 2B). Paenibacillus sp.
이로부터 플라스미드를 분리하고 클로닝된 PCR 단편의 염기서열을 분석한 결과 유전체 분석에서 결정된 서열과 동일한 것으로 확인되었으며(Fig. 1), xynA의 개시코돈으로 예측되는 ATG가 연속해서 존재하였다. SD 서열로 예측되는 서열(GGGAGGT)과의 간격 및 Paenibacillus sp.
Xylanase 유전자를 T7 promoter로 과잉발현한 결과 그 발현량이 높지 않았으며, 균체내ㆍ외에서 모두 효소활성이 관찰되었다. 재조합 대장균의 균체파쇄상등액을 사용하여 효소 반응특성을 조사한 결과 pH 5.5와 60℃에서 최대 반응활성을 보였다. 한편 xylanase의 기질로 xylan과 xylooligosaccharides를 사용하였을 때 xylose와 xylotriose가 주된 최종 반응산물로 관찰되었으며 xylobiose는 분해하지 못하였으나 이보다 중합도가 큰 xylooligosaccharides는 분해하였다.
5와 60℃에서 최대 반응활성을 보였다. 한편 xylanase의 기질로 xylan과 xylooligosaccharides를 사용하였을 때 xylose와 xylotriose가 주된 최종 반응산물로 관찰되었으며 xylobiose는 분해하지 못하였으나 이보다 중합도가 큰 xylooligosaccharides는 분해하였다.
, 2008) 유래 GH11 xylanase의 아미노산 잔기와 비교할 때 뒤의 ATG가 개시코돈으로 판단되었다. 한편 xynA 구조유전자의 GC 함량은 48.7%로 나타났으며, 재조합 대장균에서 생산된 XynA는 균체내ㆍ외에서 모두 그 활성이 낮게 관찰되었다.
, 1996)의 mannanase 유전자가 모두 IPTG에 의해 과잉 발현된 것으로 알려졌다. 한편 과잉 발현되지는 않았지만 재조합 대장균에서 생성된 xylanase의 활성을 측정한 결과 균체 외 보다는 균체내에서 활성이 높았으며, BL21(DE3) 보다는 BL21(DE3) CodonPlus에서 xylanase 생산성이 높았다 (결과 미제시). 대장균의 희귀 tRNA를 보강한 CodonPlus 균주에서 외래 유전자 발현량이 증가하는 현상은 P.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	분류상 Xylanase는 어떤 효소에 속하는가?	따라서 xylanase는 glucanase 및 mannanase와 함께 재생가능한 식물자원인 반섬유소를 생물이 용이하게 대사할 수 있는 탄소원으로 전환시키기 위해 활용되고 있으며, 제빵, 펄프와 제지가공 및 사료첨가용 효소로 이용되고 있다(Subramaniyan and Prema, 2002). Xylanase는 대부분이 glycosyl hydrolase (GH) family 10과 11에 속하며, 일부 효소는 GH5, 8에 속하는 것으로 알려졌다(Gallardo et al., 2010; Cuyvers et al.
	xylan은 어떤 구조를 하고 있는가?	대부분의 육지식물은 cellulose, hemicellulose와 lignin으로 이루어져 있는데 이들중 hemicellulose의 주요 구성 성분으로 알려져 있는 xylan은 기본골격이 β-1,4 결합을 하고 있는 D-xylose로 구성되어 있고 이러한 xylose 잔기에 acetyl group, α-L-arabinofuranose와 4-O-methyl-α-D-glucuronopyranose 등이 측쇄로 연결되어 존재하고 있다(Thomson, 1993). 이를 분해하는데 여러 종류의 효소가 관여하며 그들 중 endo-β-1,4-xylanase (xylanase)와 β-xylosidase의 역할이 중요하다.
	hemicellulose의 주요 구성 성분으로 알려져 있는 xylan을 분해하기 위해 어떤 효소의 역할이 중요한가?	대부분의 육지식물은 cellulose, hemicellulose와 lignin으로 이루어져 있는데 이들중 hemicellulose의 주요 구성 성분으로 알려져 있는 xylan은 기본골격이 β-1,4 결합을 하고 있는 D-xylose로 구성되어 있고 이러한 xylose 잔기에 acetyl group, α-L-arabinofuranose와 4-O-methyl-α-D-glucuronopyranose 등이 측쇄로 연결되어 존재하고 있다(Thomson, 1993). 이를 분해하는데 여러 종류의 효소가 관여하며 그들 중 endo-β-1,4-xylanase (xylanase)와 β-xylosidase의 역할이 중요하다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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