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문제 정의
- 본 연구에서는 WHW의 신장세포에서의 세포사멸에 대한 보호효과를 확인하기 위해서 protein kinase C 저해제인 staurosporin에 의해 세포사멸을 유도한 신장세포(Maddin -Darby canine kidney, MDCK)에서 WHW 처리에 따른 세포사멸 관련 단백질들의 발현 변화 및 세포의 형태적․생리적 변화를 조사하였으며, 이에 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 staurospoeine으로 세포사멸이 유도된 MDCK 신장세포에서 WHW의 세포사멸 억제효과를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- DNA pellet을 TE buffer(10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)로 녹이고 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 순도를 측정한 다음 5 μg의 DNA를 EtBr이 함유된 2% agarose gel에 loading하고 60 V에서 2시간 동안 전기영동한 후 UV transilluminator에서 fragmented DNA를 관찰하였다.
- MDCK 세포(5×105 cell/㎖ in cell culture medium)를 배양용기에 분주하여 하룻밤 배양한 후 다음 날 완전 배지를 모두 제거한 다음 혈청이 제거된 배지로 교환하였다.
- MDCK 세포에서 SSP에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 DNA fragmentation을 수행하였다. 먼저 MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 100 ㎜ culture dish에 분주하여 하룻밤 배양하여 WHW를 1시간 동안 처리한 다음 SSP(1 μM)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
- MDCK 세포에서 SSP에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 Hoechst 염색을 수행하였다. 먼저 MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 4-well cell culture slide에 분주하여 하룻밤 배양하여 WHW를 1시간 동안 처리한 다음 SSP(1 μM)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
- 05% Tween이 함유된 Tris-buffered saline(TBS-T)로 3회 세척하였다. Membrane을 anti-IgG conjugated HRP 이차항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 TBS-T로 3회 세척하고 ECL용액을 이용하여 x-ray 필름에 감광시킴으로써 결과를 확인하였다.
- ROS의 농도는 DCF 표준용액을 이용하여 0-10 μM 범위에서 얻은 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
- SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포로부터 관찰되는 핵의 응축(DNA condensation)에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 Hoechst 염색을 실시하였다. 그 결과, SSP 처리군에서는 세포사멸이 진행됨에 따라 핵의 응축으로 Hoechst 염색이 더 진하게 되어 밝게 보이는 세포들이 많이 관찰되었으며, WHW를 처리한 세포에서는 농도에 의존적으로 Hoechst에 염색된 세포사멸 유도 세포가 감소하는 것을 확인하였다(Fig.
- SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포로부터 증가되는 ROS에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 OxiSelect™ ROS assay kit(Koma Biotechnology, Seoul, South Korea)를 이용하여 측정하였다.
- SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포로부터 증가되는 caspase-3에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 Caspase-3 colorimetric activity assay kit(Merck Millipore, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 즉, MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 6-well culture plate에 분주하여 하룻밤 배양한 다음 WHW를 1시간 동안 처리하고 SSP(1 μ M)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
- WHW에 의한 MDCK 세포에서의 독성농도와 SSP에 의한 세포사멸 유도 후 세포생존율 변화에 대한 효과를 확인하기 위해서 WST-1 assay를 수행하였다. 먼저 6-well culture plate에 MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 분주하여 하룻밤 배양하여 WHW를 0.
- WHW의 물추출물을 제조하기 위해서 GMP 시설업체인 (주)한풍제약(서울, 한국)으로부터 50 ㎏ 구성약재에 물 1000 L를 넣고 98℃에서 3시간 동안 열수추출하였으며, 연조엑스(수득량: 19.1 ㎏)를 수득한 후 다시 700 mmHg, 55℃에서 15시간 감압 건조하여 건조엑스(수득율: 23.7%)를 제조하였다. WHW 건조엑스는 냉장 보관하면서 실험직전 멸균된 증류수에 완전히 용해시키고 0.
- 한편, Staurosporine은 protein kinase C(PKC) 저해제로서 미토콘드리아와 caspase 활성화에 관여함으로써 세포사멸을 유도하기 때문에 일반적인 세포사멸 유도제로 사용하고 있다. 따라서 본 연구에서는 staurosporine을 MDCK 세포에 처리하여 세포사멸모델을 제작하였으며, WHW의 신장세포 사멸에 대한 억제효과를 확인하였다25).
- 반응액을 96-well plate에 100 ㎕/well씩 옮겨서 Microplate Reader에서 420 nm 흡광도를 측정하였으며, SSP를 처리하지 않은 정상세포군의 세포생존율을 기준으로 약물처리군의 생존율로 계산하였다. 또한 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 세포에서의 WHW에 의한 형태 변화를 광학현미경으로 관찰하였다.
- 먼저 6-well culture plate에 MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 분주하여 하룻밤 배양하여 WHW를 0.2, 0.5, 1 ㎎/㎖ 농도로 처리한 후 1시간 또는 24시간 배양하였다.
- 먼저 MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 100 ㎜ culture dish에 분주하여 하룻밤 배양하여 WHW를 1시간 동안 처리한 다음 SSP(1 μM)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
- 먼저 MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 4-well cell culture slide에 분주하여 하룻밤 배양하여 WHW를 1시간 동안 처리한 다음 SSP(1 μM)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
- , IN, USA)을 200 ㎕/well 씩 넣은 후 37℃ CO2 incubator에서 암실상태를 유지하면서 정치함으로써 2시간 반응 시켰다. 반응액을 96-well plate에 100 ㎕/well씩 옮겨서 Microplate Reader에서 420 nm 흡광도를 측정하였으며, SSP를 처리하지 않은 정상세포군의 세포생존율을 기준으로 약물처리군의 생존율로 계산하였다. 또한 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 세포에서의 WHW에 의한 형태 변화를 광학현미경으로 관찰하였다.
- 여기에 비특이적 protein kinase 저해제(non-selective protein kinase inhibitor)인 staurosporine(SSP: Sigma S6942, Sigma-aldrich, St Louice, USA)을 1 μM(final concentration) 농도로 처리한 후 24시간 배양함으로써 세포사멸을 유도하였다.
- 염색된 cell culture slide를 다시 1× PBS로 2회 세척한 후 형광현미경 하에서 핵의 변연부 응축 정도를 관찰하였다.
- 즉, MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 6-well culture plate에 분주하여 하룻밤 배양한 다음 WHW를 1시간 동안 처리하고 SSP(1 μ M)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
- 즉, MDCK 세포(5×105 cell/㎖)를 96-well culture plate에 분주하여 하룻밤 배양한 다음 WHW를 1시간 동안 처리하고 SSP(1 μM)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
대상 데이터
- 개의 신장세포인 Maddin-Darby canine kidney(MDCK) 세포를 ATCC(NBL-2, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 penicillin G(100U/ml), streptomycin(100 ug/ml) 및 10% FBS가 포함된 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지를 배양액으로 37℃의 5% CO2, 95% air 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용된 WHW의 구성약재인 만삼(蔓蔘, radix of Codonopsis pilosula Nannf.), 단삼(丹蔘, radix of Salvia miltiorrhiza Bge.), 반하(半夏, rhizoma of Pinellia ternata Breit.), 황련(黃連, rhizoma of Coptis chinensis Franch.), 오수유(吳茱萸, fructus of Evodia rutaecarpa Benth.), 음양곽(淫羊藿, herba of Epimedium koreanum Nakai), 대황(大黃, rhizoma of Rheum palmatum L.), 자소엽(紫蘇葉, herba of Perilla frutescens var. acuta Kudo), 감초(甘草, radix of Glycyrrhiza uralensis Fisch.), 인진호(茵蔯蒿, herba of Artemisia capillaris Thunb.), 택사(澤瀉, rhizoma of Alisma plantago -aquatica var. orientale Samuels.), 복령(茯苓, whole fungi of Poria cocos Schw.), 백출(白朮, rhizoma of Atractylodes macrocephala Koidz.), 저령(猪苓, whole fungi of Polyporus umbellatus Fries), 계지(桂枝, ramulus of Cinnamomum cassia Presl.)는 각각 원료성적서가 첨부된 규격화 약재를 (주)광명당제약(울산, 한국)으로부터 구입한 후 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 대한약전과 대한약전외한약(생약)규격집에 따라 검정하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 GraphPadprism 5 통계 프로그램(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준오차(mean±SE)를 계산하고, p<0.05수준에서 Student t-test를 사용하여 각 실험군 간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포로부터 증가되는 세포사멸유도 단백질(caspase-3, Bax)과 세포생존유도 단백질(Bcl-2)의 발현에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해 western blot을 수행하였다. 먼저, MDCK 세포에 WHW를 1시간 동안 처리한 다음 SSP(1 μM)를 처리하여 24 시간 배양하였다.
성능/효과
- 1. WHW는 staurospoeine-유도 신장세포사멸에서 세포생존도를 유의적으로 증가시켰다.
- 2. WHW는 staurospoeine-유도 신장세포사멸에서 세포사멸 유도 단백질인 caspase-3와 Bax의 발현을 억제시켰으며, 세포생존 단백질인 Bcl-2의 발현을 증가시켰다.
- 3. WHW는 staurospoeine-유도 신장세포사멸에서 산화물질인 ROS의 생성을 유의적으로 감소시켰다.
- 4. WHW는 staurospoeine-유도 신장세포사멸에서 핵의 응축과 DNA의 분절을 억제함으로써 세포사멸을 억제시켰다.
- MDCK 세포에서 WHW에 의한 세포독성을 WST-1 assay 방법으로 확인한 결과, WHW를 2 ㎎/㎖ 농도로 처리하였을 때 세포생존율이 89.98±2.91%로 측정되어 정상세포에 비해 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 1A).
- SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포로부터 다량 생성되는 ROS에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 세포배양액 내 ROS를 농도를 측정한 결과, SSP 처리군에 비해 WHW를 0.1 ㎎/㎖(P<0.05), 0.2 ㎎/㎖(P<0.01), 1 ㎎/㎖ (P<0.01) 농도로 처리하였을 때 농도 의존적이며 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3).
- SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포에서 WHW에 의한 세포사멸 관련 단백질들의 발현에 대한 효과를 Western blot 방법으로 확인한 결과, SSP의 처리는 세포사멸유도 단백질인 caspase-3와 Bax의 발현을 증가시켰으며, 세포생존 유도 단백질인 Bcl-2의 발현은 감소시켰다(FIg. 2A). 반면 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포에 WHW를 처리 하였을 때 caspase-3와 Bax의 발현은 농도 의존적으로 감소하였으며, Bcl-2의 발현은 증가하는 것을 확인하였다.
- 결론적으로, 만성신부전 한약제제인 WHW는 신장세포에서 SSP에 의해 유도되는 세포사멸유도 단백질의 발현을 억제시키고 항산화효과를 통해 세포사멸로부터 신장세포를 보호하는 것으로 나타났다. 이는 기존의 WHW의 만성신부전에서의 우수한 치료효능 보고와 더불어 WHW가 만성신부전으로의 진행을 막고 핵심 병태생리를 효과적으로 차단함으로써 우수한 치료제로 개발될 수 있음을 시사한다.
- SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포로부터 관찰되는 핵의 응축(DNA condensation)에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 Hoechst 염색을 실시하였다. 그 결과, SSP 처리군에서는 세포사멸이 진행됨에 따라 핵의 응축으로 Hoechst 염색이 더 진하게 되어 밝게 보이는 세포들이 많이 관찰되었으며, WHW를 처리한 세포에서는 농도에 의존적으로 Hoechst에 염색된 세포사멸 유도 세포가 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4).
- 또한 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포로부터 관찰되는 핵의 분절현상(DNA laddering)에 대한 WHW의 효과를 확인하기 위해서 DNA fragmentation을 확인한 결과, SSP 처리군에 비해 WHW를 처리한 세포에서는 농도에 의존적으로 DNA의 분절현상이 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 5).
- 반면 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포에 WHW를 처리 하였을 때 caspase-3와 Bax의 발현은 농도 의존적으로 감소하였으며, Bcl-2의 발현은 증가하는 것을 확인하였다. 또한 WHW의 처리는 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 세포로부터 증가하는 caspase-3의 활성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다(Fig. 2B).
- 1B). 또한 세포의 형태적 관찰에서도 SSP 처리군에 비해 WHW를 처리한 세포의 경우 정상세포와 유사한 형태를 나타내는 것을 확인하였다(Fig. 1C).
- 2A). 반면 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포에 WHW를 처리 하였을 때 caspase-3와 Bax의 발현은 농도 의존적으로 감소하였으며, Bcl-2의 발현은 증가하는 것을 확인하였다. 또한 WHW의 처리는 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 세포로부터 증가하는 caspase-3의 활성을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타났다(Fig.
- 27). 본 연구에서 WHW는 SSP로 세포사멸이 유도된 신장 세포에서 핵의 응축(condensation)과 분절화(fragmentation) 현상을 감소시킴으로써 세포사멸 억제효과를 나타내었다.
- 특히 DNA 손상에 따른 스트레스가 가해지면 caspase계가 활성화되어 미토콘드리아로부터 과도하게 생성되는 ROS는 미토콘드리아 기능 이상을 초래하며 세포독성에 의해 DNA 손상을 유도하고 p53 유도와 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) 활성화를 통해 세포사멸을 유도한다. 본 연구에서 WHW는 SSP로 세포사멸이 유도된 신장세포로부터 ROS의 생성을 유의적으로 감소시킴으로써 산화 억제효과가 있는 것으로 나타났다.
- Caspase-3는 cysteine proteinase의 일환으로 세포 내에서는 비활성 효소원으로 존재하지만 다양한 자극에 의해 DNA가 손상되면 활성화됨으로써 세포사멸 신호전달에 매우 중요한 조절자 역할로 작용하게 된다. 본 연구에서 WHW는 신장세포에서 staurosporine에 의해 유도되는 세포사멸로부터 증가 되는 caspase-3의 발현을 유의적으로 억제시켰을 뿐 아니라 caspase-3의 활성도 감소시켰다. 또한 세포사멸 유도 단백질 중 하나인 Bax의 발현을 감소시키고 생존단백질인 Bcl-2의 발현을 증가시킴으로써 세포사멸을 억제할 수 있는 것으로 나타났다26).
- 결론적으로, 만성신부전 한약제제인 WHW는 신장세포에서 SSP에 의해 유도되는 세포사멸유도 단백질의 발현을 억제시키고 항산화효과를 통해 세포사멸로부터 신장세포를 보호하는 것으로 나타났다. 이는 기존의 WHW의 만성신부전에서의 우수한 치료효능 보고와 더불어 WHW가 만성신부전으로의 진행을 막고 핵심 병태생리를 효과적으로 차단함으로써 우수한 치료제로 개발될 수 있음을 시사한다.
- 이상의 결과로 볼 때 만성신부전 한약제제 WHW는 신장세포에서 세포사멸을 억제함으로써 신장조직을 보호할 수 있는 것으로 나타났다.
- 한편 SSP에 의해 세포사멸이 유도된 MDCK 세포에서 WHW에 의한 세포 생존율을 확인한 결과, SSP 처리군에 비해서 WHW를 0.5 ㎎/㎖(P<0.001)과 1 ㎎/㎖(P<0.001) 처리하였을 때 세포생존율이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 1B).
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