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문제 정의
- 본 연구에서는 한약재로 널리 이용되고 식품소재로 잘 알려진 강황으로부터 curcuminoid를 얻기 위한 정량 및 정성 분석방법으로 RP-HPLC 및 TLC를 쉽게 접근하여 빠르게 분석 및 정제하고,25) 용매 침지(dipping) 추출방법과 초음파 추출법을 비교하며 이용하여 강황에서 curcumin, DMC 및 BDMC를 추출하여 추출량의 최적조건을 제시하였다. 뿐만 아니라, 고체상추출을 적용하여 세 가지 curcuminoid의 분리 및 분석효과를 향상시켜, 효율적인 활성소재 확보를 위한 선택적 추출의 가능성을 검토하였고, 주요 성분인 curcumin의 고순도 분리를 통해 상용공정의 기초데이터를 실험적으로 구하여 비교하였다.
제안 방법
- HPLC 분석조건 및 기기 − HPLC급 시약과 추출된 시료를 농축하기 위해서 회전식 증발기(Heidolph Instruments Laborata 4000 efficient, Germany)를 사용하였다.
- HPLC시스템으로는 Dionex 사의 3000 pump와 injector에는 10 µl sample loop (Dionex, ID × L 0.18 × 550 mm Viper 550 mm, USA)가 연결되었고, 데이터 처리는 Dionex 사의 PC에 설치된 Chromeleon data acquisition system (Dionex version 7.0.1.272)과 HPLC-DAD를 사용하여 정량 및 정성분석을 하였다.
- , USA)을 사용하였다. 강황 분말 1g을 100 ml 비이커에 추출용매 100% 물과 100% 메탄올 50 ml을 각각 초음파 및 침지 추출방법을 이용하여 추출(4시간 동안) 하였다. 이후, 동결 건조된 시료 70 mg을 용매100% MeOH, 10 ml에 녹여 용출시켰으며, 다시 멤브레인 필터(FH-0.
- 강황에서 curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin 등 세 가지 curcuminoid 화합물을 추출하기 위하여 초음파 추출 및 침지 추출방법을 적용하였으며, 고체상추출을 통하여 정제하였고, 역상 액체크로마토그래피 및 박막 크로마토그래피를 이용하여 정성 및 정량 분석을 수행하였다. 초음파 추출은 침지 추출방법보다 추출효율이 높고, 메탄올 용액에서 세 가지 curcuminoid 화합물의 추출효과가 높았으며, 고체상추출을 통함으로 하여 정제효과가 뚜렷하였다.
- 강황에서 curcuminoid를 추출하기 위하여 초음파 추출 및 침지 추출방법을 적용하였으며, 고체상추출을 이용하여 정제하고, 역상 액체 크로마토그래피 및 박막 크로마토그래피를 이용하여 세 가지 성분을 정성 및 정량 분석하였다.
- 고체상추출 − 고체상추출은 물질의 정제방법으로서 일반적으로 사용되고 있으며, 본 연구에서는 역상 C18 고체상추출방법을 적용하였다.
- 따라서 상용공정의 가능성을 확인하기 위하여 추출방법에 따른 고체상추출 사용 전·후를 비교하였다. 고체상추출(SolidPhase Extraction, 이하 SPE)을 하기 위해서 역상 SPE 컬럼 (Prep Sep-C18 Octadecyl cartridge, Fisher Scientific Co., USA)을 사용하였다. 강황 분말 1g을 100 ml 비이커에 추출용매 100% 물과 100% 메탄올 50 ml을 각각 초음파 및 침지 추출방법을 이용하여 추출(4시간 동안) 하였다.
- 따라서 상용공정의 가능성을 확인하기 위하여 추출방법에 따른 고체상추출 사용 전·후를 비교하였다.
- 용매 침지(dipping) 추출방법과 초음파 추출법을 비교하며 이용하여 강황에서 curcumin, DMC 및 BDMC를 추출하여 추출량의 최적조건을 제시하였다. 뿐만 아니라, 고체상추출을 적용하여 세 가지 curcuminoid의 분리 및 분석효과를 향상시켜, 효율적인 활성소재 확보를 위한 선택적 추출의 가능성을 검토하였고, 주요 성분인 curcumin의 고순도 분리를 통해 상용공정의 기초데이터를 실험적으로 구하여 비교하였다.
- 시료의 균일성을 위하여 수분조절 용기(desiccator)에 보관하여 사용하였고, 모든 시료들은 주입하기 전에 막 여과지(PVDF 0.2 µm, Waters co.)를 이용하여 여과를 하였다.
- UV detector는 DAD의 파장범위를 200~500 nm로 하였고, 크로마토그램은 425 nm에서 나타내었다. 이동상은 이성분계 A: 물/아세트산(99.9/0.1, vol.%), B: 아세토나이트릴/아세트산(99.9/0.1, vol.%)을 사용하여 A와 B를 60:40 (vol.%) 비율로 30분 동안 일정용매조성법으로 실험하였다.
- 그러므로 고체상추출 및 크로마토그래피를 사용함에 있어서 메탄올 용액을 사용하면 더 좋은 분석 및 분리효과를 나타낼 수 있다는 것을 알 수 있다. 이상의 결론으로부터 본 연구에서는 고체상추출을 적용함에 있어서 추출용액을 메탄올 용액으로 정하여 사용하였다.
- 2%이었다. 이후, 강황분말 1g을 100 ml 비이커에 추출용매 100% 물, 100% 메탄올, 60% 수용성메탄올을 각각 50 ml씩 첨가하여 초음파 및 침지 추출방법을 이용하여 4시간 동안 추출하였다. 또한, 추출법에서의 침지 추출방법은 일정 온도(23±1℃)에서, 초음파 방법은 bath type (Branson ultrasonic Co.
- 추출물에는 많은 양의 불순물들이 포함되어 있기 때문에 용매 추출 후 여지필터(pore size: 5 µm)에서 감압 여과하여 시료 잔류물과 분리시켰고 이후, 감압 농축 후(10 ml) 동결건조(refrigerated vapor trap) 를 하여 전체 추출 수율을 계산하였다.
대상 데이터
- 고체상추출방법을 적용하였다. Curcumin, DMC, BDMC 등 세 가지 curcuminoid 화합물이 메탄올에 잘 용해되는 점을 고려하여 역상 고체상추출방법이 적합할 것이라고 판단되어 물과 메탄올을 용출용매로 사용하였다. Fig.
- 0 ml/min, 주입부피는 10 µl, 컬럼오븐 온도는 40oC로 고정하였다. UV detector는 DAD의 파장범위를 200~500 nm로 하였고, 크로마토그램은 425 nm에서 나타내었다. 이동상은 이성분계 A: 물/아세트산(99.
- 실험재료 및 시약 − 본 연구에 사용된 강황(Curcuma longa 이하 Turmeric) 시료는 중국 지방에서 재배되었으며, 2011년 3월 ㈜서룡상사/영천현대약업사에서 수입 및 구매하여 한국한의학연구원 한의신약연구그룹에서 2011년 5월 처리된 시료를 사용하였다(Color and appearance specification/ results: dark yellow powder, formonetin content: NLT 0.2%/0.25%, loss on drying: NMT 8%/5%, total heavy metals (As, Pd, Cd, Hg): NMT 10 ppm/1 ppm, total coliforms: not detected).
- )를 이용하여 여과를 하였다. 용매는 HPLC급(99.9%)으로 메탄올, 아세토나이트릴, 아세트산은 J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, U.S.A.)에서 구입하였으며, 물은 2차 증류수(Division of Millipore, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다. Curcumin의 표준시료(순도: 80%) 4 mg을 고순도 메탄올 20 ml를 취하여 200 ppm의 표준원액을 제조하였다.
- 용매추출법 − 추출은 일정한 상온에서 수행하였으며, 건조 분쇄된 시료는 입자를 체 거름(30 µm)으로 분별하여 시료로 사용하였고 수분 함유량은 11.2%이었다.
- 4(B)는 초음파 추출 및 침지 추출방법을 적용하여 추출한 용액의 UV 흡수파장을 표준물질 및 피크 #1, #2, #3과 비교하여 나타낸 그림이다. 초음파 추출 및 침지 추출방법을 적용한 추출 용액 및 피크 #1, #2, #3의 최대 흡수파장은 425 nm였으며, 크로마토그래피 분석에서도 이 파장을 사용하였다. 이상의 결과로부터 피크 #1, #2, #3이 각각 curcumin, DMC, BDMC라는 것을 알 수 있다.
- 추출효과 − 강황에서 curcuminoid를 추출하고, 그 추출효율에 관한 용매의 영향을 고찰하기 위하여 물, 메탄올 및 메탄올 수용액(60%)을 사용하였으며, 정제 과정을 Fig. 1에 나타내었다.
- 25%, loss on drying: NMT 8%/5%, total heavy metals (As, Pd, Cd, Hg): NMT 10 ppm/1 ppm, total coliforms: not detected). 표준시료인 curcumin은 Sigma 사 (Shanghai, China)에서 구입하였다. 시료의 균일성을 위하여 수분조절 용기(desiccator)에 보관하여 사용하였고, 모든 시료들은 주입하기 전에 막 여과지(PVDF 0.
성능/효과
- 이중에서도 초음파 추출은 천연물 산업의 적용에 매우 효율적이다.19) 초음파 추출공정은 추출시간이 매우 중요하며,20) 시료물질에 미치는 영향은 고주파와 저주파의 사용에 따라 캐비테이션의 강도, 즉 기포(bubble)의 크기 및 에너지의 세기가 달라지며,21) 파장의 침투력이 미세부분의 조직까지 쉽게 침투하여 추출효과를 향상 시킬 수 있다.22,23)또한, 고체상추출은 정제방법 중 하나로 사용되고 있으며, 일반적으로 사용되는 액체-액체 추출보다 추출시간이 짧고, 회수율이 높으며, 유기용매의 필요량이 적고, 정밀도와 정확성이 높고, 조작이 간편하다는 장점을 가지고 있기에 분석방법 중 하나로 일반적으로 사용되고 있다.
- 1) 이중에서 강황은 열대 지방 및 중국의 남부지방에 자생, 재배하는 생강과의 다년생 초본으로, 본초학에서는 강황을 생약으로 사용할 때 성질이 따뜻해서 혈액순환을 촉진시키고 통증을 제거하는 효과가 탁월하다고 알려져 있다.2) 또한, 강황은 상처를 아물게 하고, 소화를 촉진시키고, 항암, 항염, 항박테리아 및 항산화효과가 있으며, 간을 보호하는 작용을 가지고 있다.3-5) 강황의 이러한 생리활성 효과는 강황에 포함된 에센스 오일과 curcuminoid의 색소성분의 작용에 의한 것으로 그 중에서도 curcuminoid의 약리효과가 뚜렷하며, 의학 분야를 중심으로 각종 염증, 혈중지질 강하, 항 돌연변이, 항종양 등에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
- 이상의 결과로부터 피크 #1, #2, #3이 각각 curcumin, DMC, BDMC라는 것을 알 수 있다. 또한, curcumin, DMC, BDMC의 분자량이 각각 368, 338, 308으로서 분자량 순서에 따라 용출되는 크로마토그래피의 일반적인 성질에 적합하다. Fig.
- 또한, 추출법에서의 침지 추출방법은 일정 온도(23±1℃)에서, 초음파 방법은 bath type (Branson ultrasonic Co., Model No:5510R-MTH, Overall size: W 16 mm × L 15.5 mm × H 14.5 mm, Reactor size: W 11.5 mm × L 9.5 mm × H 6 mm, Frequency: 40 kHz, Intensity: 135 Watt, Input solvent: water 9.5 L)으로 반응기 내 물의 초기온도(19±1℃)에서 시작하여 최대(49±1℃) 까지 증가하였다.
- 6에서도 각각 표준물질과 피크 #1, #2, #3의 박막 크로마토그래피 및 역상 액체 크로마토그래피를 이용한 분석결과를 나타낸 것이다. 이상의 결과로부터, 강황에서 curcumin, DMC, BDMC 등 세 가지 curcuminoid 화합물을 추출하였으며, 고체상추출은 분석효과를 향상할 수 있다는 것을 알 수 있다.
- 강황에서 curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin 등 세 가지 curcuminoid 화합물을 추출하기 위하여 초음파 추출 및 침지 추출방법을 적용하였으며, 고체상추출을 통하여 정제하였고, 역상 액체크로마토그래피 및 박막 크로마토그래피를 이용하여 정성 및 정량 분석을 수행하였다. 초음파 추출은 침지 추출방법보다 추출효율이 높고, 메탄올 용액에서 세 가지 curcuminoid 화합물의 추출효과가 높았으며, 고체상추출을 통함으로 하여 정제효과가 뚜렷하였다. 따라서 본 연구의 결과는 항산화, 혈압 조절 및 항피로제의 기초연구로써 활용될 것이며, 강황을 비롯한 천연물의 기초자료로 널리 응용될 것으로 사료된다.
- 1에 나타내었다. 침지 추출방법과 초음파 추출방법을 비교해 볼때, 초음파 추출을 이용한 추출효과가 침지 추출방법을 이용한 것보다 높다는 것을 알 수 있다(Table I). 이것은 초음파 에너지가 더욱 증가하면 액의 분자간 응집력이 파괴되고 미세한 케비테이션(기포가 생성되는 현상)인 공동(cavity)이 발생되며, 이 공동이 폭발하면서 발생하는 강력한 에너지 방출에 의한 것으로 알 수 있다.
- 2에서도 보여주고 있다. 침지 추출방법을 사용하든 초음파 추출을 사용하든, 메탄올 용액을 사용하였을 때, 물 혹은 메탄올 수용액을 사용하였을 때보다 더 높은 intensity를 가지며, 피크높이 및 피크면적이 더 크다는 것을 알 수 있다. 그러므로 고체상추출 및 크로마토그래피를 사용함에 있어서 메탄올 용액을 사용하면 더 좋은 분석 및 분리효과를 나타낼 수 있다는 것을 알 수 있다.
- 3에서는 고체상추출을 적용하지 않았을 때와 고체상추출을 적용하였을 때의 세 가지 curcuminoid 화합물의 크로마토그래피를 나타내었다. 침지 추출방법을 적용한 후 크로마토그래피 분석을 하였을 때, 동일한 intensity에서 고체상추출을 적용함으로써 피크높이 및 피크면적이 현저히 늘어난 것을 알 수 있다(Fig. 3(A)와 (C) 및 Table I).
후속연구
- 초음파 추출은 침지 추출방법보다 추출효율이 높고, 메탄올 용액에서 세 가지 curcuminoid 화합물의 추출효과가 높았으며, 고체상추출을 통함으로 하여 정제효과가 뚜렷하였다. 따라서 본 연구의 결과는 항산화, 혈압 조절 및 항피로제의 기초연구로써 활용될 것이며, 강황을 비롯한 천연물의 기초자료로 널리 응용될 것으로 사료된다.
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