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문제 정의
- 11) 우리가 즐겨 찾는 카페인 함유 기호식품에는 카페인 함량에 대한 정보가 제공되지 않고 있으므로, 본 연구에서는 HPLC 분석을 통한 커피와 차의 카페인 함량조사를 하고자 한다. 이와 더불어 차의 침출 시간과 침출온도에 따라 변화되는 카페인의 함량을 측정하여 합리적인 음용방법의 정보를 제공하고자 한다.
- 13) 이에 실제 시판중인 커피와 차를 이용하여 동일한 양의 카페인을 함유한 커피와 차를 흰 쥐에게 경구 투여 후 운동량 측정과 특정행동 관찰을 통해 카페인의 행동에 대한 효과를 관찰하고, 카페인의 농도가 증가됨에 따라 그 효과가 달라지는지를 살펴보고, 차와 커피 사이에 효과의 차이가 있는지를 비교해 보고자 한다.
- 본 연구에서는 카페인과 테아닌을 투여하는 대신 차와 커피를 직접 투여하여 운동량에 대한 카페인의 영향을 관찰하고, 차와 커피를 비교하여 카페인에 대한 테아닌의 저해작용을 관찰함으로써 그 동안의 실험들과는 다른 의미를 가진다고 할 수 있다. 그러나 한 종류의 차와 커피를 가지고 실험하였기 때문에 차와 커피가 운동량에 미치는 영향에 대해 결론짓기에는 부족하며, 다른 종류의 차와 커피를 이용한 실험이 필요로 된다.
- 11) 우리가 즐겨 찾는 카페인 함유 기호식품에는 카페인 함량에 대한 정보가 제공되지 않고 있으므로, 본 연구에서는 HPLC 분석을 통한 커피와 차의 카페인 함량조사를 하고자 한다. 이와 더불어 차의 침출 시간과 침출온도에 따라 변화되는 카페인의 함량을 측정하여 합리적인 음용방법의 정보를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 위와 같은 농도의 시료를 만들기 위해 사용된 최종적인 방법은 다음과 같다. 10 mg/kg과 30 mg/kg의 카페인을 함유한 표준커피시료를 만들기 위해 각각 2 g, 6 g의 커피를 100℃의 물 50 ml에 용해시켰다. 10 mg/kg의 카페인을 함유한 표준차시료를 만들기 위해, 100℃의 물에 11개의 티백을 10분간 추출시킨 후 티백을 최대한 짜내고 55±2℃에서 3분간 끓였다.
- 실험동물에게 경구 투여된 표준커피시료는 동서식품(Korea)의 ‘맥심 오리지날’ 인스턴트 커피를 사용하였고, 표준차시료는 Twinings 사(UK)의 ‘earl grey black tea’를 사용하였다. 10 mg/kg과 30 mg/kg의 카페인을 함유한 표준커피시료와 표준차시료를 만들기 위해 250 g 동물에게 0.8 ml가 투여되도록 설계하였으며, 그 결과 각각 카페인의 농도가 2.5 mg/0.8 ml, 7.5 mg/0.8 ml가 함유되도록 하였고, 이를 HPLC로 확인하였다. 위와 같은 농도의 시료를 만들기 위해 사용된 최종적인 방법은 다음과 같다.
- 특정행동에서는 ‘똑바로 서기(rearing)’와 ‘긁기(scratching)’를 관찰하였으며, ‘똑바로 서기’는 뒷발을 바닥에 댄 채로 앞 발을 들어올려 몸이 수직상태로 되는 것으로 하였으며, ‘긁기’는 앞발 또는 뒷발을 이용하여 신체부위를 만지는 것으로 하였다.13) 관찰하는 동안 빈도와 지속시간을 측정하여 기록하였다.
- 각 시료를 200 µl 취하여 검량선 작성 방법과 동일한 방법으로 전처리한 후 HPLC에 주입하였다.
- 동시에 특정행동 측정을 위해, 90분을 20분 간격으로 나누어 각 20분 간격의 처음 10분과 마지막 10분을 더해 총 50분 동안 관찰하였다. 특정행동에서는 ‘똑바로 서기(rearing)’와 ‘긁기(scratching)’를 관찰하였으며, ‘똑바로 서기’는 뒷발을 바닥에 댄 채로 앞 발을 들어올려 몸이 수직상태로 되는 것으로 하였으며, ‘긁기’는 앞발 또는 뒷발을 이용하여 신체부위를 만지는 것으로 하였다.
- 또한 표준커피시료의 경우 50, 200, 1000 µg/ml의 3농도, 표준차시료의 경우 10, 100, 500 µg/ml의 3농도를 이용하여 회수율을 측정하였다.
- 마찬가지로 카페인이 함유되지 않은 국화차 160 µl에 50, 250, 500, 1000, 2500 µg/ml의 카페인 표준용액을 40 µl씩을 각각 정확히 가하여 10, 50, 100, 200, 500 µg/ml의 표준차시료를 만들었다.
- 밸리데이션 항목으로 직선성, 일내(intra-day) 정확성 및 정밀성, 일간(inter-day) 정확성 및 정밀성, 회수율의 4가지 항목으로 나누어 평가하였다. 최저정량한계는 분석물질의 반응이 공시료의 반응과 비교할 때 최소 5배 이상이 되도록 설정하였다.
- 45 um 필터(Uniflo RC, 13 mm syringe filters, Whatman, UK)로 여과한 후 50 µl를 취하여 HPLC에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 카페인의 피크 면적비를 이용하여 검량선을 작성하였다.
- 일내 정확성과 정밀성은 검량선 작성 농도 범위에서 5농도에 대해 각각 하루 동안에 3세트를 작성하여 구하였고, 일간 정확성과 정밀성은 검량선 작성 농도 범위에서 5농도에 대해 각각 3일 동안 1세트씩 작성하여 구하였다. 표준커피시료에 함유된 카페인의 일내, 일간 밸리데이션에서 정확도의 평균 범위는 각각 93.
- 차를 끓여먹는 물의 온도와 시간에 따라 용출되는 카페인의 양을 비교하고자 차를 대상으로 침출온도와 침출시간을 100℃/10 min, 100℃/5 min, 80℃/5 min, 60℃/5 min으로 변화시켜 용출된 카페인을 분석하였다. 이 때 차의 종류는 중국녹차, 억수설록차, 만수설록차 세 가지로 하였으며 샘플의 양은 1 g, 물의 양은 200 ml로 하였다.
- 카페인 표준품을 증류수에 용해시켜 5 mg/ml 용액을 만들고, 동일 용매로 계열 희석하여 50, 250, 500, 1000, 2500, 5000 µg/ml 농도의 표준용액을 제조하였다.
- 탈카페인 커피 160 µl에 250, 500, 1000, 2500, 5000 µ/ml의 카페인 표준용액을 40 µ씩을 각각 정확히 가하여 50, 100, 200, 500, 1000 µg/ml의 표준커피시료를 만들었다.
- 표준커피시료의 경우 50, 100, 200, 500, 1000 µg/ml의 5농도, 표준차시료의 경우 10, 50, 100, 200, 500 µg/ml의 5농도에 대하여 하루에 실험을 3회 반복 시행하여 일내 정확도와 정밀도(CV %)를 구하였고, 3일간 실험을 반복 수행하여 일간 정확도와 정밀도(CV %)를 구하였다.
대상 데이터
- 시약으로는 카페인 표준품은 순도 99%의 Sigma-Aldrich 사(USA) 제품을 사용하였고, 내부표준물질로 사용한 아세트아미노펜 표준품은 순도≥99%의 Sigma-Aldrich 사(USA) 제품을 사용하였다. Methanol은 Merck사(Germany)의 HPLC 등급을 사용하였고, phosphoric acid는 85%의 Samchun Pure Chemical 사(Korea) 제품을 사용하였으며, water는 증류수를 사용하였다.
- 시약으로는 카페인 표준품은 순도 99%의 Sigma-Aldrich 사(USA) 제품을 사용하였고, 내부표준물질로 사용한 아세트아미노펜 표준품은 순도≥99%의 Sigma-Aldrich 사(USA) 제품을 사용하였다.
- 실험동물에게 경구 투여된 표준커피시료는 동서식품(Korea)의 ‘맥심 오리지날’ 인스턴트 커피를 사용하였고, 표준차시료는 Twinings 사(UK)의 ‘earl grey black tea’를 사용하였다.
- 실험동물은 SD male rat 7주령으로 ORIENTBIO 사(Korea)에서 구매하였고, 일주일 정도 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 실험에 사용된 동물은 총 35마리로 각 cage 당 5마리씩 넣어 두었으며, 물과 사료를 자유롭게 섭취하게 하였다.
- 경구 투여 직후, 챔버에 다시 넣고 5분 후부터 90분 동안 운동량을 측정하였다. 실험동물의 운동량을 측정하기 위해 사용된 장치는 Tru Scan 99로 Coulbourn Instruments 사(USA)의 제품이었다. 이 장치는 적외선 센서링이 설치되어 있고, 0.
- 실험동물은 SD male rat 7주령으로 ORIENTBIO 사(Korea)에서 구매하였고, 일주일 정도 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 실험에 사용된 동물은 총 35마리로 각 cage 당 5마리씩 넣어 두었으며, 물과 사료를 자유롭게 섭취하게 하였다. 실험 전 날 저녁부터 절식시켰으며, 실험 시 체중은 191~227 g이었다.
- Column의 온도는 항상 30℃로 유지하였고, 데이터 처리장치로는 Schimadzu사의 CLASS-VP를 사용하였다. 이동상으로는 0.1% phosphoric acid : methanol(65:35 v/v) 혼합용액을 사용하였고, 유속 1 ml/min에서 정량하였다.
- 장치로는 Shimadzu 10 AVP사(Japan)의 HPLC를, 검출기로는 UV detector(275 nm)를, column은 C18u Bondapak(4.6 mm i.d×150 mm; 10 um)을 사용하여 처리한 샘플을 분석하였다.
- 카페인 함량 분석에 사용된 재료는 티백홍차 3품목, 티백 녹차 1품목, 티백국화차 1품목, 캔홍차 1품목, 캔녹차 1품목, 캔우롱차 1품목, 가루홍차 1품목, 커피믹스 6품목, 인스턴트 커피 1품목으로 총 9종 16품목이었다. 시약으로는 카페인 표준품은 순도 99%의 Sigma-Aldrich 사(USA) 제품을 사용하였고, 내부표준물질로 사용한 아세트아미노펜 표준품은 순도≥99%의 Sigma-Aldrich 사(USA) 제품을 사용하였다.
- 카페인이 실험동물의 운동에 미치는 영향을 측정하기 위해 사용된 동물은 물(대조그룹), 차 10 mg/kg, 30 mg/kg, 커피 10 mg/kg, 30 mg/kg의 5그룹으로 나누었고, 한 그룹 당 동물의 수는 7마리로 하였다. 동물은 실험 전 챔버에서 30분 동안 적응시간을 거친 후, 시험물질을 경구투여 받았다.
- 커피와 차 투여에 따른 동물의 운동량 결과는 Table 4와 같다. 통계 분석 시 최대값과 최소값을 제외하고 5마리의 결과값을 이용하였다. 물(대조그룹), 차 10 mg/kg, 30 mg/kg, 커피 10 mg/kg, 30 mg/kg의 5그룹 중 커피 30 mg/kg 그룹이 8507.
데이터처리
- 커피와 차에 함유된 카페인의 HPLC 분석법에 사용된 검량선의 농도 범위는 표준커피시료가 50-2500 µg/ml, 표준차 시료가 10-500 µg/ml이었다. 검량선의 농도는 피크 면적비(카페인의 피크 면적/내부표준물질의 피크 면적)로 계산하였고 최소제곱법을 이용하여 회귀직선식을 구하였다. 실험을 통해 얻어진 표준커피시료와 표준차시료의 검량선은 각각 y=0.
- 운동량과 특정행동 실험결과에 대한 통계분석은 Microsoft Office Excel 2007을 사용하여 독립표본 t검증으로 분석하였다.
성능/효과
- p>커피는 가장 많이 거래되는 작물 음료 중 하나이고, 차는 물 다음으로 많이 소비되는 음료이다.1,2) 카페인은 커피와 차에 함유된 주 성분 중 하나로,3) 세계적으로 가장 널리 소비되는 흥분제이며 커피와 차 뿐만 아니라 소다음료, 초콜릿, 의약품 등에 광범위하게 함유되어 있다.4)
- HPLC를 이용하여 분석한 결과, 표준커피시료와 표준차시료에서 r2은 각각 0.99 이상으로 직선성을 확인할 수 있었다. 차와 커피 모두 일내, 일간 정확도 및 정밀도가 ±15% 안에 포함되었고, 회수율도 120% 안에 포함되었다.
- Tru Scan 99를 사용하여 운동량을 측정한 결과, 카페인이 함유된 차와 커피를 투여 받은 그룹이 물을 투여 받은 대조 그룹과 비교해 운동량이 유의하게 증가되었고, 커피 30 mg/kg이 흰 쥐의 운동량에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 보였다. Antoniou K13)의 연구에서도 카페인을 용해한 생리식염수를 흰 쥐에게 복강 투여한 결과, 10 mg/kg, 20 mg/kg 농도의 카페인을 투여 받은 그룹에서 대조그룹인 식염수를 투여한 그룹과 비교해 운동량이 유의하게 증가되었다.
- 그러나 30 mg/kg의 카페인이 함유된 차와 커피를 투여 받은 그룹에서는 커피 그룹이 차 그룹보다 운동량이 유의하게 증가되었다(p < 0.01).
- 다음으로 커피와 차에서 농도의 변화에 따른 차이를 살펴보면, 커피 30 mg/kg 그룹이 커피 10 mg/kg 그룹보다 이동거리가 유의하게 증가된 것을 볼 수 있었지만(p 0.127).
- Antoniou K13)의 연구에서도 카페인을 용해한 생리식염수를 흰 쥐에게 복강 투여한 결과, 10 mg/kg, 20 mg/kg 농도의 카페인을 투여 받은 그룹에서 대조그룹인 식염수를 투여한 그룹과 비교해 운동량이 유의하게 증가되었다. 두 번째로 차와 커피에서 카페인의 농도 변화에 따른 운동량의 변화를 살펴보면, 커피에서는 카페인의 농도가 10 mg/kg에서 30 mg/kg으로 증가함에 따라 이동거리가 유의하게 증가되었다(p < 0.001). 그러나 차에서는 카페인의 농도가 증가함에 따라 이동거리가 증가하였지만 유의한 차이는 보이지 않았다(p > 0.
- 카페인은 흰 쥐의 운동량 증가에 영향을 미쳤고, 커피에서는 카페인의 농도가 증가함에 따라 운동량이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또한 높은 농도의 카페인을 함유한 차와 커피가 투여된 그룹에서는 커피 그룹이 차 그룹과 비교하여 운동량의 증가에 더 큰 영향을 미치는 것을 볼 수 있었다.
- 그러나 이러한 결과는 티백의 침출온도나 침출시간에 따라 달라질 수 있는 결과라 생각된다. 또한 전체적으로 살펴보면, 일반적으로 커피가 차보다 많은 양의 카페인을 함유하고 있었다. 그러나 이러한 결과는 이번 실험에 사용된 차와 커피의 종류가 한정되어 있기 때문에 단정짓기는 어렵다.
- 마지막으로 같은 양의 카페인을 함유한 차와 커피가 투여된 그룹을 비교해보면, 10 mg/kg의 카페인을 함유한 차와 커피가 투여된 그룹 사이에서는 운동량에 유의한 차이를 보이지 않았다(p > 0.7).
- 마지막으로 커피와 차를 비교하였을 때, 10 mg/kg 농도에서는 두 그룹 사이에 통계적인 차이가 없었지만(p > 0.757), 30 mg/kg 농도에서는 커피 그룹이 차 그룹보다 이동거리가 유의하게 증가된 결과를 나타냈다(p < 0.01).
- 마지막으로 표준커피시료와 표준차시료에 함유된 카페인의 회수율은 각각 3농도에 대해 실험하였으며, 그 결과 93.4~101.9%, 97.6~115.2%로 양호한 결과를 나타내었다(Table 1).
- 독립표본 t검증을 이용하여 각 그룹을 비교한 결과를 Table 4에 제시하였다. 먼저 대조그룹인 물 그룹과 카페인을 투여한 다른 그룹들 각각을 비교하였을 때, 카페인을 투여한 네 그룹 모두 물 그룹보다 유의하게 이동거리가 증가된 것을 볼 수 있었다. 다음으로 커피와 차에서 농도의 변화에 따른 차이를 살펴보면, 커피 30 mg/kg 그룹이 커피 10 mg/kg 그룹보다 이동거리가 유의하게 증가된 것을 볼 수 있었지만(p < 0.
- 본 연구에서 사용된 HPLC 분석법은 다양한 차와 커피에 함유된 카페인의 함량을 결정하는데 효율적이었으며, 차에 함유된 카페인의 함량은 침출온도와 침출시간이 증가함에 따라 증가하였다. 카페인은 흰 쥐의 운동량 증가에 영향을 미쳤고, 커피에서는 카페인의 농도가 증가함에 따라 운동량이 증가하는 것을 볼 수 있었다.
- 검량선의 농도는 피크 면적비(카페인의 피크 면적/내부표준물질의 피크 면적)로 계산하였고 최소제곱법을 이용하여 회귀직선식을 구하였다. 실험을 통해 얻어진 표준커피시료와 표준차시료의 검량선은 각각 y=0.0012x-0.0544, y=0.0031x-0.0413이었으며, r2은 각각 0.9987, 0.9944로 직선성을 확인할 수 있었다. 최저정량한계는 표준커피시료의 경우 50 µg/ml, 표준차시료의 경우 10 µg/ml로 설정하였다.
- 차와 커피 모두 일내, 일간 정확도 및 정밀도가 ±15% 안에 포함되었고, 회수율도 120% 안에 포함되었다. 이로부터 차와 커피에 함유된 카페인에 대한 본 분석법은 충분한 직선 성과 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있다.
- 21) 이러한 테아닌의 진정작용은 Lu K21) 와 Juneja LR22)의 실험에서 테아닌 섭취 후의 효과를 통해 볼 수 있다. 이와 같은 연구결과와 더불어 이번 실험에서도 차에 함유된 테아닌에 의해 카페인의 작용이 억제되어 차와 커피가 운동량에 미치는 영향에 유의한 차이가 나타났을 것으로 생각된다.
- 차와 커피 모두 일내, 일간 정확도 및 정밀도가 ±15% 안에 포함되었고, 회수율도 120% 안에 포함되었다.
- 8 mg 증가하였다. 침출시간을 5분으로 고정 후 침출온도를 60℃에서 80℃, 100℃로 증가시킨 결과, 카페인의 함량이 평균 12.33 mg, 2.53 mg씩 증가되었다. 침출온도 100℃에서 침출시간을 5분에서 10분으로 증가시킨 결과 카페인의 함량이 평균 1.
- 53 mg씩 증가되었다. 침출온도 100℃에서 침출시간을 5분에서 10분으로 증가시킨 결과 카페인의 함량이 평균 1.2 mg 증가되었다. 침출온도와 침출시간이 증가됨에 따라 차에 함유된 카페인의 양이 증가하였다.
- 과도한 카페인의 섭취는 건강에 해를 줄 수 있으므로 소비자들이 합리적인 선택을 할 수 있도록 카페인이 함유된 제품에 카페인 함량에 대한 정보가 제공되어야 할 필요가 있다고 생각된다. 침출온도와 침출시간에 따른 차와 커피에서 카페인 함량의 차이를 살펴본 결과, 커피에서는 침출온도와 침출시간이 카페인의 함량에 영향을 주지 않았으나, 차에서는 침출온도와 침출시간이 증가할수록 카페인의 함량도 증가하는 것을 볼 수 있었다. Kim HY12)과 Yoon MH18)의 연구에서도 어느 정도까지는 침출온도와 침출시간이 증가함에 따라 차에 함유된 카페인의 함량이 증가하는 결과를 볼 수 있다.
- 본 연구에서 사용된 HPLC 분석법은 다양한 차와 커피에 함유된 카페인의 함량을 결정하는데 효율적이었으며, 차에 함유된 카페인의 함량은 침출온도와 침출시간이 증가함에 따라 증가하였다. 카페인은 흰 쥐의 운동량 증가에 영향을 미쳤고, 커피에서는 카페인의 농도가 증가함에 따라 운동량이 증가하는 것을 볼 수 있었다. 또한 높은 농도의 카페인을 함유한 차와 커피가 투여된 그룹에서는 커피 그룹이 차 그룹과 비교하여 운동량의 증가에 더 큰 영향을 미치는 것을 볼 수 있었다.
- 차와 커피에 함유된 카페인의 함량은 종류에 따라 다양하였다. 티백의 경우 일반적으로 홍차가 녹차보다 카페인 함량이 높았고, 캔으로 판매되는 차보다는 티백 형태로 판매되는 차의 카페인 함량이 더 높은 것으로 나타났다. 그러나 이러한 결과는 티백의 침출온도나 침출시간에 따라 달라질 수 있는 결과라 생각된다.
- 2%이었다. 표준차시료에 함유된 카페인의 일내, 일간 밸리데이션에서 정확도의 평균 범위는 각각 90.5~113.3%, 90.5~107.3%이었고, 정밀도는 각각 1.5~9.2%, 0.2~14.9%이었다(Table 1).
후속연구
- 또한 차 잎 중에는 커피에 함유되어 있지 않은 카테킨(catechin)과 테아닌 (theanine) 성분이 함유되어 있어 이를 통해 카페인의 흡수가 저해되고 생리적 작용이 억제될 것으로 기대되며,12) 이에 따른 카페인의 행동에 대한 효과에 관한 연구가 필요하다.13) 이에 실제 시판중인 커피와 차를 이용하여 동일한 양의 카페인을 함유한 커피와 차를 흰 쥐에게 경구 투여 후 운동량 측정과 특정행동 관찰을 통해 카페인의 행동에 대한 효과를 관찰하고, 카페인의 농도가 증가됨에 따라 그 효과가 달라지는지를 살펴보고, 차와 커피 사이에 효과의 차이가 있는지를 비교해 보고자 한다.
- 그러나 한 종류의 차와 커피를 가지고 실험하였기 때문에 차와 커피가 운동량에 미치는 영향에 대해 결론짓기에는 부족하며, 다른 종류의 차와 커피를 이용한 실험이 필요로 된다. 이번 연구는 카페인이 함유된 차와 커피가 흰 쥐의 운동량에 미치는 영향과 그 차이를 볼 수 있었으며, 전임상 자료로서 추후 카페인이 함유된 차와 커피가 한국 사람에 미치는 영향을 연구하는 임상연구에 활용 가능할 것으로 생각된다.
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