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문제 정의
- catenella의 여러 가지 환경변수에 대한 생리적인 특성을 파악하는 것은 매우 중요하다. 따라서 본 연구는 그 첫번째 단계로 수온과 염분의 변화에 따른 A. tamarense와 A. catenella 의 성장의 변화를 서로 살펴보고, 우점 전략을 고찰하였다. 또한 실내실험을 통하여 도출된 자료를 바탕으로 발생 시기를 예측할 수 있는 모델식도 제안하여 향후 생태계 모델에 응용될 수 있도록 하였다.
제안 방법
- 전 배양시 온도, 염분 그리고 광조건은 채수한 당시의 현장조건과 유사하게 두 종 모두 20℃, 30 psu 그리고 300 µmol photons m-2 s-1(12L: 12D; coolwhite fluorescent lamp; FHF32SS, Kumho, Korea)로 하여 계대 배양하였다. A. tamarense와 A. catenella에 대한 무균화 처리는 하지 않았지만, 2차 생물학적 오염을 막기 위해서 모든 실험기구는 고압멸균(202 kpa, 20 분) 및 건조멸균(120℃, 3 hr)시켜 사용하였다.
- 수온은 하루에 1 ℃씩 증감시켜 각각의 온도단계에 도달하도록 하였다. 각각의 단계에 적응된 세포를 배양튜브 (DH. TT10100, DAIHAN, Korea)에 f/2 배지를 5 ml 주입한 후 세포수가 약 100 cells ml-1가 되도록 첨가하였다. 그 후 이틀 간격으로 같은 시간에 in vivo chlorophyll 형광값을 측정하였다.
- 각각의 세포를 현장수온과 염분에 상응하는 조건(20℃, 30 psu) 으로 광량은 약 300 µmol photons m-2 s-1에서 대수성장기가 될 때 까지 배양한 후, 여러 가지 세포밀도로 조제하여 형광광도계(Model 10AU005, Turner Designs, USA)로 in vivo chlorophyll 형광값을 측정하였다.
- TT10100, DAIHAN, Korea)에 f/2 배지를 5 ml 주입한 후 세포수가 약 100 cells ml-1가 되도록 첨가하였다. 그 후 이틀 간격으로 같은 시간에 in vivo chlorophyll 형광값을 측정하였다. 세포의 성장속도(growth rate; µ)는 대수성장(exponential growth)을 보이는 기간 동안의 형광값을 이용하여 다음 식 (1)에 의해 계산하였다.
- 분리한 Alexandrium속이 A. tamarense 또는 A. catenella 배양주인지 확인하기 위해, 대수성장기 세포와 배양액을 15 ml 튜브(FA 2096, BD Bioscience, USA)에 옮겨 담은 후, 5% glutaraldehyde를 최종농도가 0.5%가 되도록 첨가하여 고정하였다. 그 후 상등액을 제거하고, 99% 메탄올을 첨가하여 세포를 재현탁 시켜 24시간 동안 냉장 보관하였다.
- 2와 같은 관계식이 성립되었다. 수온과 염분에 따른 A. tamarense와 A. catenella의 성장속도는 현미경을 이용한 직접 검경이 아닌 in vivo chlorophyll 형광값을 이용하여 Fig. 2에 제시한 관계식으로 간접적으로 산출하였다.
- 수온과 염분에 따른 성장속도 실험은 수온 10, 15, 20, 25, 30℃의 5단계, 염분 10, 15, 20, 25, 30, 35 psu의 6단계를 조합하여 총 30단계의 조건하에서 성장속도를 관찰하였다. 실험에 사용된 해수는 동해 외양수로 염분농도가 33 psu이기 때문에 10~30 psu의 염분은 초순수를 사용하여 희석하였으며, 35 psu는 자연 증발시켜 조절하였다.
- 시료를 균일하게 혼합 후 1 ml를 Sedwick-Rafter counting chamber에 첨가하여 검경하였으며, 세포수가 많은 경우 25% 또는 50% 희석하여 광학도립현미경(TE2000, Nikon, Japan)에서 계수하였다. 수온과 염분은 동 정점의 표층, 중층, 저층(B-1 m; 퇴적물로부터 상부 1 m 수층)에서 채수한 해수(반돈 채수기 이용)를 수온염분계(YSI 30, YSI, USA)로 측정하였다.
- 1). 시료를 균일하게 혼합 후 1 ml를 Sedwick-Rafter counting chamber에 첨가하여 검경하였으며, 세포수가 많은 경우 25% 또는 50% 희석하여 광학도립현미경(TE2000, Nikon, Japan)에서 계수하였다. 수온과 염분은 동 정점의 표층, 중층, 저층(B-1 m; 퇴적물로부터 상부 1 m 수층)에서 채수한 해수(반돈 채수기 이용)를 수온염분계(YSI 30, YSI, USA)로 측정하였다.
- 수온과 염분에 따른 성장속도 실험은 수온 10, 15, 20, 25, 30℃의 5단계, 염분 10, 15, 20, 25, 30, 35 psu의 6단계를 조합하여 총 30단계의 조건하에서 성장속도를 관찰하였다. 실험에 사용된 해수는 동해 외양수로 염분농도가 33 psu이기 때문에 10~30 psu의 염분은 초순수를 사용하여 희석하였으며, 35 psu는 자연 증발시켜 조절하였다. 수온 20 ℃, 염분 30 psu 그리고 300 µmol photons m-2s-1에 전배양(preculture)한 대수성장기 세포를 25 psu와 35 psu의 배지에 이식하여 배양하였다.
- 전 배양시 온도, 염분 그리고 광조건은 채수한 당시의 현장조건과 유사하게 두 종 모두 20℃, 30 psu 그리고 300 µmol photons m-2 s-1(12L: 12D; coolwhite fluorescent lamp; FHF32SS, Kumho, Korea)로 하여 계대 배양하였다.
대상 데이터
- 2011년 3월부터 12월까지 마산만 한 정점(Stn. 2)에서 월별로 반돈 채수기를 사용하여 표층 해수 1 L를 채수하고, Lugol 용액으로 최종농도 2%가 되게 고정한 후, 실험실로 옮겨 침전법에 의하여 농축하였다(Fig. 1). 시료를 균일하게 혼합 후 1 ml를 Sedwick-Rafter counting chamber에 첨가하여 검경하였으며, 세포수가 많은 경우 25% 또는 50% 희석하여 광학도립현미경(TE2000, Nikon, Japan)에서 계수하였다.
- A. tamarense는 2011년 3월에 진해만(Stn. 1), A. catenella는 2011년 6월 마산만(Stn. 2)에서 표층해수를 채수하여(Fig. 1), pasteur pipette(Ø 50~100 µm)으로 분리하였다(Guillard[1995]).
- 사용된 배지는 동해에서 채수한 외양수(N36°24'938'', E130°42'055'')를 바탕으로 한 개량형 f/2 배지(Guillard and Ryther[1962])로, 배양튜브(DU.23175215 SCHOTT/DURAN, Germany)에 10 ml 첨가 후, A. tamarense와 A.catenella를 이식하였다.
데이터처리
- 또한 A. tamarense와 A. catenella의 성장에 영향을 미치는 수온과 염분의 관계를 알아보기 위해 식 (2)와 같은 다항식으로 표현하여 성장예측모델을 작성하였으며, 3차항까지 변수증감법에 따른 중 회귀분석을 실시하였다.
이론/모형
- Calcofluor white M2R 용액은 최종농도가 1 mg ml-1 되도록 염색한 후, 형광현미경으로 검경하여 Taylor et al.[1995]에 따른 갑판배열법으로 2종을 명확하게 동정하였다.
성능/효과
- A. tamarense와 A. catenella의 수온과 염분에 대한 성장속도를 contour plotting으로 표현한 결과, A. tamarense는 수온이 낮고, 염분이 높을수록 성장속도가 증가하여, 수온 15 ℃, 염분 30 psu에서 0.31 d-1로 최대 성장속도가 나타났으며(Fig. 7) 점차 감소하였다. A.
- 5 ℃에서 높은 발아율을 보였다(Takeuchi[1994]; Itakura and Yamagichi [2005]). A. tamarense와 같이 최대성장속도와 최대발아율을 보인 수온조건이 일치하지는 않지만, 본 실험의 최적성장속도를 보인 수온범위로 춘계에 발아를 시작하여 하계에 우점할 수 있는 생리적인 조건을 가진 것으로 판단된다.
- 001% 유의수준 내에서 두 종의 성장속도에 대해 수온과 염분은 유의한 영향을 나타내었다. A. tamarense의 경우, 수온과 염분 및 그들의 상호작용의 제곱 합(sum of squares)은 총 제곱 합(total sum of squares)의 62.7%, 23.7% 및 11.9%를 차지하였으며(Table 1), A. catenella는 각각 53.2%, 39.8% 및 0.6%를 차지하여 두 종 모두 성장은 수온의 영향을 더 많이 받는 것으로 나타났다(Table 2).우리나라 주요 적조 종인 C.
- 8 psu일때 발생하였다(유와 Fukuyo[2000]). 경쟁종 배제와 다른 환경조건이 충족한다면, 본 연구에서 밝혀진 최대성장을 보인 수온과 염분 조건의 80%이내에 구간은 이 종이 적조를 일으킬 충분한 수온과 염분범위임을 알 수 있다. 또한 매년 Alexandrium bloom이 일어나는 Hiroshima 만의 경우도 10.
- 수온 20 ℃, 염분 30 psu 그리고 300 µmol photons m-2s-1에 전배양(preculture)한 대수성장기 세포를 25 psu와 35 psu의 배지에 이식하여 배양하였다. 그리고 25 psu 배지의 세포가 대수 성장기 후기에 있을 때 20 psu로 이식하여 염분변화에 따른 영향을 최대한 줄였다. 수온은 하루에 1 ℃씩 증감시켜 각각의 온도단계에 도달하도록 하였다.
- 배양실험으로부터 얻어진 성장속도에 따라 수온과 염분조건을 이용한 이원배치분산분석(two-factor ANOVA)을 수행한 결과, 0.001% 유의수준 내에서 두 종의 성장속도에 대해 수온과 염분은 유의한 영향을 나타내었다. A.
- 본 연구에서 실내배양실험을 위해 분리한 Alexandrium 배양주를 calcofluor white M2R을 통한 형광염색법으로 세포갑판을 살펴본 결과, 상각에 존재하는 a.p.c.와 하각의 중앙에 존재하는 p.s.p.는 두 분리주 모두 유사하였다(Fig. 4). 하지만 3월에 분리된 세포에는 f.
- 예측 모델식에 대해 실내실험에 사용된 수온과 염분 구간을 대입하여 성장속도를 계산한 결과, 배양실험을 통해 얻은 실측값과 계산값 사이에 높은 상관관계가 나타났다(Fig. 8). 여러 가지 환경변수가 식물플랑크톤의 성장에 관여하나, 수온과 염분 간의 두 함수만 고려한다면 상기 (3)과 (4)의 모델식은 훌륭히 두 종의 성장속도를 예측할 수 있을 것으로 생각된다.
- 조사기간 동안 마산만의 수온은 6.3~28.3 ℃의 범위로, 12월에 가장 낮은 수온을, 하계로 갈수록 수온이 증가하여 7월에 가장 높은 수온을 보였으며, 6월부터 8월까지 성층이 형성되는 전형적인 온대해역의 수온분포 양상을 보였다. 염분은 13.
후속연구
- catenella 의 성장의 변화를 서로 살펴보고, 우점 전략을 고찰하였다. 또한 실내실험을 통하여 도출된 자료를 바탕으로 발생 시기를 예측할 수 있는 모델식도 제안하여 향후 생태계 모델에 응용될 수 있도록 하였다.
- 만약 현장에서 관찰한 Alexandrium spp.를 A. tamresne와 A. catenella로 한정시킨다면, 실내실험에서 도출한 결과를 이용하여 추론이 가능할 것으로 보인다. 비교적 저수온기인 4월과 5월의 경우 A.
- 이는 수온과 염분 이외에도 다른 환경적 요인이 그들의 성장과 패독발생에 중요하게 기여하고 있는 것을 의미한다. 추후 A. tamarense와 A. catenella의 성장에 영향을 주는 화학적 또는 생물학적 요인에 대한 생리특성에 대해 연구할 필요성이 대두되었다.
- 이와 같이 비교적외양에서 적조를 형성하는 종은 염분에, 연안에서 적조를 형성하는 종은 수온이 성장을 조절하는 주요 요인임을 알 수 있다. 추후에도 우리나라에서 발생하는 적조 원인종에 대하여 실내실험을 통하여 자료를 수집한다면, 최근 남해안의 일부 만에서 발생하는 댐의 수문 개방에 따른 저염화 및 이상 기후에 따른 종천이 과정을 어느정도 예측할 수 있을 것으로 생각된다.
- [1995]). 하지만 A. tamarense의 v.p.의 경우 계대배양이 오래 진행될수록, 배양주에 따라 v.p.가 사라지는 변형이 발생하는 경우가 있기 때문에, 세포벽 판을 통한 동정을 위해서는 분리 직후 배양된 배양주에 대해 확인 작업을 수행하여야 할 것이다.
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