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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 모유를 섭취하고 있는 생후 7일의 신생아로부터 분리 및 선발된 L. acidophilus를 분리 및 동정하고, 이들의 생리적 특성을 규명하여 상업적 이용가능성을 검토하고자 실시하였다.
- 본 연구는 모유를 섭취하고 있는 생후 7일째 신생아의 분변으로부터 L. acidophilus를 분리 및 동정하고, 이들의 생리적 특성을 규명하여 상업적 이용가능성을 검토하고자 실시 하였다. 이를 위해 pH 5.
가설 설정
- 1) Each data indicates the mean±SD of triplicate.
제안 방법
- 0.1～0.2% yeast extract가 첨가된 8% 탈지유에 MRS 액체배지에서 16～18시간 배양한 L. acidophilus를 1% 접종하여 각각 37℃에서 24 및 48시간 배양하였다. 배양액 2.
- 1차 선발된 14균주를 API kit(API50 CHL, bioMerieux, France)를 이용하여 당 발효 시험을 실시한 결과, 9종의 L. acidophilus(NB 201-NB 209)를 선발하였고, Bergey’s Manual에 제시된 22종의 당 이용성에 따라 Table 3과 같이 3개 group으로 분류하였다.
- 2차 동정을 위해 선발된 14종의 lactobacilli의 균체 지방산 조성을 확인하였으며, Rizzo 등(1987)의 방법을 일부 개선하여 다음과 같이 전처리하였다. MRS 액체배지에서 16～18시간 배양한 후 17,400×g로 10분간 원심분리하여 얻어진 균체를 멸균 증류수로 2회 세척한 후 동결건조하였으며, 동결 건조된 균체 20 mg을 15 mL 시험관에 넣은 뒤 45 g NaOH에 150 mL의 메탄올과 증류수를 각각 첨가하여 제조된 검화용액을 1 mL 첨가한 후 5～10초간 강하게 교반하였다.
- 37℃에서 약 3일간 배양한 후 MRS 한천배지 상에 나타난 특징적인 균락을 백금이로 채집하여 MRS 액체배지에 접종하고, 다시 배양한 후 얻어진 균주들을 4,350×g에서 15분간 원심분리(J2-21ME, JA-20, Beckmann, Germany)하여 상징액을 제거한 후 2.5 mL의 12% 탈지유(Difco Lab., USA)와 2.5 mL의 MRS 액체배지를 넣어 혼합한 다음 시험에 사용될 때까지－60℃에서 보관하였으며, 분리된 균주들은 해동하고 37℃에서 2회 계대배양하여 pH 2.5에서 생존율이 약 80% 이상이며, homo 젖산 발효를 하는 균주를 우선 선발하여 시험에 사용하였다.
- API kit의 사용법에 따라 접종액을 만들고 API 50 CHL 배지에 접종하여 strip을 만든 다음 37℃에서 48시간 배양한 후 색 변화를 관찰하였으며, 실험 결과는 Bergey's manual과 API LAB PLUS 프로그램(API50 CHL, bioMerieux, France)으로 비교 분석하였다.
- L. acidophilus의 우유내의 유단백질 분해 활성을 well diffusion 방법을 개선하여 다음과 같이 실험하였다. Metal boring cylinder(diameter: 8 mm)를 멸균하여 petri-dish에 세운 후 1.
- , USA)에 무균적으로 접종하고, 냉장 상태에서 실험실로 운송하였다. Lactobacilli의 분리를 위해 신생아의 분 시료를 37℃에서 24시간 배양한 후 lactobacilli를 선택적으로 분리하기 위해 dextrose를 maltose로 대체하고, 0.02% sodium azide가 첨가된 MRS 한천평판배지(Difco Lab., USA)에 백금이로 분산 도말하였다. 37℃에서 약 3일간 배양한 후 MRS 한천배지 상에 나타난 특징적인 균락을 백금이로 채집하여 MRS 액체배지에 접종하고, 다시 배양한 후 얻어진 균주들을 4,350×g에서 15분간 원심분리(J2-21ME, JA-20, Beckmann, Germany)하여 상징액을 제거한 후 2.
- MRS 액체배지에서 16～18시간 배양한 후 17,400×g로 10분간 원심분리하여 얻어진 균체를 멸균 증류수로 2회 세척한 후 동결건조하였으며, 동결 건조된 균체 20 mg을 15 mL 시험관에 넣은 뒤 45 g NaOH에 150 mL의 메탄올과 증류수를 각각 첨가하여 제조된 검화용액을 1 mL 첨가한 후 5～10초간 강하게 교반하였다.
- MRS 액체배지에서 37℃에서 24시간 배양된 L. acidophilus의 β-galactosidase의 활성은 Miller(1972)의 방법을 개선하여 시행하였다.
- Metal boring cylinder(diameter: 8 mm)를 멸균하여 petri-dish에 세운 후 1.6% 탈지유 한천배지를 부어 천공된 평판을 제조하고, cylinder를 제거한 후 well의 하단에 탈지유 한천배지를 30 μL씩 주입하여 봉입하였다.
- Table 1의 조건에 따라 측정된 젖산균의 균체 지방산의 조성비를 통해 Sherlock microbial identification system(SMIS, MIDI Inc., USA)을 이용하여 동정하였다.
- 당 이용성을 통해 확인된 9종의 L. acidophilus를 SMIS를 이용하여 지방산 조성을 분석하였다(Table 4). 대부분 시험 균주의 균체 지방산 조성 중에서 oleic acid(C18:1)의 함량이 40% 이상으로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 11,12-methylene hexadecanoic acid(C19:0 cyc) 및 palmitic acid(C16:0)의 비율이 주로 높았고, myristic acid(C14:0), palmitoleic acid(C16:1), straric acid(C18:0) 및 linoleic acid(C18:2)는 2～5%의 함량비를 나타내었다.
- 모유를 섭취하고 있는 생후 7일째 신생아의 분을 무균 면봉으로 채취하여 0.02% sodium azide(Sigma Chem. Co., USA)가 첨가된 pH 5.5의 MRS 액체배지(Difco Lab., USA)에 무균적으로 접종하고, 냉장 상태에서 실험실로 운송하였다. Lactobacilli의 분리를 위해 신생아의 분 시료를 37℃에서 24시간 배양한 후 lactobacilli를 선택적으로 분리하기 위해 dextrose를 maltose로 대체하고, 0.
-
2. 생화학적 특성 분석
분리된 균주들은 crystal violet 용액으로 분리 균주를 염색한 후 광학현미경(Leitz Ltd., Germany)을 이용하여 선발된 14종의 lactobacilli의 형태를 관찰하고, Gram 염색, 15℃와 45℃에서의 생장 여부와 catalase 생성 여부 및 37℃에서 24시간 배양 후 정치한 MRS 배지에서 hot loop 시험을 통한 gas 생성 시험을 실시하였다.
- 선발된 14종의 lactobacilli의 당 이용성을 측정하기 위해 API kit(API50 CHL, bioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당 발효실험을 하였다. 시험 균주를 MRS 액체배지에서 16시간 배양한 후 0.
- 선발된 L. acidophilus를 각각의 well에 150 μL씩 주입하고, agar 평판을 4℃에서 12시간 방치한 다음 37℃에서 24시간 배양한 후 투명환을 관찰하였다.
- 선발된 14종의 lactobacilli의 당 이용성을 측정하기 위해 API kit(API50 CHL, bioMerieux, France)를 이용하여 49종의 당 발효실험을 하였다. 시험 균주를 MRS 액체배지에서 16시간 배양한 후 0.1% peptone 용액으로 세척한 다음 적당한 비율로 희석하였다. API kit의 사용법에 따라 접종액을 만들고 API 50 CHL 배지에 접종하여 strip을 만든 다음 37℃에서 48시간 배양한 후 색 변화를 관찰하였으며, 실험 결과는 Bergey's manual과 API LAB PLUS 프로그램(API50 CHL, bioMerieux, France)으로 비교 분석하였다.
- 얻어진 배양액을 17,400×g로 10분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, Z 완충액(60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4, 5 mM β-mercaptoethanol, pH 7.0)으로 2회 세척하고, 1 mL의 현탁액으로 만들었다.
- 25 mL 첨가하고 서서히 회전하며 10분간 반응시킨 후 지방산을 추출하였다. 얻어진 용액의 하층 부분을 pasteur 피펫을 이용하여 제거하고, 여액에 0.25 N NaOH 용액 3 mL를 첨가한 뒤 5분간 반응시켜 유리지방산과 잔류 용매를 제거한 후 무수 Na2SO4(Junsei Chem. Co., Japan)를 첨가하여 수분을 제거하고 분석 시료로 하였다. 젖산균의 지방산 조성을 분석하기 위해서 HP G1512A auto sampler가 장착된 HP 5890 Series Ⅱ gas chromatography(GC, Agilent Co.
- acidophilus를 분리 및 동정하고, 이들의 생리적 특성을 규명하여 상업적 이용가능성을 검토하고자 실시 하였다. 이를 위해 pH 5.5에서 생장하는 lactobacilli 43균주를 분리하고, 그 중 pH 2.5에서 생존율이 약 80% 이상이고, homo 젖산 발효를 하는 lactobacilli 14균주를 1차 분리하였으며, 분리된 lactobacilli 14균주의 생화학적 특성, 당 이용성 및 균체 지방산 조성의 확인을 통해 동정된 L. acidophilus 9균주(NB 201～NB 209)를 시험 균주로 선발하였다. 내산성 실험 결과, 시험 균주를 pH 2.
- , Japan)를 첨가하여 수분을 제거하고 분석 시료로 하였다. 젖산균의 지방산 조성을 분석하기 위해서 HP G1512A auto sampler가 장착된 HP 5890 Series Ⅱ gas chromatography(GC, Agilent Co., USA)를 사용하였고, 분석 조건은 Table 1과 같다.
이론/모형
- Ahn 등(1999)의 방법에 따라 16～18시간 배양한 L. acidophilus를 1% bile extract(porcine; Sigma Chem. Co., USA)가 첨가된 MRS 액체배지에 1% 접종하여 37℃에서 2시간 배양한 후 생존율을 아래와 같은 식에 의해 측정하였다.
- 내산성 실험은 Hood와 Zottola(1988)의 방법에 따라 MRS 액체배지에서 16～18시간 배양한 L. acidophilus를 4,350×g로 15분간 원심분리하여 상징액을 제거한 후 0.8% NaCl로 희석하고, 10 N HCl를 이용하여 pH 2.0, 2.5 및 7.0으로 각각 조절된 0.05 M sodium phosphate 완충용액에 107 cfu/mL 수준이 되도록 젖산균주를 접종하고 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 생존율을 측정하였다.
성능/효과
- 2 및 3과 같다. 0.1% yeast extract가 첨가된 탈지유에서는 L. acidophilus NB 207, 208 및 209가 상대적으로 많은 양의 TCA 가용성 펩타이드 및 유리 아미노산을 생성하는 것으로 나타났다. 그리고 0.
- SMIS library와의 유사성을 확인한 결과, 9종의 L. acidophilus 중 4종은 L. acidophilus로서 80% 이상의 유사성을 나타내었으며, 나머지 5종은 L. acidophilus로서의 유사성은 50～60%대로 낮았으나, 다른 Lactobacilus로서의 유사성은 나타나지 않아 L. acidophilus로서 인정하였다.
- Well diffusion 방법을 응용하여 탈지유 한천 배지 상에서 선발된 L. acidophilus의 유단백질 분해 활력을 실험한 결과, Fig. 1에 제시된 바와 같이 모든 처리구에서 선발된 L. acidophilus가 분비한 extracellular protease에 의해 유단백질이 분해되어 투명환이 형성되었으며, 이를 통해 9종의 균주가 단백질 분해 활력이 있는 것으로 확인되었다.
- 0에서는 약 40～50%의 생존율을 보였다. 그 중 L. acidophilus NB 204는 내산성이 높아 pH 2.0에서도 71%의 높은 생존율을 보였다(모든 균주가 pH 2.5에서는 80%이상의 생존율을 보였으며, pH 2.0에서는 평균 55%의 생존율을 보였으나 L. acidophilus NB 204는 내산성이 높아 pH 2.0에서도 71%의 높은 생존율을 보였다).
- acidophilus NB 207, 208 및 209가 상대적으로 많은 양의 TCA 가용성 펩타이드 및 유리 아미노산을 생성하는 것으로 나타났다. 그리고 0.2% yeast extract를 첨가했을 때는 0.1% 첨가구에 비해 생성량이 증가하였으며, 그 중 L. acidophilus NB 204의 증가량이 높은 것으로 나타났다. 한편, 0.
- acidophilus 9균주(NB 201～NB 209)를 시험 균주로 선발하였다. 내산성 실험 결과, 시험 균주를 pH 2.5에서 2시간 배양하였을 때 모든 시험 균주가 80% 이상의 생존율을 나타내었으며, L. acidophilus NB 204는 pH 2.0에서도 71%의 생존율을 보여 내산성이 높은 것으로 나타났다. 담즙산 내성은 73%의 생존율을 보인 L.
- 0에서도 71%의 생존율을 보여 내산성이 높은 것으로 나타났다. 담즙산 내성은 73%의 생존율을 보인 L. acidophilus NB 206을 제외한 8균주가 bile extract가 1%의 농도로 첨가된 배지에서 생존율이 85% 이상으로 담즙산 내성이 매우 우수한 것으로 확인되었다. 또한 시험 균주 모두가 단백질 분해 활력이 있는 것으로 확인되었으며, yeast extract 0.
- acidophilus를 SMIS를 이용하여 지방산 조성을 분석하였다(Table 4). 대부분 시험 균주의 균체 지방산 조성 중에서 oleic acid(C18:1)의 함량이 40% 이상으로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 11,12-methylene hexadecanoic acid(C19:0 cyc) 및 palmitic acid(C16:0)의 비율이 주로 높았고, myristic acid(C14:0), palmitoleic acid(C16:1), straric acid(C18:0) 및 linoleic acid(C18:2)는 2～5%의 함량비를 나타내었다.
- acidophilus NB 206을 제외한 8균주가 bile extract가 1%의 농도로 첨가된 배지에서 생존율이 85% 이상으로 담즙산 내성이 매우 우수한 것으로 확인되었다. 또한 시험 균주 모두가 단백질 분해 활력이 있는 것으로 확인되었으며, yeast extract 0.1% 첨가한 것과 비교하여 0.2% 첨가 시 또는 24시간 배양과 비교하여 48시간 배양 시 TCA 가용성 펩타이드 및 유리 아미노산 생성량이 높았으며, 특히 L. acidophilus NB 204와 NB 209가 높은 생성량을 보였다(또는, yeast extract의 첨가량 및 배양시간이 증가함에 따라 TCA 가용성 펩타이드 및 유리 아미노산 생성량이 증가하였으며, 특히 L. acidophilus NB 204와 NB 209가 높은 생성량을 보였다). 시험 균주들의 β-galactosidase 활성은 1.
- 생후 7일째 신생아의 분변에서 pH 5.5에서 생장이 가능한 lactobacilli 43균주를 분리하였으며, 이중 pH 2.5에서 생존율이 약 85% 이상이면서 homo 젖산 발효를 하는 1균주를 1차 선발하여 생화학적 특성을 확인하였다.
- acidophilus를 bile extract가 1% 첨가된 배지에서 배양하며 담즙산 내성을 측정한 결과는 Table 6과 같다. 선발 균주들 중 생존율이 72.7%로 나타난 L. acidophilus NB 206을 제외한 대부분의 균주가 생존율이 85% 이상으로 매우 우수하여 상업적 이용 가능성이 높을 것으로 나타났다.
- 선발된 L. acidophilus의 β-galactosidase 활성을 실험한 결과, 시험 균주들의 β-galactosidase활성은 1.97～2.45 unit/mL 의 범위를 나타내어 발효유 제조 시 시험 균주에 의한 적절한 유당 대사가 가능할 것으로 사료된다.
- Marteau 등(1997)은 인공 위와 소장을 고안하여 음식과 함께 젖산균을 통과시키며 내산성을 실험한 결과, Bifidobacterum spp.와 L. acidophilus보다 내산성이 약한 것으로 알려진 L. bulgaricus와 S. thermophilus도 많은 수가 생존해서 십이지장에 도달하였으며, 이는 식후의 pH가 pH 3.8이상으로 유지될 때 통과하였기 때문으로 젖산균이 생존한 상태에서 소장에 도달하기 위해서는 초기 공복 기간이 중요하다고 강조하였다.
- acidophilus NB 204의 증가량이 높은 것으로 나타났다. 한편, 0.1% yeast extract를 첨가하고 배양시간을 달리하여 배양하였을 때 배양시간에 따라 TCA 가용성 펩타이드 및 유리 아미노산의 생성량이 증가하였으며, 특히 L. acidophilus NB 209의 함량이 크게 증가하는 것으로 나타났다.
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