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문제 정의
- 본 연구에서는 HPLC-UV를 이용하여 한국 및 중국의 각 지역에서 수집된 93점의 우슬 시료에 대한 ecdysterone 및 inokosterone의 함량모니터링을 실시하였다. 기준의 설정방법으로 표준편차법을 이용하였을 때보다 회귀직선법을 이용하였을 경우에 보다 합리적인 기준설정이 가능하였으며, ecdysterone 및 inokosterone의 함량 기준은 각각 은 0.
- 현재 한국에서 유통되는 우슬에대한 기준을 중국 약전의 기준을 적용할 수 있을지는알 수 없으므로 이에 대한 모니터링이 필요하다. 본 연구에서는 현재 한국 및 중국시장에서 유통되고 있는 우슬을 다양한 지역에서 수집하고 이들로부터 성분 중 가장 함량이 높은 것으로 알려진 ecdysterone과 inokosterone을 지표물질로 하여 이들의 함량 분포를 구하여 통계적인 방법으로 우슬의 효율적인 품질관리를 위한 합리적인 함량기준을 설정하고자 하였다.
제안 방법
- 균질한 검체 분말을 추출, 원심분리, 여과 등 전처리 조작을 거치는 동안 지표성분의 회수율을 검토하기 위하여 표준물 첨가법에 의한 분석결과로부터 구 하였다. 최종 검액 중 첨가한 표준물의 농도가 대조검체의 ecdysterone에 대하여 최고 농도의 13.
- 기존의 문헌에 제시된 방법과 예비실험을 거쳐 크로마토그래피 조건을 설정하였다. 이동상은 0.
- 분석법은 ICH guideline에 의하여 우슬의 지표성분의 검량선으로부터 직선성을 검토하고, 반복 측정의 결과로부터 일내 및 일간 정밀도를 검토하였으며, 그 외 정확도와 선택성, 정량범위, 회수율을 결정 하였다. 분리된 성분의 확인을 위하여 LC/MS를 사용하였고, 분석 조건은 양이온 모드에서 분무가스유속 50 L/min, Ion source 온도 600 oC, 검출기 전압 2.0 kV였다.
- 컬럼의 온도는 30 oC로 하였다. 분석법은 ICH guideline에 의하여 우슬의 지표성분의 검량선으로부터 직선성을 검토하고, 반복 측정의 결과로부터 일내 및 일간 정밀도를 검토하였으며, 그 외 정확도와 선택성, 정량범위, 회수율을 결정 하였다. 분리된 성분의 확인을 위하여 LC/MS를 사용하였고, 분석 조건은 양이온 모드에서 분무가스유속 50 L/min, Ion source 온도 600 oC, 검출기 전압 2.
- 우슬의 분석에 사용된 표준액의 안정성을 확인하기 위하여 메탄올에 녹인 표준액을 실온과 냉장(4 oC)에서 15일간 관찰하였다. 관찰기간 동안 실온과 냉장 모두에서 함량의 차이가 없었으며 특정한 성분이 나타나지도 않았다.
- 전 분석과정을 통한 분석결과의 일내 및 일간의 정확도와 정밀도는 지표성분의 표준물질을 농도가 각각 다른 세 가지 농도로 첨가한 검체를 분석하여 구한 결과 값으로부터 계산하였다. Table 2에서 제시한 바와같이 정확도는 일간 및 일내를 통틀어 82.
- 지표물질의 분석을 위하여 시료를 분말로 한 후 50 mL의 마개달린 시험관에 넣고 50% 에탄올 20 mL를 가했다. 시험관을 상온의 초음파 추출기에 장착하고 90분간 추출한 후 3,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다.
- 회귀직선법은 성분함량의 로그값(로그함량)을 x값으로 하고 대응되는 백분위수(누적분포함수값)를 y값으로 하는 scatter plot에서 모형의 설명력인 결정계수 R2의 값이 이상일 때의 적합된 회귀직선의 방정식이 y = β0+β1x일 경우 함량기준치로서를 e-β0/β1산출하였다.
대상 데이터
- 2010년 3월부터 12월까지 중국 및 한국의 각 지역으로부터 93점(1001~30, 2001~63)의 시료를 구입하였고 그 중 위품으로 확인된 6점을 제외한 87점의 시료를 실험에 사용하였다. 위품으로 확인된 시료는 마우슬 1점(1030), 천우슬 5점(1025, 2018, 2020~21, 2062) 이었고, 정품인 87점의 시료의 산지는 한국 28점, 중국 54점, 산지미상 5점이었다.
- 표준품으로 ecdysterone과 25(S)-inokosterone 을 식약청으로부터 제공받았다. HPLC에 사용한 용매는 모두 HPLC용으로 SK Chemical (Korea)에서 구입 하였고, 개미산과 내부표준물질로 사용된 syringic acid는 Sigma사(MI, USA)에서 구입하였다. 시료 추출을 위한 용매는 모두 특급 및 일급시약을 사용하였다.
- 연구에 사용한 HPLC system은 CBM-10A system controller, LC-10AD 펌프, SPD-10A UV 검출기, CTO10A 주입기(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하였고, Optimapak C18 (4.6×250 mm, RStech, Korea)를 사용 하였다.
- 2010년 3월부터 12월까지 중국 및 한국의 각 지역으로부터 93점(1001~30, 2001~63)의 시료를 구입하였고 그 중 위품으로 확인된 6점을 제외한 87점의 시료를 실험에 사용하였다. 위품으로 확인된 시료는 마우슬 1점(1030), 천우슬 5점(1025, 2018, 2020~21, 2062) 이었고, 정품인 87점의 시료의 산지는 한국 28점, 중국 54점, 산지미상 5점이었다. 시료는 동국대학교 한의과대학 이제현교수가 감별하였고, 증거표본은 충남 대학교 약학대학에 보관하였다.
- 분리된 성분의 확인을 위한 LC/MS는 API 3200QTRAP LC-MS/MS system (AB SCIEX, USA)를 사용하였다. 표준품으로 ecdysterone과 25(S)-inokosterone 을 식약청으로부터 제공받았다. HPLC에 사용한 용매는 모두 HPLC용으로 SK Chemical (Korea)에서 구입 하였고, 개미산과 내부표준물질로 사용된 syringic acid는 Sigma사(MI, USA)에서 구입하였다.
- 확립된 HPLC분석조건으로 정품 87점의 우슬시료를 분석하였다. ecdysterone과 inokosterone은 각각 0.
데이터처리
- 29 표준편차법은 %RSD의 값 50을 기준으로 신뢰구간을 설정하여 함량기준치를 도출하였으며, 50이하(또는 초과) 인 경우에는 전체 자료값들의 평균(m)과 표준편차(s) 에 대하여 구간 m±1.645s (초과의 경우 m±s) 안의 값만 취한 후 구간내의 자료값들의 평균(m')과 표준편차 (s')에 대하여 함량기준치로 m'-1.96s'(초과의 경우 m'-1.645s')으로 산출하였다.
이론/모형
- 성분함량기준치를 설정하기 위하여 이용된 방법으로는 상대표준편차에 따른 신뢰구간을 이용한 방법 (표준편차법),28 로그함량과 백분위수에 대한 회귀직선 모형으로의 분석법(회귀직선법)을 이용하였다. 29 표준편차법은 %RSD의 값 50을 기준으로 신뢰구간을 설정하여 함량기준치를 도출하였으며, 50이하(또는 초과) 인 경우에는 전체 자료값들의 평균(m)과 표준편차(s) 에 대하여 구간 m±1.
성능/효과
- 각각의 피크로부터 계산된 이론단수의 평균은 약 18,000단으로 컬럼의 효율이 충분히 큰 것으로 나타났다. LC-MS를 이용하여 시료에서 분리된 성분의 분자량을 확인하였을 때 1번과 2번 피크로부터 분자량 480인 ecdysterone과 inokosterone의[M+H]+ 및 [M+Na]+ 에 해당하는 m/z = 481 및 503이 관찰되었다. 두 물질은 이성질체로 MS 스펙트럼만으로는 두 물질을 동정할 수는 없으나 두 개의 피크가 ecdysterone과 inokosterone에 해당한다는 사실을 알수 있었다(Fig.
- 확립된 HPLC분석조건으로 정품 87점의 우슬시료를 분석하였다. ecdysterone과 inokosterone은 각각 0.074%, 0.045%의 함량을 보였으나 국산 28점과 중국산 54점을 따로 분리하여 계산했을 경우 두 가지 지표성분에 대해 국산의 평균함량이 중국산의 평균함량에 비해 ecdysterone은 약 1.8배, inokosterone은 약 1.9배 높았으며, 평균함량의 차이는 통계적으로 유의한것으로 나타났다. 표준편차법을 이용하였을 경우 edcysterone과 inokosterone의 함량기준은 각각 0.
- 9로 지표물질이 추출물의 다른 성분들로 부터 간섭을 받지 않고 양호하게 분리되었다. 각각의 피크로부터 계산된 이론단수의 평균은 약 18,000단으로 컬럼의 효율이 충분히 큰 것으로 나타났다. LC-MS를 이용하여 시료에서 분리된 성분의 분자량을 확인하였을 때 1번과 2번 피크로부터 분자량 480인 ecdysterone과 inokosterone의[M+H]+ 및 [M+Na]+ 에 해당하는 m/z = 481 및 503이 관찰되었다.
- 6%가 합격되는 것으로 나타났다. 결론적으로, 우슬 중 지표물질인 ecdysterone의 함량을 0.033%, inokosterone의 함량을 0.020%로 설정함므로써 성분함량이 낮은 중국산 약재의 유통을 감소시키고 국산 약재를 보호할 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 우슬의 품질관리에 새로운 기준을 적용하므로써 우수한 약재의 유통을 유도할 수있을 것으로 본다.
- 본 연구에서는 HPLC-UV를 이용하여 한국 및 중국의 각 지역에서 수집된 93점의 우슬 시료에 대한 ecdysterone 및 inokosterone의 함량모니터링을 실시하였다. 기준의 설정방법으로 표준편차법을 이용하였을 때보다 회귀직선법을 이용하였을 경우에 보다 합리적인 기준설정이 가능하였으며, ecdysterone 및 inokosterone의 함량 기준은 각각 은 0.033%, 및 0.020%로 계산되었다. 새로 설정된 기준으로 시판 우슬의 품질을 평가하였을 경우 국산은 모두가 합격하였고 중국산은 92.
- LC-MS를 이용하여 시료에서 분리된 성분의 분자량을 확인하였을 때 1번과 2번 피크로부터 분자량 480인 ecdysterone과 inokosterone의[M+H]+ 및 [M+Na]+ 에 해당하는 m/z = 481 및 503이 관찰되었다. 두 물질은 이성질체로 MS 스펙트럼만으로는 두 물질을 동정할 수는 없으나 두 개의 피크가 ecdysterone과 inokosterone에 해당한다는 사실을 알수 있었다(Fig. 3).
- 관찰기간 동안 실온과 냉장 모두에서 함량의 차이가 없었으며 특정한 성분이 나타나지도 않았다. 또한 다른 회사에서 판매되는 동일 종류의 컬럼을 이용하여 서로 다른 온도에서 실험하여 본 분석법의 완건성을 확인하였을 경우 이론단수, 용량인자, 분리인자, 성분의 분리도 및 함량에서 유의한 차이가 관찰되지 않아 완건성이 우수함을 알 수 있었다.
- 03%로 설정되어 있다. 모니터링의 결과를 기초로하여 ecdysterone의 기준을 0.033%로 상향 조정하고, inokosterone의 기준함량을 0.02%로 설정하는 경우 국산은 모두 합격하였고, 중국산의 92.6%가 합격되는 것으로 나타났다. 결론적으로, 우슬 중 지표물질인 ecdysterone의 함량을 0.
- 본 실험법에서 검출한계(신호 대 잡음비 = 3) 및 정량한계(신호 대 잡음비 = 10)는 ecdysterone의 경우 각각 0.1 µg/mL 및 0.3 µg/mL였고, inokosterone의 경우 각각 0.2 µg/mL 및 0.7 µg/mL로 추출물의 함량분석에 충분한 것으로 나타났다.
- 성분 ecdysterone과 inokosterone은 2~30 µg/mL 범위에서 상관계수 0.99이상의 양호한 직선성을 나타내었고, 두 가지 성분에 대한 검량선의 식은 각각 y(성분과 IS 의 피크 면적비) = 0.0262x(농도, µg/mL), y= 0.0125x로 나타났다.
- 22µm 막여과기로 여과한 액을 검액으로 하였다. 우슬의 지표성분인 ecdysterone과 inokosterone 표준품을 HPLC에 의하여 순도를 확인하였고 각각 98.43%와 96.13%의 순도를 나타내었다. 검량선 작성을 위한 표준액은 ecdysterone과 inokosterone을 메탄올에 녹여 1 mg/mL stock solution으로 하고 단계별로 희석 하여 사용하였다.
- 균질한 검체 분말을 추출, 원심분리, 여과 등 전처리 조작을 거치는 동안 지표성분의 회수율을 검토하기 위하여 표준물 첨가법에 의한 분석결과로부터 구 하였다. 최종 검액 중 첨가한 표준물의 농도가 대조검체의 ecdysterone에 대하여 최고 농도의 13.3%, 40%, 80%가 되게 한 3 batch의 검액과 대조검체로 표준물을 첨가하지 않은 검체를 분석하여 회수율을 구한 결과는 Table 1에서 볼 수 있는 바와 같이 98.7%~ 103.0%로 우수하게 나타났다.
- 9배 높았으며, 평균함량의 차이는 통계적으로 유의한것으로 나타났다. 표준편차법을 이용하였을 경우 edcysterone과 inokosterone의 함량기준은 각각 0.02%, 0.011%로 계산되었는데, 이 값은 모니터링에 사용된 시료 함량의 최솟값보다 낮아 이 기준을 사용하면 모든 시료가 시험에 합격하는 것으로 나타났다. 따라서, 우슬의 경우 기준 설정 시 표준편차법은 효용성이 떨어질 것으로 판단된다.
- 따라서, 우슬의 경우 기준 설정 시 표준편차법은 효용성이 떨어질 것으로 판단된다. 회귀직선법을 이용하였을 경우 ecdysterone은 0.033%, inokosterone은 0.020%로 계산 되는데 이 값을 함량기준으로 하였을 경우 전체 시판품의 약 95.4%가 합격 되는 것으로 나타났다. 한국, 중국 및 일본의 공정서에는 inokosterone 기준함량은 설정되어 있지 아니하고, 중국약전에는 ecdysterone이 0.
후속연구
- 020%로 설정함므로써 성분함량이 낮은 중국산 약재의 유통을 감소시키고 국산 약재를 보호할 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 우슬의 품질관리에 새로운 기준을 적용하므로써 우수한 약재의 유통을 유도할 수있을 것으로 본다.
- 4%였다. 새로운 기준은 지표성분의 함량이 낮은 중국산의 유통을 감소 시켜 양질의 국산 생약을 보호할 수 있을 것으로 판단된다.
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