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문제 정의
- 또한 넓패 메탄올 추출물은 caspase-8, caspase-9 및 caspase-3 활성을 농도와 시간에 따라 증가시켰으며, caspase 저해제인 z-VAD-fmk로 처리 시 넓패 메탄올 추출물에 의한 세포사멸이 유의적으로 감소되어 넓패 메탄올 추출물에 의한 HeLa 세포의 apoptosis 유도에 caspase가 중요한 역할을 하고 있음을 확인하였다. 따라서 넓패 메탄올 추출물은 HeLa 자궁암 세포의 apoptosis를 유도하는 것으로 나타나 넓패의 항암효과 가능성을 제시하였다.
- 본 연구에서는 넓패 메탄올 추출물의 농도별 처리가 인체 자궁암 세포 HeLa의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포독성 측정, Hoechst 33258 staining, flow cytometry 분석을 통하여 세포사멸을 확인하였다. 넓패 메탄올 추출물 처리 시 HeLa 세포에서 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제하였으며, 또한 넓패 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 핵을 응축하고 apoptotic bodies을 생성하였다.
- 이에 본 연구에서는 넓패 추출물을 암 예방 치료제로 사용하기 위한 기초자료를 제공하기 위하여 넓패 추출물이 HeLa 암세포에 미치는 영향을 추출물 처리농도에 따라 세포의 사멸에 미치는 영향을 세포독성측정, 핵 염색법, flow cytometry 분석을 통하여 확인하였고, 세포사멸 기전과 관련된 PARP, caspase-8, caspase-9 및 caspase-3의 단백질 발현을 western blot을 통해 확인하였다.
제안 방법
- 24시간이 지난 후 EZ-Cytox 시약 10 μL를 넣고 4시간 동안 배양한 후 microplate reader(Benchmark Plus, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 대조군에 대한 생존율로 나타내었다.
- 24시간이 지난 후, 넓패 추출물을 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 well에 처리하여 24시간 배양하였다.
- HeLa 자궁암 세포를 최종농도 2×105 cells/mL가 되도록 희석하여 100 mm dish에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, 50, 100, 200 μg/mL의 넓패 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양 또는 200 μg/mL의 추출물을 0, 2, 4, 8, 16, 24시간 동안 처리하여 배양하였다.
- HeLa 자궁암 세포를 최종농도 2×105 cells/mL가 되도록 희석하여 6 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, 넓패 추출물을 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 well에 처리하여 24시간 배양하였다.
- 3에 나타낸 바와 같이 caspase-3에 의해 분할되어지며, apoptosis의 특징적인 marker이면서 nuclear enzyme인 PARP가 분할되는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 넓패 메탄올 추출물에 의해 일어난 apoptosis가 caspase cascade와 관련되어 있는지 western blot을 통해 확인하였다. Fig.
- 그런 다음 400 μL의 binding buffer를 첨가하여 flow cytometry(Cytomics FC500, Beckman, Miami, FL, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 그런 다음, 200 μL의 Hoechst 33258(1 μg/mL)을 첨가하여 실온에서 15분 동안 염색한 후 다시 PBS로 세척하여 형광현미경(ECLIPSE TE2000-E, Nikon, Tokyo, Japan)으로 세포를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 넓패 메탄올 추출물의 농도별 처리가 인체 자궁암 세포 HeLa의 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 세포독성 측정, Hoechst 33258 staining, flow cytometry 분석을 통하여 세포사멸을 확인하였다. 넓패 메탄올 추출물 처리 시 HeLa 세포에서 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제하였으며, 또한 넓패 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 핵을 응축하고 apoptotic bodies을 생성하였다. 유세포 분석을 통하여 apoptosis를 측정한 결과, 넓패 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 apoptotic 세포가 증가하였다.
- 넓패 메탄올 추출물에 의한 HeLa cell의 세포증식 억제효과가 apoptosis에 의한 것인지를 확인하기 위하여 Hoechst 33258 염색을 통한 핵의 형태 변화(Fig. 1B) 및 annexin-V FITC와 PI double staining을 통한 flow cytometric 분석(Fig. 2)을 통해 apoptosis를 확인하였다. Fig.
- 넓패 추출물에 의한 HeLa 자궁암 세포의 사멸이 caspase에 의존하여 일어나는지를 확인하기 위해 z-VAD-fmk(R& D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 확인하였다.
- 이는 넓패 메탄올 추출물 처리에 의한 HeLa cells의 apoptosis 유도에 caspase의 활성화가 연관되어 있음을 보여주는 결과이다. 또한 넓패 메탄올 추출물에 의한 세포사멸이 caspase-dependent pathway를 통하여 일어나는지 general caspase inhibitor인 z-VAD-fmk를 투여하여 넓패 메탄올 추출물에 의한 HeLa cells의 세포사멸이 억제되는지 세포생존율을 측정하여 확인하였다. 그 결과 넓패 메탄올 추출물 처리 전에 25 μM의 z-VAD-fmk를 1시간 전 처리한 군은 넓패 메탄올 추출물을 단독으로 처리한 군과 비교하여 HeLa cells의 세포생존율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다(p<0.
- 먼저 넓패 메탄올 추출물의 HeLa cell에 대한 세포증식 억제효과를 조사하기 위하여 수용성 tetrazolium salt의 하나인 WST-1을 사용하여 WST-1의 환원에 의해 생성되는 formazan의 흡광도로 측정하였다. HeLa cell에 넓패 메탄올 추출물을 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간이 지난 후 확인 결과 넓패 메탄올 추출물의 HeLa cell에 대한 세포증식 억제효과는 100 μg/mL에서 10.
- 먼저, 자궁암 세포를 최종농도 1×105 cells/mL가 되도록 96 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, 넓패 추출물(ISE)을 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 첨가하여 배양하였다.
- 그런 다음 membrane을 5% skim milk로 실온에서 1시간 동안 blocking하고 1차 antibody를 처리하여 4℃에서 하루 밤 동안 반응시킨 다음, TBS-T buffer로 10분간 3번 세척하고 2차 antibody를 처리하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBS-T buffer로 10분간 3번 세척하고 enhanced chemiluminescence detection system(Amersham Pharmacia, Bucks, UK)를 사용하여 특정 단백질의 발현을 분석하였다.
- 세포독성은 EZ-Cytox cell viability assay kit(DAEIL lab, Seoul, Korea)를 사용하여, 제조사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하였다. 먼저, 자궁암 세포를 최종농도 1×105 cells/mL가 되도록 96 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 다음, 넓패 추출물(ISE)을 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 첨가하여 배양하였다.
- 세포사멸은 MEBCYTO apoptosis kit(MBL International, Nagoya, Japan)를 사용하여, 제조사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하였다. HeLa 자궁암 세포를 최종농도 2×105 cells/mL가 되도록 희석하여 6 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- PARP는 DNA 복구에 관여하는 단백질로서 핵 안에 존재하며, apoptosis 과정 중 caspaspe-3에 의해 116 kDa의 단백질이 89 kDa으로 절단되는 특징이 있다(4). 이에 넓패 메탄올 추출물에 의해 PARP 단백질이 절단되는지를 western blotting을 통해 관찰하였다. 그 결과 Fig.
대상 데이터
- 1차 antibody(caspase-3, caspase-8, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서, β-tubulin은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)는 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 1차 antibody(caspase-3, caspase-8, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서, β-tubulin은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)는 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 2차 antibody anti-mouse IgG HRP-conjugated와 anti-rabbit IgG HRP-conjugated antibody는 Zymed(San Francisco, CA, USA)와 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 각각 구입하였다.
- 본 실험에서 사용한 넓패 메탄올 추출물(분양번호: AP038)은 제주유용생물자원추출물은행에서 분양받아 사용하였다. 1차 antibody(caspase-3, caspase-8, cleaved caspase-3, cleaved caspase-8, cleaved caspase-9)는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)에서, β-tubulin은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)는 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)에서 구입하였다.
- 본 실험에서 사용한 인체 자궁암세포주 HeLa는 한국세포주은행(KCLB, Seoul)에서 분양받아 10% fetal bovine serum(FBS; Hyclone, Logan, UT, USA)와 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 RPMI-1640배지(Invitrogen)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Significant differences were compared with the control at #p<0.01 and the ISE alone at *p<0.05 using the Student's t-test.
- Significant differences were compared with the control at *p<0.01 and **p<0.001 using the Student's t-test.
- Significant differences were compared with the control at *p<0.01 using the Student's t-test.
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 대조군과 실험군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's ttest를 이용하여, p<0.05일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
이론/모형
- (B) Cells were treated with 200 μg/mL of ISE for the indicated times. Cells were harvested and samples were prepared for analysis of the caspase activation using western blot analysis. β-Tubulin was used as a loading control
- (B) Cells were treated with 200 μg/mL of ISE for the indicated times. Cells were harvested and samples were prepared for analysis of the cleavage of PARP using western blot analysis. β-Tubulin was used as a loading control
성능/효과
- 그러므로 넓패 메탄올 추출물에 의해 일어난 apoptosis가 caspase cascade와 관련되어 있는지 western blot을 통해 확인하였다. Fig. 4에서 나타난 바와 같이 caspase-8, caspase-3의 protein levels는 넓패 추출물 처리 농도와 시간에 따라 감소되었으며, 활성화된 cleavead caspase-8, caspase-9, caspase-3의 protein levels는 넓패 추출물 처리 농도와 시간에 따라 증가하는 것을 확인하였다. 이는 넓패 메탄올 추출물 처리에 의한 HeLa cells의 apoptosis 유도에 caspase의 활성화가 연관되어 있음을 보여주는 결과이다.
- HeLa cell에 넓패 메탄올 추출물을 25, 50, 100, 150, 200 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간이 지난 후 확인 결과 넓패 메탄올 추출물의 HeLa cell에 대한 세포증식 억제효과는 100 μg/mL에서 10.42%, 150 μg/mL에서 33.12%, 200 μg/mL에서 41.96%의 억제효과가 농도 의존적으로 나타났다(Fig. 1A).
- 이에 넓패 메탄올 추출물에 의해 PARP 단백질이 절단되는지를 western blotting을 통해 관찰하였다. 그 결과 Fig. 3에서 보는바와 같이 넓패 메탄올 추출물 처리 시 농도가 증가하거나 또는 시간이 지남에 따라 89 kDa의 밴드가 증가하였다. 이는 세포독성과 핵의 형태 변화 및 apoptosis 분석과 일치하는 결과를 보여준다.
- 그 결과 넓패 메탄올 추출물 처리 전에 25 μM의 z-VAD-fmk를 1시간 전 처리한 군은 넓패 메탄올 추출물을 단독으로 처리한 군과 비교하여 HeLa cells의 세포생존율이 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다(p<0.05)(Fig. 5).
- Western blot을 통해 PARP 단백질의 절단 현상을 분석한 결과, 넓패 메탄올 추출물의 처리 농도와 시간에 따라 PARP 단백질의 절단 현상이 증가하였다. 또한 넓패 메탄올 추출물은 caspase-8, caspase-9 및 caspase-3 활성을 농도와 시간에 따라 증가시켰으며, caspase 저해제인 z-VAD-fmk로 처리 시 넓패 메탄올 추출물에 의한 세포사멸이 유의적으로 감소되어 넓패 메탄올 추출물에 의한 HeLa 세포의 apoptosis 유도에 caspase가 중요한 역할을 하고 있음을 확인하였다. 따라서 넓패 메탄올 추출물은 HeLa 자궁암 세포의 apoptosis를 유도하는 것으로 나타나 넓패의 항암효과 가능성을 제시하였다.
- 또한 유세포 분석을 통하여 apoptotic 세포를 정량적으로 분석한 결과, 넓패 메탄올 추출물을 처리하지 않은 대조군의 apoptotic 세포는 5.30%였으나, 넓패 메탄올 추출물을 처리 시 농도가 증가함에 따라 유의적으로 apoptotic 세포가 증가하였으며(p<0.01), 100 μg/mL에서 13.60%, 200 μg/mL에서 34.55%의 수치를 나타내었다(Fig. 2).
- 넓패 메탄올 추출물 처리 시 HeLa 세포에서 농도 의존적으로 세포의 증식을 억제하였으며, 또한 넓패 메탄올 추출물은 농도 의존적으로 핵을 응축하고 apoptotic bodies을 생성하였다. 유세포 분석을 통하여 apoptosis를 측정한 결과, 넓패 메탄올 추출물의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 apoptotic 세포가 증가하였다. Western blot을 통해 PARP 단백질의 절단 현상을 분석한 결과, 넓패 메탄올 추출물의 처리 농도와 시간에 따라 PARP 단백질의 절단 현상이 증가하였다.
- 이는 세포독성과 핵의 형태 변화 및 apoptosis 분석과 일치하는 결과를 보여준다. 이러한 결과들은 넓패 메탄올 추출물에 의한 HeLa 세포의 사멸이 apoptosis 유도와 연관이 있음을 나타낸다.
후속연구
- , fucoxanthin) 등과 같은 다양한 생리활성 및 항암효과를 나타내는 성분 등이 들어있으며(17), 넓패와 같은 패과인 패(Ishige okamurae)에서도 phloroglucinol, dieckol, diphlorethohydroxycarmalol, fucoxanthin이 들어있어 항산화 및 항암효과를 나타낸다고 보고되었다(5,18). 본 실험에서 넓패 메탄올 추출물의 암세포 증식억제효과는 갈조류에 함유되어 있는 다양한 생리활성물질들과 연관성이 있을 것으로 생각된다.
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