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문제 정의
- 본 연구에서 오미자 추출물을 OP9 지방전구세포로 분화하는 단계에 처리하였을 경우 분화억제 효과와 그 기전을 확인하고자 하였다. 오미자 추출물을 5, 20, 50 μg/ml의 농도로 OP9 세포에 24, 48, 72, 96시간 처리하였을 때, 오미자 추출액의 농도와 처리시간에 따라 대조군에 비해 세포 독성을 나타내지 않아 각 농도에서의 지방세포 분화에 대한 효과를 조사하였으며, 지방에 특이 반응을 나타내는 Oil red-O 염료를 이용하여 얻은 결과에서 오미자 추출물은 지방의 축적량을 현저하게 감소시켰고, BODIPY 염료와 DAPI 염료를 이용하여 조사한 결과에서도 지방세포의 분화가 유의하게 억제되었다.
- 본 연구에서는 오미자 추출물이 지방세포 분화와 관련이 있는지, 또한 그 작용기전을 확인하기 위해 OP9 지방전구세포를 이용한 지방세포의 분화 과정을 관찰하였으며, 오미자 추출물의 세포독성과 지방세포 내 지방 축적량을 조사하고 지방합성과 관련된 유전자의 발현 상태를 조사하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 7% formalin으로 30분간 고정시킨 후, 60% isopropanol로 1번 세척한다. 1 ml Oil red-O solution(Sigma, O0625)을 첨가한 후, 60분간 염색시킨 후, 3차 증류수를 이용하여 3번 세척하고 건조시킨 후, 현미경(Olympus IX70 model)을 이용하여 200배율로 촬영하였다. 염료의 추출을 위해서는 100% isopropanol로 세포 내 축적된 lipid를 염색한 Oil red-O solution를 추출하여 microplate spectrophotometer로 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 30 nM DAPI(Sigma, D8417)와 1 μg/ml BODIPY(Invitrogen, D2191) 용액을 첨가한 후, 세포배양기에서 60분간 노출시킨 후, 현미경 (Olympus IX70 model)을 이용하여 200배율로 각각 파란색, 녹색 형광 파장을 이용하여 촬영하였다.
- 4.5×105cells/ml OP9 세포를 6-well plate에 배양한 후, 다양한 농도(5, 20 and 50 ㎍/ml)의 오미자 추출물을 처리한 후, 지방세포로 분화를 유도하였다.
- 4.5×105cells/ml의 OP9 세포를 6-well plate에 배양한 후, 다양한 농도(5, 20 and 50 ㎍/ml)의 오미자 추출물을 처리한 후, 지방세포로 분화를 유도하였다.
- OP9 세포를 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin이 포함된 MEM-α 배지에서 배양한 후, confluent 한 상태가 되면 분화를 유도하였다.
- 요약하면, reaction mixture을 10분 동안 95℃에서 반응 시킨 후, denaturation (95℃, 10초), annealing (58℃ for FAS, HSL, LPL, aP2, PPARγ, C/EBPα or 60℃ for GAPDH, 5초), elongation (72℃, 10초)의 조건에서 45 cycles을 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA양은 LightCycler System software (Roche)를 이용하여 GAPDH에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다. 실험에 사용된 FAS, HSL, LPL, aP2, PPARγ, C/EBPα, GAPDH의 primer 염기 서열은 Table 1에 표기하였다.
- 반응이 끝난 후, 13,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하고 침전물을 80% EtOH로 세척하였다. 세척된 RNA를 건조시킨 후 DEPC가 처리된 20 ㎕로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
- 3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2)에 함유된 반응액으로 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 중합효소연쇄반응은 10배 희석한 cDNA에 taq 중합효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액 (Roche Diagnostics Ltd, UK)를 반응시켜 LightCycler rapid thermal cycler system (Roche)을 이용하여 수행하였다. 요약하면, reaction mixture을 10분 동안 95℃에서 반응 시킨 후, denaturation (95℃, 10초), annealing (58℃ for FAS, HSL, LPL, aP2, PPARγ, C/EBPα or 60℃ for GAPDH, 5초), elongation (72℃, 10초)의 조건에서 45 cycles을 수행하였다.
- 64 g을 얻었다. 얻어진 오미자 70% 에탄올 추출물에 증류수 100 ml를 넣고 교반하여 현탁 시킨 후, 24시간 동안 실온에서 방치하고, 3000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 취함으로써 오미자 70% 에탄올추출물의 비수용성 분획물 (NNMBS51) 3.29 g을 제조하였다.
- 역전사 반응 (reverse transcription reaction)은 3-5 ㎍ total RNA와 reverse transcriptase (MMLV; GIBCO, BRL)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 역전사 반응은 total RNA (3-5 ㎍), oligo d(T)12-18 (1 ㎍), 2 ㎕ dNTP (10 mM), MMLV reverse transcriptase (200 U), DTT (10 mM), RNase inhibitor (1 ㎕; Promega, USA), 20 ㎕ 완충용액 (50 mM Tris-Cl pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2)에 함유된 반응액으로 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 중합효소연쇄반응은 10배 희석한 cDNA에 taq 중합효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액 (Roche Diagnostics Ltd, UK)를 반응시켜 LightCycler rapid thermal cycler system (Roche)을 이용하여 수행하였다.
- 1 ml Oil red-O solution(Sigma, O0625)을 첨가한 후, 60분간 염색시킨 후, 3차 증류수를 이용하여 3번 세척하고 건조시킨 후, 현미경(Olympus IX70 model)을 이용하여 200배율로 촬영하였다. 염료의 추출을 위해서는 100% isopropanol로 세포 내 축적된 lipid를 염색한 Oil red-O solution를 추출하여 microplate spectrophotometer로 510 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 오미자 추출물에 대한 OP9세포의 세포 독성을 나타내지 않아 5, 20, 50 μg/ml의 농도로 지방세포 분화에 대한 효과를 조사하였다(Fig. 1).
- 5×104 cells/ml의 OP9 세포를 96-well plate에 배양한 후 다양한 농도의 오미자 추출물을 처리한 후 배양하였다. 오미자 추출물을 정해진 시간 노출 시킨 뒤 10 ul의 EZ-CyTox 용액(Daeil Lab Service Co., Ltd, Seoul, Korea)을 각 well에 첨가한 후, 37℃에서 3시간 배양하여 microplate spectrophotometer (Molecular Device, USA)로 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 오미자 추출물의 지방세포 분화에 대한 실험을 위하여 적정한 농도를 구하고자 5, 20, 50 μg/ml의 농도로 OP9 세포에 24, 48, 72, 96시간 처리한 후, 세포독성을 조사하였다.
- 오미자 추출물이 OP9 지방전구세포의 분화를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 5, 20, 50 μg/ml의 농도로 OP9 세포에 처리한 후, 세포내 축적된 지방(lipid droplet)의 양을 측정하였다.
- 오미자 추출물이 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자로 알려진 PPARγ, C/EBPα mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 분화가 끝난 OP9 세포를 수집하여 total RNA를 분리하여 cDNA합성 후, 실시간 연쇄 효소 중합 반응을 이용하여 mRNA 발현 정도를 조사하였다.
- 오미자 추출물이 지방세포 분화와 관련된 유전자인 FAS, HSL, LPL, aP2 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 분화가 끝난 OP9 세포를 수집하여 total RNA를 분리하여 cDNA합성 후, 실시간 연쇄 효소 중합반응을 이용하여 각 유전자의 mRNA 발현 정도를 조사하였다. FAS, HSL mRNA의 경우 대조군에서 분화한지 4일째 대조군에 비하여 각각 10.
- 요약하면, reaction mixture을 10분 동안 95℃에서 반응 시킨 후, denaturation (95℃, 10초), annealing (58℃ for FAS, HSL, LPL, aP2, PPARγ, C/EBPα or 60℃ for GAPDH, 5초), elongation (72℃, 10초)의 조건에서 45 cycles을 수행하였다.
대상 데이터
- 세포배양에 사용된 세포배양 용기는 Falcon사(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하였으며, 세포배양액인 MEM-α, FBS(Fetal bovin serum), 항생제 등은 GIBCO사(Grand Lsland, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Insulin, Dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine, EZ-CyTox Assay(Daeil Lab Service Co., Ltd, Seoul, Korea), Oil red-O solution(Sigma, O0625), DMSO(Sigma, Lot#84596) 제품을 사용하였다.
- OP9 세포주는 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA; catalog no. CRL-2749)에서 구입해서 사용하였으며, 20% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin을 함유한 MEM-α 배지에서 37℃와 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 오미자는 2009년 10월 익산시 신용동 소재 대학한약국에서 구입하였으며, 형태학적 평가를 통하여 동정하였고 표본시료 (NNMBS051)는 천연물신약표준화소재은행(원광대학교 약학대학 약학과)에 보관하였다. 오배자 70% 에탄올 추출물의 비수용성 분획물(NNMBS51)은 천연물신약표준화소재 은행에 보관하고 있다.
- 세포배양에 사용된 세포배양 용기는 Falcon사(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하였으며, 세포배양액인 MEM-α, FBS(Fetal bovin serum), 항생제 등은 GIBCO사(Grand Lsland, NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 FAS, HSL, LPL, aP2, PPARγ, C/EBPα, GAPDH의 primer 염기 서열은 Table 1에 표기하였다.
- 오미자 추출물의 지방세포에 대한 세포독성여부를 확인하기 위하여 EZ-CyTox 용액(Daeil Lab Service Co., Ltd, Seoul, Korea)을 이용하였다. 1.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±S.E.M으로 표시하였으며 유의성의 검정은 One-Way Anova test (Microcal Origin; version6.0; Microsoft; USA)에 의하였으며 p< 0.05인 것만 유의한 것으로 하였다.
이론/모형
- Cells were treated with various concentration of GCE in designated time intervals. The cell viability was evaluated by EZ-CyTox assay as described in materials and methods. Values are mean ± SD of three replicates.
- 분화가 끝난 OP9 세포로부터 total RNA의 분리는 Trizol reagent (Life Technologies, UK)를 이용하여 제조회사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 6-well culture dish에서 배양된 4.
- 역전사 반응 (reverse transcription reaction)은 3-5 ㎍ total RNA와 reverse transcriptase (MMLV; GIBCO, BRL)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 역전사 반응은 total RNA (3-5 ㎍), oligo d(T)12-18 (1 ㎍), 2 ㎕ dNTP (10 mM), MMLV reverse transcriptase (200 U), DTT (10 mM), RNase inhibitor (1 ㎕; Promega, USA), 20 ㎕ 완충용액 (50 mM Tris-Cl pH 8.
- 오미자 추출물이 OP9 지방전구세포의 분화를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 Oil red-O 염색법을 이용하였다. 4.
- 오미자 추출물이 OP9 지방전구세포의 분화를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여 5, 20, 50 μg/ml의 농도로 OP9 세포에 처리한 후, 세포내 축적된 지방(lipid droplet)의 양을 측정하였다. 지방세포로 분화가 끝난 OP9 세포를 지방전구세포 분화에서 형성되는 중성지방을 특이적으로 염색시키는 Oil red-O 염색법을 이용하여 지방의 축적 정도를 조사하였다. 5일 동안 분화가 끝난 후, 대조군은 세포 내 지방 축적 정도가 증가하였으나 오미자 추출물을 처리한 군은 지방 축적이 감소하여 지방세포의 분화를 억제하였다.
성능/효과
- 지방세포로 분화가 끝난 OP9 세포를 지방전구세포 분화에서 형성되는 중성지방을 특이적으로 염색시키는 Oil red-O 염색법을 이용하여 지방의 축적 정도를 조사하였다. 5일 동안 분화가 끝난 후, 대조군은 세포 내 지방 축적 정도가 증가하였으나 오미자 추출물을 처리한 군은 지방 축적이 감소하여 지방세포의 분화를 억제하였다. 세포 내 염색된 Oil red-O 염료의 양을 isopropanol로 용해한 후, 측정한 결과 5, 20, 50 μg/ml 오미자 추출물을 처리한 군은 대조군(100%)에 비하여 각각 27.
- 오미자 추출물이 지방세포 분화와 관련된 유전자인 FAS, HSL, LPL, aP2 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 분화가 끝난 OP9 세포를 수집하여 total RNA를 분리하여 cDNA합성 후, 실시간 연쇄 효소 중합반응을 이용하여 각 유전자의 mRNA 발현 정도를 조사하였다. FAS, HSL mRNA의 경우 대조군에서 분화한지 4일째 대조군에 비하여 각각 10.4배, 22.4배, 26배 증가하였으나, 오미자 추출물을 처리한 군에서는 각각 0.6배, 0.9배, 3.2배로 억제되었으며, LPL, aP2 mRNA의 발현양도 오미자 추출물을 처리한 군에서는 발현의 증가가 나타나지 않았다(Fig. 5).
- 대조군에서는 지방세포로 분화한지 2일, 3일, 4일째 PPARγ mRNA 양이 각각 1.7배, 3.7배, 4.5배 증가하였으나 오미자 추출물을 처리한 군에서는 각각 0.6배, 1.3배, 2.4배로 억제되었다.
- 또한 C/EBPα mRNA 발현양도 대조군에서는 지방세포로 분화한지 2일, 3일, 4일째 각각 2.2배, 3.6배, 5.5배 증가하였으나, 오미자 추출물을 처리한 군은 1.1배, 1.3배, 2.3배로 억제되었다(Fig. 4).
- 이러한 결과는 오미자 추출물의 지방세포 분화 억제 효과가 지방의 합성 과정을 억제함으로써 이루어짐을 보여주고 있다. 또한 지방세포 분화와 관련된 유전자인 FAS, HSL, LPL, aP2 mRNA의 경우, 분화한지 3일, 4일째에 대조군에서 큰 폭으로 증가하였으나 오미자 추출물을 처리한 군에서는 발현이 현저하게 억제되었다.
- 세포 내 염색된 Oil red-O 염료의 양을 isopropanol로 용해한 후, 측정한 결과 5, 20, 50 μg/ml 오미자 추출물을 처리한 군은 대조군(100%)에 비하여 각각 27.7%, 48.7%, 63.7%로 유의하게 감소하였다(Fig. 2).
- 오미자 추출물은 지방세포 분화과정에서 농도 및 시간에 따른 세포독성을 나타내지 않았다. 오미자 추출물은 지방세포 분화 과정에서 농도에 따라 축적되는 지방의 양을 유의하게 감소시키고, 지방세포 분화를 유의하게 억제하였다. 오미자 추출물은 지방세포 분화과정에서 지방세포분화 조절인자인 PPARγ, C/EBP α의 mRNA의 발현을 유의하게 억제하였다.
- 오미자 추출물을 5, 20, 50 μg/ml의 농도로 OP9 세포에 24, 48, 72, 96시간 처리하였을 때, 오미자 추출액의 농도와 처리시간에 따라 대조군에 비해 세포 독성을 나타내지 않아 각 농도에서의 지방세포 분화에 대한 효과를 조사하였으며, 지방에 특이 반응을 나타내는 Oil red-O 염료를 이용하여 얻은 결과에서 오미자 추출물은 지방의 축적량을 현저하게 감소시켰고, BODIPY 염료와 DAPI 염료를 이용하여 조사한 결과에서도 지방세포의 분화가 유의하게 억제되었다.
- 오미자 추출물이 adipogenic transcription factor들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 mRNA 및 단백질 발현량에서 확인하였으며, 지방세포 분화를 조절하는 전사 인자로 알려진 PPARγ, C/EBPα mRNA의 경우, 대조군에서는 지방세포로 분화한지 3일, 4일째에 PPARγ, C/EBPα, mRNA 발현이 모두 현저하게 증가하였으나 오미자 추출물을 처리한 군에서는 유의하게 억제되었다.
- 이상을 종합해 볼 때 오미자 추출물이 지방세포 분화과정에서 adipogenic transcription factor인 PPARγ, C/EBPα와 그 표적 유전자인 FAS, HSL, LPL, aP2 mRNA의 발현을 억제함으로써 지방세포의 분화와 지방조직 내의 지방 축적을 억제하는 것으로 생각된다.
- 지방세포 분화에 대한 오미자 추출물의 억제효과를 세포 내 지방에 특이적인 반응을 나타내는 BODIPY 염료를 이용하여 재조사하고, 동시에 핵에 특이적으로 반응하는 DAPI 염료를 이용하여 조사한 결과 Fig. 2와 유사하게 지방세포 분화를 억제하였다(Fig. 3).
후속연구
- 이상을 종합해 볼 때 오미자 추출물이 지방세포 분화과정에서 adipogenic transcription factor인 PPARγ, C/EBPα와 그 표적 유전자인 FAS, HSL, LPL, aP2 mRNA의 발현을 억제함으로써 지방세포의 분화와 지방조직 내의 지방 축적을 억제하는 것으로 생각된다. 오미자 추출물이 지방세포 분화억제에 높은 활성을 나타내는 천연소재로 사료되어지며, 본 연구를 기반으로 임상에서 비만 환자를 대상으로 지속적인 연구가 필요하다고 생각된다. 이를 통해 오미자 추출물이 항비만 제제 개발의 후보 물질이 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 오미자 추출물이 지방세포 분화억제에 높은 활성을 나타내는 천연소재로 사료되어지며, 본 연구를 기반으로 임상에서 비만 환자를 대상으로 지속적인 연구가 필요하다고 생각된다. 이를 통해 오미자 추출물이 항비만 제제 개발의 후보 물질이 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과에서 오미자 추출물이 지방세포 분화억제에 높은 활성을 나타내는 천연소재로 사료되어지며, 본 연구를 기반으로 다각적인 연구가 이루어져 향후 비만 치료에 유용하게 사용될 수 있기를 기대한다.
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