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문제 정의
- 하지만, 이들 약물 간에 PTDM 유발에 차이를 보인다는 연구 결과는 calcineurin에 의한 인슐린 억제 기전에 있어서 다른 대체 기전이 관여하고 있음을 보여준다11). 따라서 본 연구에서는 DNA chip을 이용하여 면역억제제에 의해 췌장베타세포주인 RIN-m5F 세포에서 유전자들의 발현과 대사과정의 연관관계를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Agillent Rat whole genome 44K Oligo chip(G4131A, Agilent Technologies, Palo Alto, CA)을 사용하여 Microarray hybridization은 Agilent’s Gene Expression Hybridization Kit를 그리고 Agilent’s Gene Expression Wash Buffer Kit를 이용하였다.
- CsA와 FK506의 DNA chip을 이용한 당대사 및 인슐린 관련 유전자들 중에서 상반된 양상을 갖는 유전자 중에서 Akt2 유전자를 발굴하였다. Akt2는 기존의 연구를 보면 Akt2 효소를 발현시키는 유전자를 제거할 경우 인슐린 저항성(insulin resistance)과 2형 당뇨병(type 2 diabetes)과 유사한 증상이 유도된다는 사실을 확인된다28).
- Data Analysis는 Agilent's GeneSpring Software를 이용하여 normalization 및 clustering 등을 수행하였다.
- RNA sample은 Agilent’s 2100 Bioanalyzer System을 이용하여 total RNA의 quality를 측정하였고 Agilent’s Low RNA Input Linear Amplification kit PLUS를 이용하여 증폭 및 라벨링 과정을 수행하였다.
- 2에 도시하였다. average-linkage hierarchical clustering 방법2)을 각 유전자와 샘플에 적용하여 그 결과를 면역억제제에 의한 유전자 발현의 특성을 관찰하고, 연관성을 알아보았다. 가로축에는 각 샘플들이, 세로축에는 유전자들이 배열되며, 유전자 발현 양상의 유사성에 근거하여 배열순서가 결정된다.
- 그리고 Scan and image analysis는 Agilent’s DNA microarray scanner 및 Feature Extraction Software를 사용하였다.
- 면역억제제인 CsA와 FK506을 첨가 배양한 RIN-5mF 세포를 배양한 후 인슐린 분비능에 미치는 효과를 알아보았다. 대조군과의 차이는 면역억제제에 따른 인슐린의 분비량이 감소하는 것으로 확인되었다(Fig.
- 4)로 2회 세척하고 5 mM 또는 20 mM의 포도당을 함유한 KRBB-HEPES 완충액으로 바꾸어 1시간 배양한 후, 상층액을 취하여 4℃에서 10분간 원심분리하여 상층액을 모아 -20℃에 보관하였다. 분비된 인슐린의 양을 rat insulin RIA kit로 측정하고 각 well의 세포 단백질의 농도를 측정하여 각 단위 그램 단백질 당 인슐린 분비량을 계산하였다.
- 대표적인 면역억제제인 (CsA와 FK506)는 calcineurin/NFAT signaling 억제를 갖기 때문에 NFAT에 의해 베타세포의 인슐린 프로모터에 작용하여 인슐린 발현을 조절작용을 갖는다. 이를 통해 두 면역 억제제는 NFAT를 매개로한 억제기전을 공통적으로 가지나 각 약물에 따른 인슐린 합성에 차별적 영향을 미치므로 각 유전자군의 분석을 통하여 각 면역억제제의 차별적인 유전자 변화를 알아보았다.
대상 데이터
- DNA microarray 분석을 위한 RNA의 준비는 TRIZOL reagent (Invitrogen Life Technologies, USA)를 이용하였다. 간단히 요약하면 충분히 세포를 씻어낸 후 1 mL TRIZOL reagent를 처리하고 상온에 5분간 방치하였다.
데이터처리
- Hierarchical clustering을 이용하여 분석한 전체적인 유전자 발현 양상을 TreeView 프로그램을 이용하여 Fig. 2에 도시하였다. average-linkage hierarchical clustering 방법2)을 각 유전자와 샘플에 적용하여 그 결과를 면역억제제에 의한 유전자 발현의 특성을 관찰하고, 연관성을 알아보았다.
성능/효과
- 그에 따라 당대사 및 인슐린 관련 유전자 및 NFAT 관련 유전자의 공통적인 작용을 확인 할 수 있었다. 그 결과 Maturity Onset Diabetes of Youth (MODY) 관련 유전자들은 공통적인 억제 양상을 확인할 수 있었다. 이와 같이 당뇨에 있어서 주요한 유전자는 유전적 결손이 확인된 당뇨병인 Maturity Onset Diabetes of Youth (MODY) 증후군으로 이들 유전자들은 transcription factor hepatocyte nuclear factor 4α (HNF-4α/MODY1), glucokinase (GCK/MODY2) transcription factor hepatocyte nuclear factor 1α (HNF-1α/MODY3), insulin promotor factor 1(IPF-1/MODY4), transcription factor hepatocyte nuclear factor 1β (HNF-1β/MODY5), Neuro D1로서 인슐린 분비 세포 발달의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다16).
- Cyclosporin과 tacrolimus 같은 면역억제제는 immunophilin과 결합하여 calcineurin 억제를 이루는데 이것은 면역 억제의 대표적 기전 갖는다. 그에 따라 당대사 및 인슐린 관련 유전자 및 NFAT 관련 유전자의 공통적인 작용을 확인 할 수 있었다. 그 결과 Maturity Onset Diabetes of Youth (MODY) 관련 유전자들은 공통적인 억제 양상을 확인할 수 있었다.
- 특히 인슐린 생성 및 분비에 대한 FK506 고유의 영향은 규명되어야 할 과제로 남아있다. 기존의 세포 실험과 임상 연구 결과들을 종합하면 CsA나 tacrolimus와 같은 calcineurin 억제제들은 췌장 세포에 직접적인 독성을 주어서 PTDM의 발생위험을 높이지만, 특히 tacrolimus는 현재 통상적으로 사용하는 용량에서 PTDM의 발생위험도를 더 높인다고 할 수 있다20).
- 면역억제제인 CsA와 FK506을 첨가 배양한 RIN-5mF 세포를 배양한 후 인슐린 분비능에 미치는 효과를 알아보았다. 대조군과의 차이는 면역억제제에 따른 인슐린의 분비량이 감소하는 것으로 확인되었다(Fig. 1).
- 따라서 동일 효능의 약제라 하더라도 활성도가 유전적 다형성(genetic polymorphismie, rapid vs poor metabolizers)도 CYP의 활성을 좌우하는 중요한 요소이다. 본 실험을 통해 밝혀진 Cytochrome P4502S1(CYP2S1)은 건선의 약물치료반응에 따른 개인차를 보이고, 대장암 환자의 치료예후에도 연관이 있는 약물대사효소로30) 알려져 있으며 이를 통해 CsA와 FK506의 치료 반응의 차이를 확인할 수 있다.
- 이와 같이 당뇨에 있어서 주요한 유전자는 유전적 결손이 확인된 당뇨병인 Maturity Onset Diabetes of Youth (MODY) 증후군으로 이들 유전자들은 transcription factor hepatocyte nuclear factor 4α (HNF-4α/MODY1), glucokinase (GCK/MODY2) transcription factor hepatocyte nuclear factor 1α (HNF-1α/MODY3), insulin promotor factor 1(IPF-1/MODY4), transcription factor hepatocyte nuclear factor 1β (HNF-1β/MODY5), Neuro D1로서 인슐린 분비 세포 발달의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다16). 실험 결과 대부분의 MODY 유전자는 CsA, FK506 모두 공통적으로 억제하는 양상을 확인할 수 있었다.
- Table 1은 MODY 관련 유전자군(A)과 인슐린 관련 유전자군(B), NFAT 관련 유전자군(C), 그리고 CYP 관련 유전자군(D)을 정리한 것이다. 인슐린 관련 유전자군에서 Akt2 발현은 FK506이 낮아지는 것에 비해 CsA는 2배에 가까운 증가를 보였고, CYP 관련 유전자군에서는 Cyp2s1는 CsA가 1에 가까운 것에 비해 FK506은 4.77을 보였고, Cyp11b3는 CsA가 1에 가까운 것에 비해 FK506은 50을 보이고 있다.
- Akt2는 기존의 연구를 보면 Akt2 효소를 발현시키는 유전자를 제거할 경우 인슐린 저항성(insulin resistance)과 2형 당뇨병(type 2 diabetes)과 유사한 증상이 유도된다는 사실을 확인된다28). 즉 Akt2 효소가 인슐린-자극성 포도당 운송 신호 전달 기능(insulin-stimulated signaling of glucose transport)을 갖으며 Akt2 유전자의 발현 차이는 결과적으로 인슐린 합성의 차별적 영향을 갖는다.
후속연구
- 이와 같은 약물간의 작용기전의 차이는 한약재를 기반으로 하는 한의학에서도 필요한 연구라 보인다. 동일한 질환의 한의처방에 대한 세부 기전에 대한 연구는 향후 한의학의 과학화에 필수적이며, 장기이식 등에 필요한 한약재를 발굴하여 향후 기존 면역억제제와 비교 연구할 필요가 있다.
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