3T3-L1 세포분화 중 지방축적 및 ROS 생성에 대한 잔가시 모자반 추출물의 효과 Effect of Sargassum micracanthum extract on Lipid Accumulation and Reactive Oxygen Species (ROS) Production during Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes원문보기
본 연구에서는 잔가시 모자반 추출물의 항비만 및 항산화 효과를 연구하기 위하여 3T3-L1 전지방세포에 분화 유도물질을 처리하여 분화 과정 중에 잔가시 모자반의 지방축적과 ROS 생성 억제 효과를 관찰하였다. 잔가시 모자반 추출물은 XTT assay에서 두 농도(10 및 100 ${\mu}g/mL$) 모두에서 세포 독성을 보이지 않았다. 지방세포 분화 중 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량을 비교한 결과, 잔가시 모자반 추출물을 처리한 지방세포의 경우 지방축적량과 ROS 생성량 모두 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 특히 잔가시 모자반 추출물을 처리함으로써 지방세포 분화와 관련된 전사인자인 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$ 발현을 유의적으로 감소시켰으며, ROS의 생성과 관련이 있는 주요 효소인 NOX4의 발현 또한 유의적으로 감소하였다. 이 결과를 통해 잔가시 모자반 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 축적 억제 효과와 더불어 ROS 생성 억제에 효과적으로 작용함을 확인하였다. 따라서 잔가시 모자반은 비만과 같이 대사증후군 관련 질환의 개선을 위한 천연물 기능성 소재로의 활용이 기대된다.
본 연구에서는 잔가시 모자반 추출물의 항비만 및 항산화 효과를 연구하기 위하여 3T3-L1 전지방세포에 분화 유도물질을 처리하여 분화 과정 중에 잔가시 모자반의 지방축적과 ROS 생성 억제 효과를 관찰하였다. 잔가시 모자반 추출물은 XTT assay에서 두 농도(10 및 100 ${\mu}g/mL$) 모두에서 세포 독성을 보이지 않았다. 지방세포 분화 중 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량을 비교한 결과, 잔가시 모자반 추출물을 처리한 지방세포의 경우 지방축적량과 ROS 생성량 모두 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 특히 잔가시 모자반 추출물을 처리함으로써 지방세포 분화와 관련된 전사인자인 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$ 발현을 유의적으로 감소시켰으며, ROS의 생성과 관련이 있는 주요 효소인 NOX4의 발현 또한 유의적으로 감소하였다. 이 결과를 통해 잔가시 모자반 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 축적 억제 효과와 더불어 ROS 생성 억제에 효과적으로 작용함을 확인하였다. 따라서 잔가시 모자반은 비만과 같이 대사증후군 관련 질환의 개선을 위한 천연물 기능성 소재로의 활용이 기대된다.
Obesity, a strong risk factor for the development of chronic diseases, is characterized by an increase in the number and size of adipocytes differentiated from precursor cells, preadipocytes. Recent research suggests that increased reactive oxygen species (ROS) production in 3T3-L1 adipocyte facilit...
Obesity, a strong risk factor for the development of chronic diseases, is characterized by an increase in the number and size of adipocytes differentiated from precursor cells, preadipocytes. Recent research suggests that increased reactive oxygen species (ROS) production in 3T3-L1 adipocyte facilitates adipocyte differentiation and fat accumulation. This study was to investigate whether reduced ROS production by Sargassum micracanthum extract (SME) could protect the development of obesity through inhibition of adipogenesis. 3T3-L1 preadipocytes were treated SME for up to 8 days following standard induction of differentiation. The extent of differentiation reflected by amount of lipid accumulation and ROS production was determined by Oil red O staining and nitroblue tetrazolium (NBT) assay. Treatment of SME significantly inhibited ROS production and adipocyte differentiation that is depend on down regulation of NADPH oxidase 4 (NOX4), a major ROS generator, and peroxisome proliferator-activated receptor gamma ($PPAR{\gamma}$) and CCAAT/enhancer-binding protein alpha ($C/EBP{\alpha}$), a key adipogenic transcription factor. These results indicate that SME can inhibit adipogenesis through a reduced ROS level that involves down-regulation of NOX4 expression or via modulation of adipogenic transcription factor.
Obesity, a strong risk factor for the development of chronic diseases, is characterized by an increase in the number and size of adipocytes differentiated from precursor cells, preadipocytes. Recent research suggests that increased reactive oxygen species (ROS) production in 3T3-L1 adipocyte facilitates adipocyte differentiation and fat accumulation. This study was to investigate whether reduced ROS production by Sargassum micracanthum extract (SME) could protect the development of obesity through inhibition of adipogenesis. 3T3-L1 preadipocytes were treated SME for up to 8 days following standard induction of differentiation. The extent of differentiation reflected by amount of lipid accumulation and ROS production was determined by Oil red O staining and nitroblue tetrazolium (NBT) assay. Treatment of SME significantly inhibited ROS production and adipocyte differentiation that is depend on down regulation of NADPH oxidase 4 (NOX4), a major ROS generator, and peroxisome proliferator-activated receptor gamma ($PPAR{\gamma}$) and CCAAT/enhancer-binding protein alpha ($C/EBP{\alpha}$), a key adipogenic transcription factor. These results indicate that SME can inhibit adipogenesis through a reduced ROS level that involves down-regulation of NOX4 expression or via modulation of adipogenic transcription factor.
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문제 정의
2%로 나타났다(23). 따라서 본 연구는 3T3-L1 지방세포에 잔가시 모자반 추출물을 처리하여 분화 단계에서의 지방 축적 억제와 활성산소종 생성량을 관찰하고 이와 관련 있는 전사인자들의 발현 정도를 측정하여 잔가시 모자반 추출물의 항비만, 항산화 활성도를 조사하였다.
본 연구에서는 잔가시 모자반 추출물의 항비만 및 항산화 효과를 연구하기 위하여 3T3-L1 전지방세포에 분화 유도물질을 처리하여 분화 과정 중에 잔가시 모자반의 지방축적과 ROS 생성 억제 효과를 관찰하였다. 잔가시 모자반 추출물은 XTT assay에서 두 농도(10 및 100 μg/mL) 모두에서 세포 독성을 보이지 않았다.
제안 방법
3T3-L1 전지방세포는 실험목적에 따라 60Ø, 24-well 및 96-well plate에 각각 1 x 106 seeding한 후, BS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 고농도 포도당 DMEM (89%)에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다.
NBT assay는 NBT 용액이 지방세포 내에 축적된 ROS과 반응하여 dark blue formazan을 생성하게 되며, 이를 용출하여 세포 내 ROS의 생성량을 알 수 있다. 3T3-L1 전지방세포에 분화 유도 물질을 처리하여 지방세포로 분화를 시킨 뒤 생성된 ROS 생성량을 측정하기 위하여 NBT assay를 이용하여 측정한 결과는 Fig. 3 (A)와 같다. 잔가시 모자반 추출물(SME)을 처리하지 않은 대조군에 비하여 잔가시 모자반 추출물을 10 및 100 μg/mL 처리한 군에서 ROS 생성량이 각각 18.
3T3-L1 지방세포 분화 과정 중, 잔가시 모자반 추출물에 의한 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량의 변화를 관찰하였다. 마우스 유래 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다.
3T3-L1에 대한 잔가시 모자반 추출물의 세포 독성평가는 XTT {2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide innersalt} assay kit를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포는 실험전날 1x106 cell 농도로 96-well plate에 seeding하고 시료 10 및 100 μg/mL를 처리하여 24 시간 동안 배양하였다.
그 후 -20℃에 보관 중인 XTT 및 PMS (N-Methylphenazonium methyl sulfate) reagent를 37℃에서 완전히 해동시킨 후, 1 mL의 XTT reagent와 20μL PMS reagent를 혼합하여 working solution을 준비하여 놓고, pipet을 이용하여 96-well medium 부피의 20% 되는 양 만큼 취하여 각각의 well에 조심스럽게 첨가하여 plate를 바닥에 붙인 상태로 가볍게 흔들면서 혼합하였다. CO2 incubator에서 4시간 동안 배양한 후, ELISA (VersaMax ELISA Microplate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale, USA)를 이용하여 450 nm 흡광도 값에서 690 nm의 흡광도 값을 뺀 결과 값으로 세포 독성을 계산하였다.
RT-PCR 산물은 2% 한천(agarose) 겔에서 전기영동 후 EtBr (ethidiumbromide)로 염색하여 UV에서 증폭된 DNA band를 확인하였다. DNA band는 Carestream MI SE 프로그램을 이용하여 band intensity로 수치화하여 나타내었다.
지방세포 분화에 영향을 미치는 주요 관련 유전자들의 발현 정도 변화를 검토하기 위하여 지방세포에 존재하는 total RNA를 추출한 후, 역전사중합효소(reverse transcriptase)를 사용하여 complementary DNA (cDNA)를 만들고 합성된 cDNA와 primer로 RT-PCR을 이용하여 유전자의 발현 정도를 측정하였다. RT-PCR 산물은 2% 한천(agarose) 겔에서 전기영동 후 EtBr (ethidiumbromide)로 염색하여 UV에서 증폭된 DNA band를 확인하였다. DNA band는 Carestream MI SE 프로그램을 이용하여 band intensity로 수치화하여 나타내었다.
따라서 잔가시 모자반 추출물의 항비만 및 항산화 활성을 평가하기 위한 처리 농도는 10 및 100 μg/mL로 결정하였다.
분화 과정에 따른 3T3-L1 세포 내 지방축적량을 측정하고자 각각의 시료를 처리하여 24-well에서 8일 동안 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후, 10% formalin 용액 500μL를 첨가하여 5분간 실온에서 방치한 뒤 제거하였다.
분화과정에 따른 지방세포의 ROS 생성량을 측정하기 위하여 먼저 24-well에 배양 및 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후 멸균된 PBS (Phosphate buffer saline, pH 7.4)를 이용하여 2회 세척, 0.2% NBT 용액 0.2 mL를 첨가하여 CO2 incubator안에서 90분간 반응시킨 뒤 100% acetic acid를 이용하여 이들 dark blue formazan을 모두 용출시켜 ELSIA를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이로부터 2일 후에, 지방세포 분화유도 물질(10 μg/mL insulin, 1 μM DEX, 0.5 mM IBMX)과 FBS (10%) 및 P/S (10%)를 함유한 DMEM으로 전지방세포를 지방세포로 분화유도 하였다.
지방세포 분화(day 0)시 DMEM에 시료를 각각 10 및 100 μg/mL로 처리하였고, 이때 잔가시 모자반 추출물의 효과를 관찰하기 위하여 negative control(음성 대조군)에는 아무것도 처리하지 않았으며, positive control(양성 대조군)에는 항산화제인 NAC (10 mM ≈ 1.63 mg/mL)를 처리하여 비교하였다.
지방세포 분화에 영향을 미치는 주요 관련 유전자들의 발현 정도 변화를 검토하기 위하여 지방세포에 존재하는 total RNA를 추출한 후, 역전사중합효소(reverse transcriptase)를 사용하여 complementary DNA (cDNA)를 만들고 합성된 cDNA와 primer로 RT-PCR을 이용하여 유전자의 발현 정도를 측정하였다. RT-PCR 산물은 2% 한천(agarose) 겔에서 전기영동 후 EtBr (ethidiumbromide)로 염색하여 UV에서 증폭된 DNA band를 확인하였다.
지방세포의 분화는 분화유도 물질을 처리한 후, 2일마다 지속적으로 10 μg/mL insulin, 1% P/S, 10% FBS가 함유된 배지에 각각의 시료를 처리한 후, 8일 동안 분화시키면서 지방축적량 및 ROS의 생성량을 관찰하였다.
대상 데이터
3T3-L1 세포배양 및 분화에 사용된 N-AcetylL-cysteine (NAC), insulin, Dexamethasone (DEX), 3-isobutyl1-methylxanthine (IBMX), nitroblue tetrazolium (NBT), Oil Red O(ORO), acetic acid, isopropanol은 Sigma (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), bovine serum (BS), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (P/S), phosphate-buffered saline (PBS) 및 trypsin-EDTA는 Gibco (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
3T3-L1 지방세포 분화 과정 중, 잔가시 모자반 추출물에 의한 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량의 변화를 관찰하였다. 마우스 유래 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, CL-173, Manassas, VA, USA)으로부터 분양 받아 사용하였다. 3T3-L1 전지방세포는 실험목적에 따라 60Ø, 24-well 및 96-well plate에 각각 1 x 106 seeding한 후, BS (10%) 및 P/S (1%)를 함유한 고농도 포도당 DMEM (89%)에서 100% confluence 될 때까지 배양하였다.
본 연구에 사용된 시료는 제주생물종다양성 연구소로부터 분양을 받아 3T3-L1 세포독성 및 지방세포 분화 실험에 사용하였다. 3T3-L1 세포배양 및 분화에 사용된 N-AcetylL-cysteine (NAC), insulin, Dexamethasone (DEX), 3-isobutyl1-methylxanthine (IBMX), nitroblue tetrazolium (NBT), Oil Red O(ORO), acetic acid, isopropanol은 Sigma (Sigma-Aldrich Co.
실험에 사용된 NAC는 대표적인 항산화제로 3T3-L1의 분화과정 중 처리하면 중성지방의 축적을 억제시키고, 또한 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자인 PPARγ와 C/EBPβ의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있어 양성 대조군으로 사용하였다(29).
데이터처리
Each value is the mean±standard deviation of the results from five different plates (n=5) and is representative of results from at least two different experiments. Statistical analysis was performed using the one-way ANOVA. (p<0.
모든 실험결과는 SAS package (release 9.2)를 이용하여 one-way ANOVA 분석 수행하였고 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
Cell viability was measured by XTT assay. The exponentially growing cells were plated into 96-well plates at a density of 1x106 cells/well in DMEM/BS medium and incubated for 24 h prior to treatment at 37°C in 5% CO2.
성능/효과
본 연구진에 의한 이전의 연구에서 49종의 해조류를 스크리닝 해 본 결과, 잔가시 모자반에 페놀성 화합물이 약 468.0 ± 22.7 ug/ g 시료가 함유되어 있어 조사한 타 해조류에 비해 높은 함량을 나타내었다.
실험에 사용된 NAC는 대표적인 항산화제로 3T3-L1의 분화과정 중 처리하면 중성지방의 축적을 억제시키고, 또한 지방세포의 분화를 조절하는 전사인자인 PPARγ와 C/EBPβ의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있어 양성 대조군으로 사용하였다(29). 이 결과를 통해 잔가시 모자반 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 생성 및 축적 억제효과가 큰 것으로 나타났다.
특히 잔가시 모자반 추출물을 처리함으로써 지방세포 분화와 관련된 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα 발현을 유의적으로 감소시켰으며, ROS의 생성과 관련이 있는 주요 효소인 NOX4의 발현 또한 유의적으로 감소하였다. 이 결과를 통해 잔가시 모자반 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 축적 억제 효과와 더불어 ROS 생성 억제에 효과적으로 작용함을 확인하였다. 따라서 잔가시 모자반은 비만과 같이 대사증후군 관련 질환의 개선을 위한 천연물 기능성 소재로의 활용이 기대된다.
이들 유전자의 발현은 지방세포의 분화정도를 측정할 수 있는 대표적인 전사인자들로 잔가시 모자반 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비하여 잔가시 모자반을 10 및 100 μg/mL 처리한 군에서 PPARγ의 발현량이 각각 16.9%와 73% 정도 감소하는 경향을 보였으며 C/EBPα의 발현을 살펴본 결과, Fig. 2 (B)와 (C) 각각 30.5%와 88.9% 정도 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
양성 대조군으로 사용된 NAC는 3T3-L1의 분화과정 중 ROS의 생성을 억제하며, 글루타치온(glutathione)의 전구체로써 세포 내 항산화 효소의 생성에 도움을 주는 것으로 보고되고 있다(26). 이상의 결과로 비추어 볼 때, 잔가시 모자반 추출물은 지방세포 분화과정 및 ROS의 생성을 억제하는 효능을 나타내었다. 한편, 본 연구는 잔가시모자반 추출물에 대한 항비만 활성의 기초자료로 향후 본 연구를 바탕으로 하여 항비만 활성의 작용기작 구명 및 주요 활성성분의 분리, 정제 연구 등이 이루어진다면 잔가시모자반을 이용한 천연 항비만 건강기능식품이 개발될 수 있을 것으로 예상된다.
잔가시 모자반 추출물(SME)을 처리하지 않은 대조군에 비하여 잔가시 모자반 추출물을 10 및 100 μg/mL 처리한 군에서 ROS 생성량이 각각 18.9% 와 42.9% 정도 감소하는 것으로 나타났다.
잔가시 모자반 추출물(SME)을 처리하지 않은 대조군에 비하여 잔가시 모자반을 10 및 100 μg/mL 처리한 군에서 지방축적량이 약 21.1 및 50.5%의 유의적 감소치를 나타내었다.
잔가시 모자반 추출물은 10 및 100 μg/mL의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았으며, 현미경 상에서의 morphology의 변화도 관찰되지 않았다.
잔가시 모자반 추출물은 XTT assay에서 두 농도(10 및 100 μg/mL) 모두에서 세포 독성을 보이지 않았다.
잔가시 모자반 추출물은 XTT assay에서 두 농도(10 및 100 μg/mL) 모두에서 세포 독성을 보이지 않았다. 지방세포 분화 중 세포 내 지방축적 및 ROS 생성량을 비교한 결과, 잔가시 모자반 추출물을 처리한 지방세포의 경우 지방축적량과 ROS 생성량 모두 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다. 특히 잔가시 모자반 추출물을 처리함으로써 지방세포 분화와 관련된 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα 발현을 유의적으로 감소시켰으며, ROS의 생성과 관련이 있는 주요 효소인 NOX4의 발현 또한 유의적으로 감소하였다.
지방세포의 분화 및 지방축적과 연관된 주요 전사인자로 알려진 peroxisome proliferatoractivated receptor gamma (PPARγ)와 CCAAT/enhancerbinding protein alpha (C/EBPα)의 발현에서도 Fig. 2 (B&C)에서 잔가시 모자반 추출물 처리군이 대조군에 비해서 각각 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
특히 잔가시 모자반 추출물을 처리함으로써 지방세포 분화와 관련된 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα 발현을 유의적으로 감소시켰으며, ROS의 생성과 관련이 있는 주요 효소인 NOX4의 발현 또한 유의적으로 감소하였다.
후속연구
이 결과를 통해 잔가시 모자반 추출물이 3T3-L1 지방세포 내 중성지방의 축적 억제 효과와 더불어 ROS 생성 억제에 효과적으로 작용함을 확인하였다. 따라서 잔가시 모자반은 비만과 같이 대사증후군 관련 질환의 개선을 위한 천연물 기능성 소재로의 활용이 기대된다.
이상의 결과로 비추어 볼 때, 잔가시 모자반 추출물은 지방세포 분화과정 및 ROS의 생성을 억제하는 효능을 나타내었다. 한편, 본 연구는 잔가시모자반 추출물에 대한 항비만 활성의 기초자료로 향후 본 연구를 바탕으로 하여 항비만 활성의 작용기작 구명 및 주요 활성성분의 분리, 정제 연구 등이 이루어진다면 잔가시모자반을 이용한 천연 항비만 건강기능식품이 개발될 수 있을 것으로 예상된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
FDA 승인을 받은 비만 치료의 대표적인 약물 2가지는 무엇인가?
현재 FDA (Food and Drug Administration)의 승인을 받은 비만 치료의 대표적인 약물인 시부트라민(sibutramine)과 오르리스타트(orlistat)의 경우 의약품으로 부작용이 존재할 수 있기 때문에 당뇨, 고혈압, 이상지방혈증 등을 포함한 위험인자가 있는 비만 환자가 아닌 일반적인 과체중을 포함한 비만 환자에게 이용되기 어렵다(10-13). 합성 항산화제의 경우도 경제적이며 효과가 좋다는 이점에도 불구하고 안전성의 문제로 사용이 제한되었다.
비만이란?
비만(obesity)은 음식물로부터 섭취한 에너지와 사용한 에너지의 불균형으로 인하여 체내에 중성지방이 축적되어 발생하는 질병으로 인슐린 저항성, 이상지혈증 등을 유발하는 심각한 질병이다(1,2). 지방의 축적은 지방세포(adipocytes)의 비대(hypertrophy)와 과형성(hyperplasia)을 초래하여 비만을 포함한 대사증후군(metabolic syndrome)의 발병에 관여하는 것으로 보고되고 있다(3,4).
해조류 중 갈조류에 함유된 기능성 다당류는 무엇인가?
해조류는 한천(agar) 및 후코이단(fucoidan)과 같은 고분자 다당체 이외에도 후코잔틴(fucoxanthine) 및 폴리페놀 (polyphenol)과 같은 저분자 화합물도 함유되어 있으며 이들 저분자 화합물들은 우수한 기능성을 가진 것으로 알려져 있다(18,19). 특히 갈조류의 경우 라미나란, 후코이단과 알긴산을 포함한 다당류와 함께 다양한 생리활성 물질들을 포함하여 면역증진, 항혈액응고, 혈중 콜레스테롤 감소, 항종양활성 효과 등이 보고되어 있다(20-22). 본 연구진에 의한 이전의 연구에서 49종의 해조류를 스크리닝 해 본 결과, 잔가시 모자반에 페놀성 화합물이 약 468.
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