우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 적조 및 마비성 패독을 일으켜 문제시되고 있는 유독성 와편모류인 A. catenella 를 살조시키는 해양미생물 Pseudoalteromonas sp. NH-12를 마산만의 적조발생 해역에서 분리, 동정하고 그 특성과 살조능에 대해 연구함으로써 보다 환경 친화적인 적조 구제 기술개발의 기초 자료를 제공하고자 하였다. 적조발생 해역인 마산만의 해수에서 분리한 38개의 해양미생물 균주 중 4종의 미생물이 A. catenella 에 대해 살조능을 나타내었으며, 이중 살조능이 가장 우수한 NH-12 균주를 선별하였다. 본 균주는 API kits 및 16S rRNA gene 염기서열을 분석하여 계통분류를 행한 결과 Pseudoalteromonas 속으로 분류되었으며, 최적 배양조건은 $25^{\circ}C$, pH 8.0, 3.0% NaCl 농도였다. Pseudoalteromonas sp. NH-12의 성장 단계별 살조능은 대수증식기 후기, 정지기, 대수증식기 중기, 유도기 순으로 높게 나타났다. 살조물질은 대수증식기 중기 이후에 활발히 생산되기 시작하여 대수증식기 후기에 가장 고농도로 축적되는 것으로 판단된다. 2조 배양계를 이용한 살조 유형 조사에서 Pseudoalteromonas sp. NH-12는 격리된 상태에서도 A. catenella 를 살조시켜 '직접 공격형'이 아니라 세포외로 물질을 분비하여 살조시키는 '살조인자 분비형'으로 확인되었다. 또한 NH-12 균주 배양여과액을 5% 첨가하였을 때 36시간 후에 A. catenella 는 100% 살조되었고, 10%를 첨가한 경우 24시간 후에 99% 이상 살조되었다.
우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 적조 및 마비성 패독을 일으켜 문제시되고 있는 유독성 와편모류인 A. catenella 를 살조시키는 해양미생물 Pseudoalteromonas sp. NH-12를 마산만의 적조발생 해역에서 분리, 동정하고 그 특성과 살조능에 대해 연구함으로써 보다 환경 친화적인 적조 구제 기술개발의 기초 자료를 제공하고자 하였다. 적조발생 해역인 마산만의 해수에서 분리한 38개의 해양미생물 균주 중 4종의 미생물이 A. catenella 에 대해 살조능을 나타내었으며, 이중 살조능이 가장 우수한 NH-12 균주를 선별하였다. 본 균주는 API kits 및 16S rRNA gene 염기서열을 분석하여 계통분류를 행한 결과 Pseudoalteromonas 속으로 분류되었으며, 최적 배양조건은 $25^{\circ}C$, pH 8.0, 3.0% NaCl 농도였다. Pseudoalteromonas sp. NH-12의 성장 단계별 살조능은 대수증식기 후기, 정지기, 대수증식기 중기, 유도기 순으로 높게 나타났다. 살조물질은 대수증식기 중기 이후에 활발히 생산되기 시작하여 대수증식기 후기에 가장 고농도로 축적되는 것으로 판단된다. 2조 배양계를 이용한 살조 유형 조사에서 Pseudoalteromonas sp. NH-12는 격리된 상태에서도 A. catenella 를 살조시켜 '직접 공격형'이 아니라 세포외로 물질을 분비하여 살조시키는 '살조인자 분비형'으로 확인되었다. 또한 NH-12 균주 배양여과액을 5% 첨가하였을 때 36시간 후에 A. catenella 는 100% 살조되었고, 10%를 첨가한 경우 24시간 후에 99% 이상 살조되었다.
BACKGROUND: The aim of this study was to isolate and identify algicidal bacterium that tends to kill the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella, and to determine the algicidal activity. METHODS AND RESULTS: Among of four algicidal bacteria isolated in this study, NH-12 isolate was the strongest ...
BACKGROUND: The aim of this study was to isolate and identify algicidal bacterium that tends to kill the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella, and to determine the algicidal activity. METHODS AND RESULTS: Among of four algicidal bacteria isolated in this study, NH-12 isolate was the strongest algicidal activity against A. catenella. NH-12 isolate was identified on the basis of biochemical characteristics and analysis of 16S rRNA gene sequences. The isolate showed 97.67% homology with Pseudoalteromonas prydzensis ACAM $620^T$ (U85855), and was designated Pseudoalteromonas sp. NH-12. The optimal culture conditions of this isolate were $25^{\circ}C$, initial pH 8.0, and 3.0% (w/v) NaCl concentration. The algicidal activity of NH-12 was significantly increased to maximum value in the late of logarithmic phase of bacterial culture. As a result of 'cell culture insert' experiment, NH-12 is assumed to produce secondary metabolites, as an indirect attacker. When 10% culture filtrate of NH-12 was applied to A. catenella, over 99% of algal cells were destroyed within 24 h. In addition, the killing effects were increased in dose and time dependent manners. CONCLUSION(S): Taken together, our results suggest that Pseudoalteromonas sp. NH-12 could be a candidate for controlling of toxic algal blooms.
BACKGROUND: The aim of this study was to isolate and identify algicidal bacterium that tends to kill the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella, and to determine the algicidal activity. METHODS AND RESULTS: Among of four algicidal bacteria isolated in this study, NH-12 isolate was the strongest algicidal activity against A. catenella. NH-12 isolate was identified on the basis of biochemical characteristics and analysis of 16S rRNA gene sequences. The isolate showed 97.67% homology with Pseudoalteromonas prydzensis ACAM $620^T$ (U85855), and was designated Pseudoalteromonas sp. NH-12. The optimal culture conditions of this isolate were $25^{\circ}C$, initial pH 8.0, and 3.0% (w/v) NaCl concentration. The algicidal activity of NH-12 was significantly increased to maximum value in the late of logarithmic phase of bacterial culture. As a result of 'cell culture insert' experiment, NH-12 is assumed to produce secondary metabolites, as an indirect attacker. When 10% culture filtrate of NH-12 was applied to A. catenella, over 99% of algal cells were destroyed within 24 h. In addition, the killing effects were increased in dose and time dependent manners. CONCLUSION(S): Taken together, our results suggest that Pseudoalteromonas sp. NH-12 could be a candidate for controlling of toxic algal blooms.
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문제 정의
NH-12 균주가 생산하는 살조물질의 농도에 따른 살조능을 알아보기 위해, 균주 배양여과액의 첨가 농도에 따른 살조능을 조사하였다. 먼저 PPES-Ⅱ 액체배지에서 최적조건(25℃, pH 8.
catenella를 살조시키는 해양미생물 Pseudoalteromonas sp. NH-12를 마산만의 적조발생 해역에서 분리, 동정하고 그 특성과 살조 능에 대해 연구함으로써 보다 환경 친화적인 적조 구제 기술 개발의 기초 자료를 제공하고자 하였다. 적조발생 해역인 마산만의 해수에서 분리한 38개의 해양미생물 균주 중 4종의 미생물이 A.
이에 본 연구에서는 해양환경에서 서식하고 있는 해양미생물을 이용하여 해양생태계에 미치는 영향을 최소한으로 하면서 우리나라 연안에서 적조 및 마비성 패독을 일으켜 문제 시되고 있는 유독성 적조생물인 A. catenella에 대한 살조 효과를 밝혀 적조 구제법에 대한 기초 연구 자료를 마련하고자 한다.
제안 방법
2 μL pore size의 polycarbonate membrane filter로 여과하였다. A. catenella 배양액(8.0 x 103 cells/mL)에 균주 배양여과액을 각각 1, 3, 5 및 10%가 되도록 접종한 후 20℃에서 배양하며 매 6시간마다 살조능을 측정하였다. 배양액을 첨가하지 않고 계속 배양한 것을 control로 하였으며, 이 때 control에는 배양여과액 대신에 동량의 신선한 PPES-Ⅱ 액체배지를 첨가하였으며, 3회 반복 실험을 통하여 결과를 산출하였다.
catenella에 살조미생물 Pseudoalteromonas sp. NH-12의 세포배양액을 10%가 되게 접종하였을 때 살조되는 과정을 광학현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 3). 전형적으로 4개 혹은 8개의 세포로 chain을 형성하는 A.
이때 forward primer의 5'에는 제한효소 EcoRI의 인식 부위를, reverse primer의 5'에는 BamHI의 인식부위를 첨가하였다. PCR 반응은 AccuPower PCR Premix (Bioneer)를 사용하여 Minicycler (MJ Research, USA)로 실시하였다. 먼저 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분, 61℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30회 반복하여 DNA를 증폭시키고, 마지막으로 72℃에서 5분간 extension시켜 PCR 반응을 종결시켰다.
분리한 살조미생물 균주 중 가장 살조능이 우수한 NH-12균주의 분류학적 위치를 검토하기 위하여 MacFaddin (1980)과 Gerhardt 등(1981)의 방법을 참고하여 형태 및 배양학적 특성을 파악하고, 생리 및 생화학적 특성은 API 20NE와 API ZYM kits (Biomerieux, France)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 apiwebTM database (http://apiweb.biomerieux.com)를 참조하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하여 속 level까지 동정하였다. 또한 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene을 이용한 염기서열 분석을 행하였다(Dunbar et al.
그 중 가장 뛰어난 살조능을 보이는 NH-12균주를 선정하여 배양학적, 형태학적 특성 및 API kits(API 20NE와 ZYM)를 이용한 생화학적 특성을 조사하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하였다.
com)를 참조하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하여 속 level까지 동정하였다. 또한 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene을 이용한 염기서열 분석을 행하였다(Dunbar et al., 2000). 선별된 NH-12 균주를 PPES-II 배지에서 18시간 배양한 후, AccuPrepTM Genomic DNA extraction kit (Bioneer)를 사용하여 total genomic DNA를 추출하여 template로 사용하였다.
이때 cell culture insert 내부에 NH-12 균 주의 균체를 첨가한 well을 positive control로 하였으며, cell culture insert 내부에 NH-12 균주의 균체를 첨가하는 대신에 PPES-Ⅱ 액체배지만 첨가한 well을 negative control로 하였다. 모든 well은 A. catenella의 최적 배양조건에서 배양하여 48시간 후에 살조 유무를 관찰하여 살조 유형을 결정하였다. 미생물 오염 여부는 cell culture insert 내부의 배양액을 취해 DAPI (4‘,6-diamidino-2-phenylindole) (Sigma) 염색(Porter and Freig, 1980)후, 형광현미경(Olympus BX40, Japan)하에서 직접 관찰하였다.
미생물 오염 여부는 cell culture insert 내부의 배양액을 취해 DAPI (4‘,6-diamidino-2-phenylindole) (Sigma) 염색(Porter and Freig, 1980)후, 형광현미경(Olympus BX40, Japan)하에서 직접 관찰하였다.
0 x 103 cells/mL)에 균주 배양여과액을 각각 1, 3, 5 및 10%가 되도록 접종한 후 20℃에서 배양하며 매 6시간마다 살조능을 측정하였다. 배양액을 첨가하지 않고 계속 배양한 것을 control로 하였으며, 이 때 control에는 배양여과액 대신에 동량의 신선한 PPES-Ⅱ 액체배지를 첨가하였으며, 3회 반복 실험을 통하여 결과를 산출하였다.
분리한 살조미생물 균주 중 가장 살조능이 우수한 NH-12균주의 분류학적 위치를 검토하기 위하여 MacFaddin (1980)과 Gerhardt 등(1981)의 방법을 참고하여 형태 및 배양학적 특성을 파악하고, 생리 및 생화학적 특성은 API 20NE와 API ZYM kits (Biomerieux, France)를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 apiwebTM database (http://apiweb.
이 때 control에는 균주 배양액 대신 동량의 PPES-II 배지를 넣어 주었다. 살조능은 A. catenella의 생존상태를 광학현미경하에서 관찰하여 48시간 후에 살아있는 A. catenella 세포수를 counting하는 bioassay법으로 측정하였으며 다음과 같이 구하였다: Algicidal activity (%) = {1 - (시료를 첨가한 test tube의 세포수/control의 세포 수) X 100}.
살조미생물 NH-12 균주의 A. catenella에 대한 살조유형을 조사하기 위하여 24 well microplate에 pore size 0.2 μL의 cell culture insert (FALCON, USA)를 삽입한 2조배양계를 이용하였다.
본 실험에서 해수 시료는 2010년 4월 마산만의 부도 내측 해역의 적조 발생해역에서 표층해수를 Niskin 개량형 채수기인 MB 채수기를 이용하여 광구병(180℃에서 2시간 건열 멸균)으로 무균적으로 채수하였으며, 채수된 시료는 ice-box에 보관하여 3시간 이내에 연구실로 옮겨 실험하였다. 살조미생물을 분리하기 위해 해수 시료를 십진희석법으로 희석하여 PPES-Ⅱ(yeast extract 1 g, proteose peptone 1 g, polypeptone 2 g, soytone 1 g, 0.1% ferric citrate 10 mL, seawater 1 L, initial pH 7.6) 배지(Taga, 1968)에 평판도말법으로 도말하여 20℃에서 7일간 배양 후, 형성된 특징적인 형태의 colony를 모두 선별하여 순수분리 하였다. 이들 분리균주들의 A.
살조미생물 NH-12 균주의 성장단계별 살조능
살조미생물의 성장단계에 따른 살조능을 알아보기 위해 NH-12 균주를 PPES-Ⅱ 액체배지에 접종하여 최적 조건(25℃, initial pH 8.0, 3.0% NaCl)에서 39시간 배양하면 서 균의 증식에 따른 살조능을 조사하였다. 즉, 대수증식기로 배양한 A.
, 2000). 선별된 NH-12 균주를 PPES-II 배지에서 18시간 배양한 후, AccuPrepTM Genomic DNA extraction kit (Bioneer)를 사용하여 total genomic DNA를 추출하여 template로 사용하였다. 16S rRNA 유전자의 증폭에 이용된 primer쌍은 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'- GTGGATCCGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다.
이 후 antibiotic complex (gentamycin, streptomycin, cephalothin: each 100 μg/mL)에 노출시켜 3시간 정도 배양하여 세균과 곰팡이 등을 제거한 후, 다시 항생제를 첨가하지 않은 새로운 f/2-Si 배지에서 3회 계대 배양하였다.
이들 분리균주들의 A. catenella에 대한 살조능(algicidal activity)을 알아보기 위해 f/2-Si 배지를 포함한 24 well microplate에 전 배양한 A. catenella 배양액(8.0 X 103 cells/mL) 0.9 mL씩을 각각 분주하고, PPES-Ⅱ 액체배지에서 전배양한 분리균주들의 배양액(103-104 cells/mL) 100 μL를 접종하여 살조능을 가지는 균주들을 선별하였다.
PPES-Ⅱ 액체배지에서 배양하여 원심분리 (3,000×g, 10 min)한 NH-12의 균체(104cells)를 멸균해수로 희석하여 cell culture insert 외부에 1 mL를 넣은 것을 test well로 하였다. 이때 cell culture insert 내부에 NH-12 균 주의 균체를 첨가한 well을 positive control로 하였으며, cell culture insert 내부에 NH-12 균주의 균체를 첨가하는 대신에 PPES-Ⅱ 액체배지만 첨가한 well을 negative control로 하였다. 모든 well은 A.
또한 D-Glucose, D-Maltose, Melibiose 및 Pyruvate를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용하였다(Table 1). 이상의 결과, 본 균주는 Pseudoalteromonas 속과 가장 유사하였으며, 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene 염기서열(1,409 bp)을 분석하여, NCBI GenBank와 RDP(Ribosomal Database Project)에 등록된 Pseudoalteromonas 속 균주들과 유전자간의 상동성을 조사하였다. 그 결과, Pseudoalteromonas prydzensis ACAM 620T (U85855)및 Pseudoalteromonas mariniglutinosa KMM 3635T(AJ507152)와 각각 97.
, 1989)으로 plasmid를 mini-prep하였다. 이와 같이 16S rRNA gene 분석을 통하여 염기서열을 결정한 후, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 및 Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu)에서 가장 상동성이 높은 균주들과 염기서열을 비교하였으며, MEGA 5 package (Tamura et al., 2011)를 이용하여 계통도를 작성하였다.
0% NaCl)에서 39시간 배양하면 서 균의 증식에 따른 살조능을 조사하였다. 즉, 대수증식기로 배양한 A. catenella 배양액(8.0 x 103 cells/mL) 0.9 mL에 최적 조건에서 배양한 NH-12 균주 배양액을 각 3시간 간격으로 0.1 mL씩 접종하여 48시간 배양 후 살조능을 조사하였다. 이 때 control에는 균주 배양액 대신 동량의 PPES-II 배지를 넣어 주었다.
catenella를 무균배양 하였다. 즉, 한계희석법으로 전 배양한 A. catenella 세포들을 원심분리하여 집적하고 멸균된 신선한 f/2-Si배지로 3번 반복 수세한 후, lysozyme (0.5 mg/mL, 20℃, 10 min)과 Sodium Dodecyl Sulfate (SDS, 0.25%, 20℃, 10 min) 를 순서대로 첨가한 후 상기의 조건으로 2회 계대 배양하였다. 이 후 antibiotic complex (gentamycin, streptomycin, cephalothin: each 100 μg/mL)에 노출시켜 3시간 정도 배양하여 세균과 곰팡이 등을 제거한 후, 다시 항생제를 첨가하지 않은 새로운 f/2-Si 배지에서 3회 계대 배양하였다.
0% (w/v) 이상의 NaCl 농도에서는 증식하지 못 하였다. 또한 D-Glucose, D-Maltose, Melibiose 및 Pyruvate를 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용하였다(Table 1). 이상의 결과, 본 균주는 Pseudoalteromonas 속과 가장 유사하였으며, 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene 염기서열(1,409 bp)을 분석하여, NCBI GenBank와 RDP(Ribosomal Database Project)에 등록된 Pseudoalteromonas 속 균주들과 유전자간의 상동성을 조사하였다.
이와 같은 조작을 수회 반복하여 얻은 무균 배양주를 무균 검사법에 의해 아래의 여러 가지 배지에서 오염 미생물이 검출되지 않는 것을 확인한 후 모든 실험에 사용하였다. 무균 검사에는 nutrient agar, PPES-Ⅱ, ST-10 agar (저영양, 종속영양세균용), YM agar (Yeast용), PDA (곰팡이용)를 사용하였다. 사용한 배지의 조성은 다음과 같다: nutrient agar(peptone 5 g, meat extract 3 g, NaCl 3 g, agar 15 g, distilled water 1 L, initial pH 7.
, 2001). 본 실험에서 해수 시료는 2010년 4월 마산만의 부도 내측 해역의 적조 발생해역에서 표층해수를 Niskin 개량형 채수기인 MB 채수기를 이용하여 광구병(180℃에서 2시간 건열 멸균)으로 무균적으로 채수하였으며, 채수된 시료는 ice-box에 보관하여 3시간 이내에 연구실로 옮겨 실험하였다. 살조미생물을 분리하기 위해 해수 시료를 십진희석법으로 희석하여 PPES-Ⅱ(yeast extract 1 g, proteose peptone 1 g, polypeptone 2 g, soytone 1 g, 0.
본 연구에서 사용한 A. catenella는 한국미세조류은행으로부터 분양받았으며, 하기의 무균배양법으로 순수 분리하였고 배양조건은 온도 20℃, initial pH 8.2, 광량 70 μ Em-2s -1, 광주기 12L:12D의 조건으로 f/2-Si (Guillard and Ryther, 1962) 배지에서 계대 배양하며 실험하였다.
무균 검사에는 nutrient agar, PPES-Ⅱ, ST-10 agar (저영양, 종속영양세균용), YM agar (Yeast용), PDA (곰팡이용)를 사용하였다. 사용한 배지의 조성은 다음과 같다: nutrient agar(peptone 5 g, meat extract 3 g, NaCl 3 g, agar 15 g, distilled water 1 L, initial pH 7.0), ST-10 agar(tripticase peptone 0.5 g, yeast extract 0.05 g, agar 12 g, seawater 1 L), YM agar(glucose 10 g, peptone 5 g, yeast extract 3 g, malt extract 3 g, agar 20 g, distilled water 1 L, initial pH 6.2), PDA agar (potato 200 g, glucose 20 g, agar 20 g, distilled water 1 L, initial pH 5.6).
이론/모형
Phylogenetic tree based on comparison of the 16S rRNA gene sequence indicating the position of isolate NH-12. The phylogenetic tree was generated using the neighbor-joining method. Bootstrap values, expressed as percentages of 1,000 replications, are given at branching points.
즉, 유도기(6시간 배양)에는 A. catenella에 대한 살조능이 18% 이하로 낮게 나타났으나, 대수증식기 중기(15-18시간 배양)를 거치면서 살조능이 급격히 증가하기 시작하여 대수증식기 후기(24-30 시간 배양)에 최고조에 올라 98-100%를 살조시켰으며, 정지기에도 94% 이상의 살조능을 나타내었다(Fig. 2).
Pseudoalteromonas sp. NH-12는 6시간의 유도기를 거쳐 대수증식기에 접어들고 배양 30시간 후에 정지기로 접어드는 성장곡선(growth curve)을 보였는데, 성장단계에 따른 살조능을 비교 실험한 결과 대수증식기 후기, 정지기, 대수증식기 중기, 유도기 순으로 살조능이 높게 나타났다(Fig. 2). 즉, 유도기(6시간 배양)에는 A.
즉, Pseudoalteromonas sp. NH-12는 살조물질의 첨가량과 배양시간에 비례하여 A. catenella에 대한 살조능이 증가하는 경향을 보였다. 일반적으로 유각종의 적조생물이 무각종의 적조생물 보다 외부 환경의 급격한 변화에 잘 적응하고 내성을 가져 생존률이 높은데, 본 실험에서 NH-12는 각으로 보호되고 cyst (휴면포자)를 형성할 수 있는 유각종 적조생물인 A.
Pseudoalteromonas sp. NH-12의 성장 단계별 살조능은 대수증식기 후기, 정지기, 대수증식기 중기, 유도기 순으로 높게 나타났다. 살조물질은 대수증식기 중기 이후에 활발히 생산되기 시작하여 대수증식기 후기에 가장 고농도로 축적되는 것으로 판단된다.
이상의 결과, 본 균주는 Pseudoalteromonas 속과 가장 유사하였으며, 보다 정확한 동정을 위하여 16S rRNA gene 염기서열(1,409 bp)을 분석하여, NCBI GenBank와 RDP(Ribosomal Database Project)에 등록된 Pseudoalteromonas 속 균주들과 유전자간의 상동성을 조사하였다. 그 결과, Pseudoalteromonas prydzensis ACAM 620T (U85855)및 Pseudoalteromonas mariniglutinosa KMM 3635T(AJ507152)와 각각 97.67% 및 97.45%의 가장 높은 상동성을 나타내어(Fig. 1), 본 살조미생물을 Pseudoalteromonas sp. NH-12로 명명하여 이후의 실험을 진행하였다.
따라서 NH-12는 살조물질을 세포외로 분비하는 ‘살조인자 분비형’으로 확인되었다.
본 균주는 유도기에는 성장을 위해 살조물질과 같은 2차대사 산물을 거의 생산하지 않으나, 대수증식기 중기 이후에는 살조물질을 적극적으로 생성, 분비하기 시작하여 대수증식기 후기에 살조물질이 가장 많이 축적되는 것으로 판단되며, 정지기에도 살조능이 급격히 감소하지 않는 것으로 보아 미생물 배양액속에 축적되어 있는 살조물질은 쉽게 분해되지 않으며, 영양 고갈상태에 들어선 본 균주에 의해 영양물질로 재이용되지는 않는 것으로 판단된다. 또한 NH-12는 적조생물인 A. catenella가 배지 속에 존재하지 않는 미생물만의 순수배양 상태에서도 살조물질을 생산한다는 것을 알 수 있었으며, A. catenella의 세포를 인식하여 NH-12가 살조물질을 분비할 가능성은 낮은 것으로 판단된다.
마산만의 적조발생 해역의 해수로부터 서로 다른 colony 색과 형태를 가진 38개의 미생물 균주가 분리 되었으며, 그 각각의 colony를 PPES-II 평판배지에서 순수분리, 배양하여 A. catenella에 대한 살조능을 조사하여 4종의 살조미생물이 분리되었다. 그 중 가장 뛰어난 살조능을 보이는 NH-12균주를 선정하여 배양학적, 형태학적 특성 및 API kits(API 20NE와 ZYM)를 이용한 생화학적 특성을 조사하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하였다.
catenella에 대해 살조능을 나타내었으며, 이중 살조능이 가장 우수한 NH-12 균주를 선별하였다. 본 균주는 API kits 및 16S rRNA gene 염기서열을 분석하여 계통분류를 행한 결과 Pseudoalteromonas 속으로 분류되었으며, 최적 배양조건은 25℃, pH 8.0, 3.0% NaCl 농도였다. Pseudoalteromonas sp.
2). 본 균주는 유도기에는 성장을 위해 살조물질과 같은 2차대사 산물을 거의 생산하지 않으나, 대수증식기 중기 이후에는 살조물질을 적극적으로 생성, 분비하기 시작하여 대수증식기 후기에 살조물질이 가장 많이 축적되는 것으로 판단되며, 정지기에도 살조능이 급격히 감소하지 않는 것으로 보아 미생물 배양액속에 축적되어 있는 살조물질은 쉽게 분해되지 않으며, 영양 고갈상태에 들어선 본 균주에 의해 영양물질로 재이용되지는 않는 것으로 판단된다. 또한 NH-12는 적조생물인 A.
상기의 2조배양계 실험의 결과, NH-12는 2차 대사산물을 세포외로 분비하여 EOM (excreted organic matter)으로 A. catenella를 살조시키는 ‘살조인자 분비형’으로 판단된다.
상술한 바와 같이 지금까지 연구 보고된 살조미생물 중 가장 우점하는 대표적인 속은 본 연구에서 분리한 속과 같은 Pseudoalteromonas 속이다. Pseudoalteromonas 속은 가장 큰 미생물 분류 group인 γ-Proteobacteria군에 속하며, Pseudoalteromonas 속 살조미생물들은 주로 ‘살조인자 분비형’으로 살조 특이성이 높아 특정 적조생물에만 살조능을 보이는 것으로 보고되고 있다(Yoshinaga et al.
catenella에 대한 살조능이 증가하는 경향을 보였다. 일반적으로 유각종의 적조생물이 무각종의 적조생물 보다 외부 환경의 급격한 변화에 잘 적응하고 내성을 가져 생존률이 높은데, 본 실험에서 NH-12는 각으로 보호되고 cyst (휴면포자)를 형성할 수 있는 유각종 적조생물인 A. catenella를 짧은 시간에 급격히 살조시키는 능력을 보여주었다. 이상의 결과와 Table 2의 결과를 종합하여 볼 때, Pseudoalteromonas sp.
NH-12를 마산만의 적조발생 해역에서 분리, 동정하고 그 특성과 살조 능에 대해 연구함으로써 보다 환경 친화적인 적조 구제 기술 개발의 기초 자료를 제공하고자 하였다. 적조발생 해역인 마산만의 해수에서 분리한 38개의 해양미생물 균주 중 4종의 미생물이 A. catenella에 대해 살조능을 나타내었으며, 이중 살조능이 가장 우수한 NH-12 균주를 선별하였다. 본 균주는 API kits 및 16S rRNA gene 염기서열을 분석하여 계통분류를 행한 결과 Pseudoalteromonas 속으로 분류되었으며, 최적 배양조건은 25℃, pH 8.
후속연구
catenella의 적조 구제법 개발에 좋은 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다. 그러나 무엇보다도 2차오염이 없는 환경친화적 적조 구제법 개발을 위해서는 해양생태계에 미치는 영향을 최소화할 수 있는 연구가 선행되어야 할 것이다. 또한 적조생물의 제어에 대한 연구뿐만 아니라, 유독성 적조생물이 생산하는 마비성 패독 등의 분해에 대한 후속 연구가 이루어진다면 적조 피해를 줄이는 연구에 도움이 될 것이라 판단된다.
그러나 무엇보다도 2차오염이 없는 환경친화적 적조 구제법 개발을 위해서는 해양생태계에 미치는 영향을 최소화할 수 있는 연구가 선행되어야 할 것이다. 또한 적조생물의 제어에 대한 연구뿐만 아니라, 유독성 적조생물이 생산하는 마비성 패독 등의 분해에 대한 후속 연구가 이루어진다면 적조 피해를 줄이는 연구에 도움이 될 것이라 판단된다.
이상의 연구결과를 토대로 살조물질을 분리, 정제하고 그 구조를 규명하고 보다 효율적인 살조 메카니즘을 밝힌다면, 본 연구에서 분리한 살조미생물은 A. catenella의 적조 구제법 개발에 좋은 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다. 그러나 무엇보다도 2차오염이 없는 환경친화적 적조 구제법 개발을 위해서는 해양생태계에 미치는 영향을 최소화할 수 있는 연구가 선행되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
적조란?
우리나라 연안 해역에서 발생하는 유해성 적조는 해양환경의 오염으로 발생빈도와 기간이 늘어나고 있을 뿐만 아니라 그 영역이 확대되어 막대한 피해를 일으키는 사회ㆍ경제적 문제로 대두되고 있다. 적조는 해수 중 증식촉진 물질의 과잉공급과 일사량, 수온 등 해양 환경이 적조생물의 성장조건에 알맞을 때 대량으로 번식하여 발생하는 현상으로서(Kim et al., 2006), 적조생물은 호흡 및 사체 분해 시 수중의 용존산소를 소비하여 수중의 다른 생물의 생존을 저해하며(Kim et al.
우리나라에서 활용하고 있는 적조생물의 구제 또는 제거 방법 및 연구 현황은?
그러나 아직까지 적조를 효과적으로 방제하는 방법의 개발은 미진한 상황이다. 우리나라에서는 90년대 후반부터 ‘황토 살포법’을 실시해 오고 있다. 자연에서 산출되는 황토가 다른 방법에 비해 환경 친화적이라는 점을 중시하여 사용(Kim et al., 2006)하고 있지만, 황토에 의한 2차 오염 또한 새로운 문제점으로 제기되고 있다. 적조 피해를 줄이기 위해서는 하수 처리 시설의 확충이나 가두리 양식장의 시설을 보다 환경친화적으로 만들어 부영양화의 원인을 줄이는 것이 근본적인 해결책이겠지만, 이 또한 막대한 비용과 시간이 요구되는 현실이다. 이에 최근에는 적조 발생 해역에 존재하는 해양미생물을 이용하는 방법이 보다 안전하고 환경친화적인 적조 제 어법으로 인식되어 많은 연구가 진행되고 있다. 또한 지금까지 보고된 적조생물에 대한 살조미생물의 연구에 있어서 A.
적조생물이 초래하는 생태계의 문제는?
적조는 해수 중 증식촉진 물질의 과잉공급과 일사량, 수온 등 해양 환경이 적조생물의 성장조건에 알맞을 때 대량으로 번식하여 발생하는 현상으로서(Kim et al., 2006), 적조생물은 호흡 및 사체 분해 시 수중의 용존산소를 소비하여 수중의 다른 생물의 생존을 저해하며(Kim et al., 1997), 유해물질 및 독소를 분비하여 어패류를 폐사시키는 결과를 초래한다. 또한 적조생물의 일부는 어패류를 독화시키는 종이 있어, 이 독화된 패류를 사람이 섭취하면 마비성ㆍ설사성 중독을 일으켜 사람의 건강까지도 위협하고 있어 사회ㆍ경제적으로도 심각한 문제가 되고 있다(Park et al., 1998).
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