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문제 정의
- 예비실험에서 낮은 피부 흡수를 나타내었다(data not shown). 따라서, 피부흡수를 증가시킬 수 있는 마이크로에멀젼 제제로 개발하기 위하여, 다양한 용매에서의 용해도를 우선 측정하였다. 참당귀 뿌리 추출물의 주된 약리 성분인 decursin을 기준물질로 선정하여 용해도를 측정한 결과는 Table I과 같았다.
- 8) 따라서, 마이크로에멀전을 이용하면 참당귀 뿌리 추출물의 낮은 용해도를 극복할 수 있고 유효성분을 효과적으로 피부 내 진피로 전달할 수 있으므로 참당귀 뿌리 추출물의 항산화 효과와 미백 효과를 높일 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구에서는 마이크로에멀젼에 의한 참당귀 뿌리 추출물의 국소 피부 흡수 증가를 decursin을 기준물질로 하여 정량적으로 평가하고자 하였다.
제안 방법
- 10) 앞서 실행한 용해도 실험 결과를 바탕으로 medium chain triglyceride(MCT)를 오일상으로, Labrasol을 surfactant로 선정하고, propyleneglycol(PG)와 phosphatidylcholine(PC)을 4 : 1(w/w)로 혼합한 것을 cosurfactant로 선정하였다. Surfactant와 cosurfactant를 1:1의 비율로 혼합한 surfactant mixture와 오일상인 MCT를 0.
- 0 ml 적용시켰다.11) 참당귀 뿌리 추출물을 함유한 마이크로에멀젼에 의한 유효성분의 피부 잔류량을 살펴보기 위해 각각 3, 6, 9, 12시간이 지난 후 마우스를 경추 탈골로 치사시킨 후 제제를 적용한 피부 부위를 넓게 절개하여 취하였다. 피부에 남아있는 마이크로에멀젼 제제를 제거하기 위해 메탄올로 씻어준 후 cellophane adhesive tape(CeDerm coporation, USA)로 3회에 걸쳐 각질층을 제거해 주었다.
- 14) Propyleneglycol(PG)은 참당귀 뿌리 추출물의 용해도도 우수하며 피부 흡수 촉진제로 도 이용되고 있어 cosurfactant로 선정하였다.15) 그리고 phosphatidylcholine(PC)을 사용한 제제의 경우 피부 투과 효율을 높여 약물의 bioavailability를 높인다는 연구를 바탕으로 phosphatidylcholine(PC)을 cosurfactant로 선정하였다.16) 이렇게 선정한 조성으로 마이크로에멀젼이 존재하는 영역을 표시하기 위해 pseudo-ternary phase diagrams을 작성하였고, 상이 투명하게 존재하는 지점을 Fig.
- 15) 그리고 phosphatidylcholine(PC)을 사용한 제제의 경우 피부 투과 효율을 높여 약물의 bioavailability를 높인다는 연구를 바탕으로 phosphatidylcholine(PC)을 cosurfactant로 선정하였다.16) 이렇게 선정한 조성으로 마이크로에멀젼이 존재하는 영역을 표시하기 위해 pseudo-ternary phase diagrams을 작성하였고, 상이 투명하게 존재하는 지점을 Fig. 1 에 나타냈다. 그 중에서 surfactant mixture(surfactant : cosurfactant =1 : 1), 유상, 수상의 비율이 8:1:1인 지점을 선정하여 마이크로에멀젼의 최종 조성으로 정하였다.
- Homogenate를 3000 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액만 취한 후 다시 한번 이물질을 제거하기 위하여 16,100 ×g 에서 5분간 원심분리한 후 상층액만 취하여 LC/MS/MS를 이용하여 decursin의 농도를 분석하였다.
- 10) 앞서 실행한 용해도 실험 결과를 바탕으로 medium chain triglyceride(MCT)를 오일상으로, Labrasol을 surfactant로 선정하고, propyleneglycol(PG)와 phosphatidylcholine(PC)을 4 : 1(w/w)로 혼합한 것을 cosurfactant로 선정하였다. Surfactant와 cosurfactant를 1:1의 비율로 혼합한 surfactant mixture와 오일상인 MCT를 0.5 : 9.5부터 1 : 9, 2 : 8, 3 : 7, 4 : 6, 5 : 5, 6 : 4, 7 : 3, 8 : 2, 9 : 1, 9.5 : 0.5의 비율로 혼합하였다. 이 혼합물을 교반하면서 infusion pump를 이용하여 1ml/min의 속도로 물을 적하하면서 육안으로 관찰할 때 투명한 상태를 유지하는 지역을 phase diagram에 마이크로에멀젼으로 표시하였다.
- 5 ml를 donor chamber에 가하고 일정시간(3, 6, 9, 12시간)에 receptor chamber에서 1ml 취한 후 새로운 receptor 용액으로 동량을 채워주었다. 각 시료 중의 decursin 농도는 위에서 언급한 LC/MS/MS를 이용하여 분석하였다.
- 1 에 나타냈다. 그 중에서 surfactant mixture(surfactant : cosurfactant =1 : 1), 유상, 수상의 비율이 8:1:1인 지점을 선정하여 마이크로에멀젼의 최종 조성으로 정하였다.
- 그 후 평형 상태에 이르게 하기 위하여 37°C 배양조에서 50 rpm으로 72시간 동안 shaking한 후,9) 16,100 ×g에서 5분간 원심분리한 상층액을 메탄올로 적당히 희석하여 LC/MS/MS로 분석하였다.
- 그리고 유효면적만 취해 잘게 자른 후 바이알에 담아 methanol(1 ml/cm2)을 가하고 상온에서 1분간 homogenizing(ULTRA-TURAX®T25basic, IKA, Staufen, Germany)하여 진피층에 있는 유효성분을 추출하였다.
- 마이크로에멀젼의 유상을 선정하기 위하여 여러 가지 오일에 대한 참당귀 뿌리 추출물의 용해도를 측정하였다. 충분한 양의 참당귀 뿌리 추출물 분말을 각 오일(1 ml)에 넣은 후 30분간 vortexing 시켜주었다.
- Receptor chamber는 PBS, ethanol, DMSO(5 : 4 : 1, v/v/v)의 혼합용액 12 ml로 채우고 600 rpm으로 교반하며 실험을 진행하였다. 미리 준비해둔 10%(w/v) 참당귀 뿌리 추출물을 함유하는 마이크로에멀젼 제제 0.5 ml를 donor chamber에 가하고 일정시간(3, 6, 9, 12시간)에 receptor chamber에서 1ml 취한 후 새로운 receptor 용액으로 동량을 채워주었다. 각 시료 중의 decursin 농도는 위에서 언급한 LC/MS/MS를 이용하여 분석하였다.
- 참당귀 뿌리 추출물의 주된 약리 성분인 decursin을 기준물질로 선정하여 용해도를 측정한 결과는 Table I과 같았다. 유상의 용매 중에서 decursin의 용해도가 가장 높은 MCT(medium chain triglyceride)를 선정하여 마이크로에멀젼을 형성하는 조성을 확립을 하였다. 중쇄지방산인 MCT는 체내에서 무해하고 안전하므로 피부 투여를 포함하여 다양한 제제의 조성에 사용하고 있다.
- 참당귀 뿌리 추출물을 함유한 마이크로에멀젼을 제조하기 위해 10%(w/v)의 농도로 추출물 분말을 마이크로에멀젼에 가하고 잘 흔들어서 혼합하였다. 이렇게 하여 제조한 마이크로에멀젼 제제는 육안으로 투명하였으므로, 여과나 원심분리 과정 없이 피부투과 실험을 진행하였다. 참당귀 뿌리 추출물을 37°C 증류수에서 72시간 동안 포화시킨 후 원심분리하여 취한 상층액을 대조군으로 사용하였다.
- 피부에 남아있는 마이크로에멀젼 제제를 제거하기 위해 메탄올로 씻어준 후 cellophane adhesive tape(CeDerm coporation, USA)로 3회에 걸쳐 각질층을 제거해 주었다. 제제가 적용되었던 유효면적(2.14 cm2)만을 잘라 앞의 in vitro 실험과 동일한 방법으로 homogenizing 시켜준 후 원심분리 과정을 거쳐서 추출한 decursin의 농도를 LC/MS/MS를 이용하여 분석하였다.
- 참당귀 뿌리 추출물을 37°C 증류수에서 72시간 동안 포화시킨 후 원심분리하여 취한 상층액을 대조군으로 사용하였다.
- 참당귀 뿌리 추출물을 함유한 마이크로에멀젼 제제를 hairless mice(4~5주령, 18~20 g, male)의 피부에 적용했을 때 시간에 따른 기준물질(decursin)의 투과량(skin permeation)과 피부 잔류량(skin deposition)을 Franz diffusion cell을 이용하여 in vitro에서 측정하였다. Hairless mice를 경추 탈골로 치사시킨 후 약 3 cm×3 cm의 면적으로 등 부위의 피부를 잘라낸 후 피하지방을 제거하였다.
- 참당귀 뿌리 추출물을 함유한 마이크로에멀젼에 의한 기준물질의 피부 잔류량을 in vitro에서 관찰하기 위해서는 위에서 언급한 실험 장치에서 각각 3, 6, 9, 12시간이 지난 후 피부를 떼어내었다. 떼어낸 피부는 표면에 남아있는 제제를 제거하기 위해 메탄올로 씻어준 후 cellophane adhesive tape(CeDerm coporation, USA)로 3회에 걸쳐 각질층을 제거해주었다.
- 1)으로부터 surfactant mixture와 오일 및 물의 비율이 8:1:1인 조성을 최종적으로 선정하였다. 참당귀 뿌리 추출물을 함유한 마이크로에멀젼을 제조하기 위해 10%(w/v)의 농도로 추출물 분말을 마이크로에멀젼에 가하고 잘 흔들어서 혼합하였다. 이렇게 하여 제조한 마이크로에멀젼 제제는 육안으로 투명하였으므로, 여과나 원심분리 과정 없이 피부투과 실험을 진행하였다.
- 대조군의 경우, 물에 포화시킨 후 원심분리한 상층액만 취하여 사용하였다. 참당귀 뿌리 추출물의 여러 성분 중 주된 약리 성분이 decursin 이므로17) 이를 기준물질로 선정하여 참당귀 뿌리 추출물의 피부투과와 잔류량을 평가하였다. 마이크로에멀젼을 피부에 적용한 경우, 초기 시간인 3시간에서는 decursin의 피부투과량이 대조군과 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.
- 참당귀 뿌리 추출물의 피부 투과(permeation)와 피부내 잔류량(deposition)을 평가하기 위해 hairless mouse의 등쪽 피부를 절개하여 in vitro 상에서 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 마이크로에멀젼과 대조군(물)의 참당귀 뿌리 추출물의 농도는 각각 10%(w/v)와 0.
- 컬럼은 ACQUITY UPLC® BEH(C18, 1.7 µm, 2.1×50 mm)을 사용하여 실온에서 분석하였다.
대상 데이터
- Hairless mice는 Orient Bio Inc.(Seongnam, Korea)에서 구입하였다. HPLC 용 아세토니트릴과 메탄올은 Fisher Scientific(Pittsburgs, PA, USA)에서 구입한 후 0.
- HPLC 용 아세토니트릴과 메탄올은 Fisher Scientific(Pittsburgs, PA, USA)에서 구입한 후 0.2 µm 필터로 여과 후 사용하였다.
- Hairless mice(4~5주령, 18~20 g, male)을 ether로 마취한 후 등쪽이 위로 오도록 수술대에 고정시켰다. 실제 약물이 피부와 닿는 유효면적이 2.
- Phosphatidylcholine(Soybean phosphatidylcholine)은 Lipoid Company(Ludwigshafen, Germany)에서 제공받았다. Medium chain triglyceride는 Damy chemical(Korea)에서 구입했으며 Labrafil M 1944CS는 Gattefosse(Nanterre, France)에서 공급받았다. Hairless mice는 Orient Bio Inc.
- Propyleneglycol과 olive oil은 Samchun(Pyungtack, Korea)에서 구입하였다. Phosphatidylcholine(Soybean phosphatidylcholine)은 Lipoid Company(Ludwigshafen, Germany)에서 제공받았다. Medium chain triglyceride는 Damy chemical(Korea)에서 구입했으며 Labrafil M 1944CS는 Gattefosse(Nanterre, France)에서 공급받았다.
- Louise, MO, USA)사에서 구입하였다. Propyleneglycol과 olive oil은 Samchun(Pyungtack, Korea)에서 구입하였다. Phosphatidylcholine(Soybean phosphatidylcholine)은 Lipoid Company(Ludwigshafen, Germany)에서 제공받았다.
- 그리고 참당귀 뿌리 추출물의 기준 물질로 선정한 decursin은 Chromadex(USA)에서 구입하였다. Tetraglycol과 castor oil, isopopyl myristate(IPM) 그리고 isopopyl palmitate(IPP)는 Sigma-Aldrich(St. Louise, MO, USA)사에서 구입하였다. Propyleneglycol과 olive oil은 Samchun(Pyungtack, Korea)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 참당귀 뿌리 추출물은 농촌진흥청에서 공급받았다. 그리고 참당귀 뿌리 추출물의 기준 물질로 선정한 decursin은 Chromadex(USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 참당귀는 2009년 강원도 진부에서 생산된 참당귀 시료를 사용하였다. 참당귀 뿌리 시료 50 g을 메탄올 1 l에 녹인 후, 2시간 동안 stirring 하였다.
- 용해도 실험 결과를 바탕으로 MCT를 마이크로에멀젼의 유상으로 선정하고, Labrasol을 surfactant 로, propyleneglycol(PG)과 phosphatidylcholine(PC)의 4 : 1(w/w) 혼합액을 cosurfactant로 각각 선정하였다. Labrasol은 hydrophobic한 약물에 적합한 유화제로 경구제제에도 사용할 정도로 독성이 적고 피부 흡수 촉진제로도 사용된다.
- 이동상은 0.1% formic acid를 함유하는 탈이온 증류수와 0.1% formic acid를 함유하는 아세토니트릴(30 : 70, v/v)을 0.2 µm 멤브레인 필터로 여과한 후에 사용하였다.
- 그 후 평형 상태에 이르게 하기 위하여 37°C 배양조에서 50 rpm으로 72시간 동안 shaking한 후,9) 16,100 ×g에서 5분간 원심분리한 상층액을 메탄올로 적당히 희석하여 LC/MS/MS로 분석하였다. 참당귀 뿌리 추출물의 주된 약리성분은 decusin이라 불리는 쿠마린 성분이므로 이를 기준물질로 선정하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 모든 실험은 최소 세 번 이상 수행하였으며 모든 결과 값들은 mean±standard deviation(S.D.)으로 나타내었다.
- 실험군에 따른 데이터 간의 통계적 유의성 검정은 two-tailed Student's t-test를 수행하여 P 값이 0.05 이하의 값이 나온 경우 통계학적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 마이크로에멀젼이 존재하는 영역을 표시하기 위해 실온에서 H2O titration method를 이용하여 pseudo-ternary phase diagram을 완성하였다.10) 앞서 실행한 용해도 실험 결과를 바탕으로 medium chain triglyceride(MCT)를 오일상으로, Labrasol을 surfactant로 선정하고, propyleneglycol(PG)와 phosphatidylcholine(PC)을 4 : 1(w/w)로 혼합한 것을 cosurfactant로 선정하였다.
성능/효과
- Labrasol은 hydrophobic한 약물에 적합한 유화제로 경구제제에도 사용할 정도로 독성이 적고 피부 흡수 촉진제로도 사용된다.14) Propyleneglycol(PG)은 참당귀 뿌리 추출물의 용해도도 우수하며 피부 흡수 촉진제로 도 이용되고 있어 cosurfactant로 선정하였다.15) 그리고 phosphatidylcholine(PC)을 사용한 제제의 경우 피부 투과 효율을 높여 약물의 bioavailability를 높인다는 연구를 바탕으로 phosphatidylcholine(PC)을 cosurfactant로 선정하였다.
- 1) 대표적인 성분은 decursin, decursinol, imperatorin, nodakenin, nodakenetin 등과 같은 쿠마린 계열 물질이 알려져 있다.2) 참당귀는 자궁기능 조절, 진정, 진통, 이뇨, 비타민E 결핍증 치료작용, 항균작용 등의 약리 작용을 가지고 있어서 예로부터 한방에서 많이 사용되었으며, 주로 아시아 지역에서 천연물 의약품으로 널리 사용하고 있다. 특히, 참당귀 뿌리 추출물에는 유효성분으로서 decursin과 decursinol angelate가 약 90%의 매우 고농도로 존재하며(각각의 비율은 약 3 : 2 정도), 항산화 효과 등의 효능을 갖는 것으로 보고되어 있다.
- 4) 또한, tyrosinase inhibition assay와 melanogenesis inhibition assay로 참당귀 뿌리 추출물의 미백 효과를 평가한 결과, 그 효능이 매우 우수한 것으로 밝혀졌다.5) 이러한 연구 결과에 근거하여, 참당귀 뿌리 추출물을 피부에 적용하면 항산화 및 미백 효과와 같은 피부개선효과를 보여줄 것으로 기대되어 기능성 화장품 소재로서의 가능성에 대해 많은 연구가 진행되고 있다.
- 피부 투과 실험결과와 마찬가지로 시간이 지날수록 마이크로에멀젼 투여군에서 decursin의 피부 잔류량이 증가하였고, 모든 시간대에서 대조군보다 유의적으로 높은 잔류량을 보였다. 대조군은 시간에 따라 잔류량이 조금씩 감소하는 경향을 보였고, 12시간에서는 마이크로에멀젼 투여군이 대조군 보다 30배 이상 높은 decursin의 피부 잔류량을 보였다.
- 4와 같이 in vitro 실험에서와 같은 경향을 보였다. 즉, 시간이 흐름에 따라 대조군은 잔류량이 조금씩 감소하는 경향을 보인 반면, 마이크로에멀젼 투여군에서는 decursin의 피부 잔류량이 증가하였고, 모든 시간대에서 대조군보다 유의적으로 높은 잔류량을 보였다. In vivo 상에서의 피부 잔류량이 in vitro 상에서 실험한 결과 보다 낮은 이유는 in vitro 실험계의 receptor가 용액으로 되어 있고, 두 실험계의 피부 표면 온도 차이 등 실험적인 환경 차이에 기인하는 것으로 보이며, 유사한 결과가 많이 보고되어 있다.
- 참당귀 뿌리 추출물을 함유하는 마이크로에멀젼 제제의 조성을 성공적으로 확립하였고, 기준물질인 decursin의 피부 투과와 누적량이 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 보였다. 따라서, 마이크로에멀젼 제제가 참당귀 뿌리 추출물을 효과적으로 피부로 전달하여 항산화 및 미백 효과 등을 증가시키는 피부 개선 소재로서의 가능성이 있음을 보여준다.
- 마이크로에멀젼 투여군에서 decursin의 피부 투과 및 잔류량이 크게 증가한 이유는 여러 가지 요인에서 찾을 수 있다. 첫째로, 마이크로에멀젼에 의한 참당귀 뿌리 추출물의 용해도 증가이다. 약물의 피부투과는 Fick의 식에 따르는 수동확산이 주된기전이므로, 피부에 가해지는 제제 내의 약물 농도 증가는 피부 투과를 증가시키는 직접적인 동력으로 작용할 수 있다.
- 3과 같았다. 피부 투과 실험결과와 마찬가지로 시간이 지날수록 마이크로에멀젼 투여군에서 decursin의 피부 잔류량이 증가하였고, 모든 시간대에서 대조군보다 유의적으로 높은 잔류량을 보였다. 대조군은 시간에 따라 잔류량이 조금씩 감소하는 경향을 보였고, 12시간에서는 마이크로에멀젼 투여군이 대조군 보다 30배 이상 높은 decursin의 피부 잔류량을 보였다.
후속연구
- 7) 특히, 마이크로에멀젼은 약물의 용해도를 증가시키고, 조성 중의 계면활성제에 의해 약물의 피부 흡수를 유의적으로 증가시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.8) 따라서, 마이크로에멀전을 이용하면 참당귀 뿌리 추출물의 낮은 용해도를 극복할 수 있고 유효성분을 효과적으로 피부 내 진피로 전달할 수 있으므로 참당귀 뿌리 추출물의 항산화 효과와 미백 효과를 높일 수 있을 것으로 기대된다. 본 연구에서는 마이크로에멀젼에 의한 참당귀 뿌리 추출물의 국소 피부 흡수 증가를 decursin을 기준물질로 하여 정량적으로 평가하고자 하였다.
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