[논문]광양만 해역에서의 고효율 질소-인 제거 해양박테리아 탐색 및 분리

이건섭; 모상현; 정영재; 김소정; 김영준; 이상섭; 이택견

doi:10.5762/kais.2012.13.7.3267

광양만 해역에서의 고효율 질소-인 제거 해양박테리아 탐색 및 분리
Isolation and Identification of Marine Bacteria with High Removal Efficiencies for Nitrogen-Phosphate In Gwangyang bay 원문보기

한국산학기술학회논문지 = Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, v.13 no.7, 2012년, pp.3267 - 3274

이건섭 (한국해양연구원 남해특성연구부) , 모상현 (바이오에프디엔씨 항노화연구소) , 정영재 (신경대학교 생명공학과) , 김소정 (경북해양바이오산업연구원) , 김영준 (청운대학교 화장품과학과) , 이상섭 (경기대학교 생명과학과) , 이택견 (한국해양연구원 남해특성연구부)

초록
AI-Helper

371 균주의 해양박테리아를 광양만에서 분리하였다. 우점종은 Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, P. fluorescens, P. paucimobilis, Chryseomonas luteola, P. vescularis 등이었다. 영양염과 유기물을 제거할 수 있는 해양박테리아를 탐색하기 위하여 암모니아성 질소(100 mg/L), 질산성 질소(100 mg/L) 및 인(10 mg/L)이 각각 포함된 10 mL의 marine broth 2216 (DIFCO)에 해양박테리아를 접종(1.0%, v/v)하고 12시간 배양하였다. 스크리닝 테스트 결과 25% 이상 $COD_{Cr}$을 제거하는 해양박테리아는 16종, 15% 이상의 암모니아 질소를 제거하는 해양박테리아는 9종, 60% 이상의 질산 질소를 제거하는 해양박테리아는 11종 그리고 90% 이상의 인을 제거하는 해양박테리아는 13종이 분리되었다. Aeromonas hydrophila, Chryseomonas indologenes, Pseudomonas diminuta, Vibrio parahaemolyticus 균주가 유기물 및 영양염류 제거실험을 위해 선정되었다. 회분식 시험을 위해 4종의 해양박테리아를 $COD_{Cr}$ 250 mg/L, $NH_3-N$ 40 mg/L, ${NO_3}^{-}-N$ 40 mg/L, ${PO_4}^{3-}-P$ 10 mg/L이 각각 첨가되어 있는 변형 marine broth에 접종하고, 10시간 배양하면서 제거효율을 측정하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

371 strains of marine bacteria were isolated from Gwangyang bay in Korea. The dominant species were identified as Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, P. fluorescens, P. paucimobilis, Chryseomonas luteola and P. vescularis. To screen marine bacteria capable of removing nutrients and organics, marine bacteria was inoculated in 10 mL of marine broth 2216 (DIFCO) with $NH_3-N$ (100 mg/L), ${NO_3}^{-}-N$ (100 mg/L), and ${PO_4}^{-3}-P$ (10 mg/L) with 1.0% (v/v), and incubated for 12 h. Results from the screening test, showed that the removal efficiencies for $COD_{Cr}$, ammonia niterogen, nitrate nitrogen, and phosphate were over 25% for 16 strains, 15% for 9 strains, 50% for 63 strains, and 15% for 80 strains, respectively. Aeromonas hydrophila, Chryseomonas indologenes, Pseudomonas diminuta, Vibrio parahaemolyticus were selected for nutrients removal experiments. For the batch test, 4 species of marine bacteria were inoculated in modified marine broth containing with nutrients($COD_{Cr}$ 250 mg/L, $NH_3-N$ 40 mg/L, ${NO_3}^{-}-N$ 40 mg/L, ${PO_4}^{3-}-P$ 10 mg/L, respectively), incubated for 10 hr and the removal efficiencies were measured.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서는 해양환경에 적응되어 있는 해양 박테리아 중 질소 및 인 제거능이 우수한 해양박테리아를 선별하고, 해양에서의 질소, 인 제거 공정에 적용하기 위하여 광양만에 분포하고 있는 해양박테리아를 분리하고 동정하였다. 또한, 예비 실험을 통하여 해양박테리아의 성장에 따른 질소, 인의 영양 염류와 유기물 제거 최적 시간을 도출하였으며, 동일한 시간에서 영양염류의 제거능을 조사하였다.

제안 방법

암모니아성 질소는 NH₄Cl, 질산성 질소는 NaNO₃, 인은 KH₂PO₄를 사용하였다. 12시간 배양 후 유기물, 질소 및 인의 제거율을 분석하였고, 효율이 가장 높은 해양박테리아를 선별하여 회분식 질소-인 제거 실험에 적용하였다.
고효율 질소-인 제거능 해양박테리아를 탐색하기 위하여, 분리 동정된 해양박테리아 균주를 5 mL의 marine broth(DIFO 2216)가 채워져 있는 10 mL 시험관에 접종하여 28℃에서 3일간 호기조건으로 배양하였다. 배양액 1%에 암모니아성 질소 100 mg/L, 질산성 질소 100 mg/L, 인 10 mg/L를 첨가한 marine broth 10 mL을 채운 20 mL 시험관에 접종한 후, 12시간 배양하였다.
균주 접종 시 각 균주 당 1 g/L(wet weight; 개체수 1.5x108 CFU/mL)로 300 mL의 배양병에 들어있는 150 mL의 변형 Marine broth 배지(표 3)에 접종하였다. 변형 배지는 유기물 농도(COD_Cr) 250 mg/L, NH₃-N 40 mg/L, NO₃^--N 40 mg/L, PO₄3^--P 10 mg/L로 조정하여 사용하였다.
균주의 생장은 OD₆₀₀를 spectrophotometer로 측정 분석하였다. 그리고 균주의 생장에 따른 유기물, 질소 및 인의 측정을 위해서 각 시료는 MFS(0.
그리고 균주의 생장에 따른 유기물, 질소 및 인의 측정을 위해서 각 시료는 MFS(0.2 μm) 실린지 필터와 5mL 실린지를 사용하여 여과하여 사용하였다.
본 연구에서는 해양환경에 적응되어 있는 해양 박테리아 중 질소 및 인 제거능이 우수한 해양박테리아를 선별하고, 해양에서의 질소, 인 제거 공정에 적용하기 위하여 광양만에 분포하고 있는 해양박테리아를 분리하고 동정하였다. 또한, 예비 실험을 통하여 해양박테리아의 성장에 따른 질소, 인의 영양 염류와 유기물 제거 최적 시간을 도출하였으며, 동일한 시간에서 영양염류의 제거능을 조사하였다.
채집한 해수를 주입평판법(pour plate)으로 생균측정(viable count)을 한 후, 각 콜로니를 취하여 배지에 접종하고, 25℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 균주는 올림푸스 광학현미경(CH 30)을 이용하여 1,000배로 관찰하여 순수 분리 여부를 확인하였다. 순수분리된 균주는 그람염색, oxidase test, KOH test 결과에 따라 API kit(bioMerieux)를 사용하여 생리, 생화학 테스트를 실시하였다.
배양 후, 다시 1000 mL 배양병에 500 mL의 배지를 채운 후, 배양액을 접종하여 3일간 배양하였다. 배양한 균주는 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 모았으며, 정확한 접종량을 위해 세포의 습중량을 측정하였다.
배양된 균주는 올림푸스 광학현미경(CH 30)을 이용하여 1,000배로 관찰하여 순수 분리 여부를 확인하였다. 순수분리된 균주는 그람염색, oxidase test, KOH test 결과에 따라 API kit(bioMerieux)를 사용하여 생리, 생화학 테스트를 실시하였다. 각 균주의 결과는 APILAB Plus program을 이용하여 동정하였다.
채집한 해수를 주입평판법(pour plate)으로 생균측정(viable count)을 한 후, 각 콜로니를 취하여 배지에 접종하고, 25℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 균주는 올림푸스 광학현미경(CH 30)을 이용하여 1,000배로 관찰하여 순수 분리 여부를 확인하였다.
변형 배지는 유기물 농도(COD_Cr) 250 mg/L, NH₃-N 40 mg/L, NO₃^--N 40 mg/L, PO₄3^--P 10 mg/L로 조정하여 사용하였다. 측정 및 분석을 위한 시료는 각각 0, 1.5, 3, 5, 10시간에 채취하였다.
회분식 실험에 사용될 균주를 배양하여, 접종할 균주량을 확보하였다. 선별 균주 균주를 8 ml 시험관에 4 mL의 marine broth 배지(표 1)를 넣고 진탕배양으로 28-30℃에서 24시간 배양하였다.

대상 데이터

광양만 내, 외만 4개 정점(그림 1)에서 표, 중, 심층의 해수를 채수하였다. 분리 및 배양을 위하여 marine broth(DIFCO 2216)와 sea water complete (SWC)를 배지로 사용하였다(표 1과 2).
광양만 내, 외만 4개 정점(그림 1)에서 표, 중, 심층의 해수를 채수하였다. 분리 및 배양을 위하여 marine broth(DIFCO 2216)와 sea water complete (SWC)를 배지로 사용하였다(표 1과 2).
스크린을 통해 선별된 균주 중 유기물 및 영양염류 제거에서 고효율을 보인 균주는 Aeromonas hydrophila, Chryseomonas indologenes, Pseudomo nas diminuta, Vibrio parahaemolyticus로 나타났다. 선정된 4종의 해양 박테리아를 회분식 실험을 통하여 유지물, 질소 및 인 제거능 분석을 수행하였고, 대조군으로는 동정되지 않은 B818 균주를 사용하였다.
배양액 1%에 암모니아성 질소 100 mg/L, 질산성 질소 100 mg/L, 인 10 mg/L를 첨가한 marine broth 10 mL을 채운 20 mL 시험관에 접종한 후, 12시간 배양하였다. 암모니아성 질소는 NH₄Cl, 질산성 질소는 NaNO₃, 인은 KH₂PO₄를 사용하였다. 12시간 배양 후 유기물, 질소 및 인의 제거율을 분석하였고, 효율이 가장 높은 해양박테리아를 선별하여 회분식 질소-인 제거 실험에 적용하였다.

데이터처리

순수분리된 균주는 그람염색, oxidase test, KOH test 결과에 따라 API kit(bioMerieux)를 사용하여 생리, 생화학 테스트를 실시하였다. 각 균주의 결과는 APILAB Plus program을 이용하여 동정하였다.

이론/모형

COD_Cr 측정은 standard method 중 5220.D closed colorimetric method 를 사용하였으며, 암모니아성 질소는 nessler reagent에 의한 발색법으로 사용하여 spectrophotometer (DR2010)으로 분석하였다. 질산성 질소와 인은 QuickChem 800으로 측정 분석하였다.

성능/효과

Marine broth 2216 배지의 NH₃-N 농도를 100 mg/L로 조정하여 실험한 결과, 12시간 배양 후 15%(17.3 mg/L) 이상 제거한 박테리아는 9개 균주로 나타났다(표 6). 가장 높은 효율을 보인 A813 균주는 NO₃^-의 제거율 또한 44.
Marine broth 2216 배지의 NO₃^- 농도를 100 mg/L(초기 농도 77.75 mg/L로 측정됨)으로 조정하여 실험한 결과, 12시간 배양 후 60%(46.7 mg/L) 이상 제거한 박테리아는 11개 균주로 나타났다(표 7).
Marine broth 2216 배지의 PO₄^-3 농도를 10 mg/L로 조정하여 실험한 결과, 12시간 배양 후 90%(17.3 mg/L) 이상 제거한 박테리아는 13개 균주로 나타났다(표 8). 특히, 일부 균주에서는 100% 모두 제거한 것도 있었는데, 대부분의 균주가 Pseudomonas 속에 속하는 것으로, 인 제거율이 높은 박테리아의 경우 NO₃^-의 제거율도 최하 25%이상의 분해를 하는 것으로 나타났다(data not shown).
3 mg/L) 이상 제거한 박테리아는 9개 균주로 나타났다(표 6). 가장 높은 효율을 보인 A813 균주는 NO₃^-의 제거율 또한 44.4%로 매우 높게 나타났다. 배지에 별도의 NO₂-N를 첨가하지 않았으나, nitrite 생성량이 22.
광양만에서 371 균주의 해양박테리아를 분리하였고, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, P. fluorescens, P. paucimobilis, Chryseomonas luteola, P. vescularis 등이 우점하였다.
균주별 인 제거 실험 결과 B818 균주를 제외하고는 95% 이상의 높은 제거율을 나타냈으며, 대체로 3～5시간에 가장 높게 나타났다. 특히, C.
hydro phila가 다른 균주에 비하여 성장률이 높았으며, 상대적으로 B818균주의 경우 성장률이 떨어지는 결과를 보였다. 균주의 성장 시간은 대체로 3～5시간 정도에서 최고점에 도달하는 것으로 나타났으며, 10시간이 경과되면 생장율이 감소하는 것으로 나타났다(그림 2).
성장곡선의 결과 C. indologenes와 A. hydro phila가 다른 균주에 비하여 성장률이 높았으며, 상대적으로 B818균주의 경우 성장률이 떨어지는 결과를 보였다. 균주의 성장 시간은 대체로 3～5시간 정도에서 최고점에 도달하는 것으로 나타났으며, 10시간이 경과되면 생장율이 감소하는 것으로 나타났다(그림 2).
순수분리 및 동정된 균주 중 Pseudomonas aeruginosa(33 균주), Aeromonas hydrophila(32 균주), P. fluorescens(26 균주), P. paucimobilis(26 균주), Chryseomonas luteola(21 균주), P. vescularis(17 균주) 등이 우점하였다(표 4). 특히 Pseudomonas 속(126 균주)은 분리된 균주(371 균주) 중 33.
스크린을 통해 선별된 균주 중 유기물 및 영양염류 제거에서 고효율을 보인 균주는 Aeromonas hydrophila, Chryseomonas indologenes, Pseudomo nas diminuta, Vibrio parahaemolyticus로 나타났다. 선정된 4종의 해양 박테리아를 회분식 실험을 통하여 유지물, 질소 및 인 제거능 분석을 수행하였고, 대조군으로는 동정되지 않은 B818 균주를 사용하였다.
실험된 4종의 해양박테리아 모두 아모니아성 질소의 제거율이 높은 것으로 나타났으며, 특히 3-5시간 이내에 90% 이상 제거하였다. 대조균주인 B818 균주는 제거율이 가장 낮게 나타났는데, 이는 이 균주의 특성상 성장률과 깊은 관계가 있는 것으로 추측된다 (그림 4).
영양염과 유기물을 제거할 수 있는 해양박테리아를 탐색한 결과 4종(Aeromonas hydrophila, Chryseomonas indologenes, Pseudomonas diminuta, Vibrio parahaemolyticus)의 해양박테리아가 유기물 및 질소-인제거능이 우수한 것으로 나타났으며, 특히 P. diminuta는 유기물 및 질소-인 제거능이 고르게 높은 것으로 나타났다.
유기물 제거는 P. diminuta와 V. parahae molyticus가 효율이 높은 것으로 나타났다. P.
유기물 제거실험에 적용한 marine broth 2216 배지의 COD_Cr 초기농도는 7200 mg/L로 나타났으며, 12시간 배양 후 측정 결과 25%(1790.7 mg/L) 이상 제거한 박테리아는 16개 균주로 나타났다(표 5).
전체적인 질산성 질소의 제거율은 20～35% 정도로 낮게 나타났다. A.
3 mg/L) 이상 제거한 박테리아는 13개 균주로 나타났다(표 8). 특히, 일부 균주에서는 100% 모두 제거한 것도 있었는데, 대부분의 균주가 Pseudomonas 속에 속하는 것으로, 인 제거율이 높은 박테리아의 경우 NO₃^-의 제거율도 최하 25%이상의 분해를 하는 것으로 나타났다(data not shown).
해수 시료에 대하여 주입평판법으로 생균측정을 하여 콜로니 특징별로 선별한 결과, 분리된 전체 콜로니 수는 371개였고, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology[20]의 분류키에 따라 종 혹은 속명까지 동정한 박테리아는 총 341개였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	박테리아를 이용한 유기물 제거 공정 연구 현황은?	박테리아를 이용한 유기물 제거 공정은 하수종말처리장에서 주로 이용하고 있다. 특정 박테리아를 순수분리하고 이들을 우점화한 시스템을 개발하여 폐수처리 효율을 높이고, 유지관리를 쉽게 하려는 연구들이 활발히 이루어지고 있다[3]. 또한, 우리나라 연근해역의 박테리아에 대한 조사 및 연구는 꾸준히 이루어지고 있다[4-8].
	광양만의 특징은?	광양만은 남해특별관리 해역으로 인근에 어패류 양식장, 석유화학공업단지, 광양제철소 등이 위치하고 있으며, 공업화 및 도시화로 해양환경변화가 심해지고 있는 지역이다. 광양만의 수질오염원 중 공업하수, 가정하수, 농경지 유출수 등에는 다량의 질소와 인 화합물(영양염류)이 함유되어 있고, 이러한 육상오염원은 해양으로 유입되어 해역에서의 영양염 과부하를 유도하게 되고, 그 결과로 적조 등과 같은 사회적, 경제적 문제를 야기하고 있다.
	광양만의 수질오염원들의 특징과 어떤 문제를 야기하는가?	광양만은 남해특별관리 해역으로 인근에 어패류 양식장, 석유화학공업단지, 광양제철소 등이 위치하고 있으며, 공업화 및 도시화로 해양환경변화가 심해지고 있는 지역이다. 광양만의 수질오염원 중 공업하수, 가정하수, 농경지 유출수 등에는 다량의 질소와 인 화합물(영양염류)이 함유되어 있고, 이러한 육상오염원은 해양으로 유입되어 해역에서의 영양염 과부하를 유도하게 되고, 그 결과로 적조 등과 같은 사회적, 경제적 문제를 야기하고 있다. 일반적으로 하수처리장에서 대부분의 유기물질과 부유물질이 제거되지만, 질소, 인과 같은 영양물질의 상당량은 제거되지 않고 그대로 배출되어 심각한 환경오염을 일으키고 있다[1].

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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