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문제 정의
- 따라서 전국에서 수집한 다양한 김치로부터 β-glycosidase 활성을 보유한 유산균을 분리 동정하고, 발효과정 중에 인삼유래 사포닌을 전환하는 균주를 선별하여 인삼 사포닌의 영양학적․기능적 가치를 증진시키고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- β-glycosidase 활성 유산균을 분리하기 위하여 30℃에서 1～2일 간 배양한 후 black zone이 나타나는 유산균 집락을 선별하였다.
- 5까지 낮아졌다. L. brevis THK-D57의 생육은 발효 3시간 이후 활발하게 진행되어 18시간에 최고의 생육을 보였으며, 이후 정체기에 진입하였다. 발효 중 pH와 균체 농도의 변화는 Fig.
- L. brevis THK-D57의 인삼 사포닌 전환활성을 검토하기 위하여 MRS 액체 배지에서 18시간 동안 배양한 후, 12,000 rpm의 속도로 10분간 원심분리하여 얻은 상등액을 조효소액으로 사용하여 ginsenoside Rb1에 반응한 결과를 Fig. 4와 Fig. 5에 나타내었다. 기질로 사용한 ginsenoside Rb1이 반응 시간이 증가함에 따라 감소되어 중간 대사체인 ginsenoside Rd로 전환되는 양상을 보였다.
- brevis와 가장 높은 상동성을 보였다. Lactobacillus genus 내에 속한 표준 균주의 16s rRNA gene 염기서열을 수집하여 Clustal X program과 Bioedit program을 이용하여 편집한 후 phylogentic tree를 작성하였다(Fig. 2). Strain THK-D57은 16s rRNA 염기서열에서 L.
- RP-HPLC를 이용한 사포닌 대사체 분석을 위해서 HPLC 분석용 column으로 C18(250×4.6 ㎜, ID 5 ㎛, Waters, USA)을 이용하였으며, 이동상으로 acetonitrile(solvent A)와 증류수(solvent B)를 사용하여 1.2 ㎖/min의 유속으로 농도 구배를 주어 분석하였다.
- S, standard ginsenoside; 1, 0 day; 2, 3 days; 3, 6 days;4, 9 days; 5, 12 days; 6, 15 days; 7, 20 days.
- 분리 균주를 MRS 액체 배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 균의 생육을 검토하였다. 균의 생장 변화를 알아보기 위해 UV/VIS spectrophotometer DUⓡ530(Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, USA)을 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 발효 중 pH의 변화는 MP 220 pH meter(Mettler Toledo, Zurich, Switzerland)를 이용하여 측정하였다.
- 균주 동정을 위해 MRS 평판배지에 균주를 획선도말하여 30℃ 항온배양기에서 24시간 배양한 후 16S rRNA gene 염기서열 분석을 분석기관(Solgent Co., Ltd, Korea)에 의뢰하여 실시하였다. 분석된 염기서열은 NCBI database를 이용하여 표준 균주(type strain)와의 유사도(similarity)를 확인했으며, 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 표준 균주의 염기서열을 수집하였다.
- 균주의 형태학적 특성을 분석하기 위하여 현미경(BX50, Olympus, Japan)을 이용하였으며, 생화학적 특성분석을 위해 Gram 염색법과 과산화수소 산소발생반응을 이용한 catalase 활성 측정법, 그리고 API 50CH kit(bioMerieux Co., Craponne, France)를 이용한 당 이용성 검정을 실시하였다.
- 0)에 현탁하여 효소 반응을 수행하였다. 기질로 protopanaxadiol(PPD) 계열의 고분자 진세노사이드인 Rb1을 사용하였으며, 30℃ 진탕 배양기에서 120 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시킨 후 박층 크로마토그래피(TLC) 및 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 분석하였다.
- 김치에서 분리된 유산균의 인삼 사포닌 전환활성을 TLC 및 RP-HPLC를 이용하여 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
- 유산균의 분리를 위하여 Bui 등(2011)의 방법을 변형하였다. 먼저 수집한 시료 10 g을 10 ㎖의 멸균 생리 식염수에 혼합하여 무균적으로 잘게 다진 다음 그 중 1 g의 시료액을 취하여 9 ㎖의 멸균 생리 식염수에 현탁하고, 순차적으로 희석하여 0.1%(w/v) esculin과 0.05%(w/v) ferric citrate가 첨가된 Lactobacilli MRS 평판 배지(Dfico, USA: 1% bacto peptone, 1% beef extract, 0.5% yeast extract, 2% glucose, 0.1% polysorbate 80, 0.5% sodium acetate, 0.2% ammonium citrate, 0.2% K2HPO4, 0.02% MgSO4․7H2O, 0.02% MnSO4․4H2O, 1.5% agar powder 1.5%)에 도말하였다. β-glycosidase 활성 유산균을 분리하기 위하여 30℃에서 1～2일 간 배양한 후 black zone이 나타나는 유산균 집락을 선별하였다.
- 발효에 의한 사포닌 전환활성을 확인하기 위하여, Rb1, Rc, Rd가 혼합된 PPD 계열의 사포닌을 200 ppm이 되게 혼합한 MRS 액체배지에 균주를 1%(v/v) 접종하여 30℃에서 정치 배양한 후, 박층크로마토그래피를 이용하여 분석하였다.
-
4. 균주의 생육 패턴 분석
분리 균주를 MRS 액체 배지에 접종하여 30℃에서 배양하면서 균의 생육을 검토하였다. 균의 생장 변화를 알아보기 위해 UV/VIS spectrophotometer DUⓡ530(Beckman Instruments, Inc.
- 분리 균주의 인삼 사포닌 전환 능력을 검토하기 위하여 MRS 액체 배지에서 배양한 배양액을 12,000 rpm의 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후 냉각한 아세톤을 이용하여 단백질을 침전시켰으며, 침전된 단백질을 0.1 mM phosphate buffer(pH 7.0)에 현탁하여 효소 반응을 수행하였다. 기질로 protopanaxadiol(PPD) 계열의 고분자 진세노사이드인 Rb1을 사용하였으며, 30℃ 진탕 배양기에서 120 rpm으로 교반하여 24시간 동안 반응시킨 후 박층 크로마토그래피(TLC) 및 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 분석하였다.
- , Ltd, Korea)에 의뢰하여 실시하였다. 분석된 염기서열은 NCBI database를 이용하여 표준 균주(type strain)와의 유사도(similarity)를 확인했으며, 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 표준 균주의 염기서열을 수집하였다. 각 염기서열은 Clustal X program(Thompson 등 1997)을 이용하여 정렬하고, Bioedit program을 이용하여 편집하였으며(Hall TA 1999), MEGA4 program(Kumar 등 2008)의 neighbor-joining방법(Saitou & Nei 1987)으로 계통학적 위치를 결정하였다.
- 인삼 유래 사포닌 전환활성을 보유한 유산균을 분리하기 위하여 전국의 가정집에서 배추김치, 총각김치, 갓김치 등 다양한 종류의 김치를 수집한 후 Esculin법을 이용하여 βglycosidase 활성을 가진 THK-D57 균주를 분리하였다.
대상 데이터
- L. brevis THK-D57의 생육패턴을 확인하기 위해 MRS 액체 배지를 사용하여 배양하였다. 배양 초기의 pH는 6.
- 먼저 반응물은 같은 부피의 수포화 부탄올을 이용하여 사포닌을 추출하여 분석용 시료로 사용하였다. 반응 산물은 TLC plate(Silica gel 60 F254 Merck, Darmstadt, Germany)에 점적한 후, CHCl3- MeOH-H2O(65:35:10; v/v/v)를 전개용매로, 10%(v/v) 황산(H2SO4) 용액을 발색시약으로 사용하였다.
- 인삼 사포닌 전환능력을 갖는 유산균을 분리하기 위해 전국 각지의 가정에서 담근 김치를 수집하여 사용하였다.
이론/모형
- 각 염기서열은 Clustal X program(Thompson 등 1997)을 이용하여 정렬하고, Bioedit program을 이용하여 편집하였으며(Hall TA 1999), MEGA4 program(Kumar 등 2008)의 neighbor-joining방법(Saitou & Nei 1987)으로 계통학적 위치를 결정하였다.
성능/효과
- 6에 나타내었다. L. brevis THK-D57의 배양 6일 이후 TLC plate의 ginsenoside Rd를 나타내는 spot이 뚜렷하게 나타났으며, 저분자 진세노사이드인 ginsenoside F2로의 전환이 일부 관찰되었다. 배양 9일 이후 가장 분자량이 작은 저분자 진세노사이드인 compound K(CK)로의 전환이 관찰되었으며, 배양 12일 후에는 첨가된 ginsenoside Rb1의 감소가 확연하게 보였다.
- THK-D57은 Gram 양성, catalase 음성이며, 포자를 형성하지 못하는 간균으로 확인되었으며, API 50CH kit를 이용하여 분석한 결과, strain THK-D57은 Lactobacillus brevis와 99.4%의 상동성을 보였다(Table 1).
- 1에 나타냈다. THK-D57의 16s rRNA gene sequence를 NCBI database에서 표준 균주들과 비교하여 상동성을 검토한 결과, L. brevis와 가장 높은 상동성을 보였다. Lactobacillus genus 내에 속한 표준 균주의 16s rRNA gene 염기서열을 수집하여 Clustal X program과 Bioedit program을 이용하여 편집한 후 phylogentic tree를 작성하였다(Fig.
- 5에 나타내었다. 기질로 사용한 ginsenoside Rb1이 반응 시간이 증가함에 따라 감소되어 중간 대사체인 ginsenoside Rd로 전환되는 양상을 보였다.
- 따라서 L. brevis THK-D57는 발효 중에 생산되는 효소에 의하여 고분자 진세노사이드인 ginsenoside Rb1을 ginsenoside Rd, ginsenoside F2를 거쳐 최종적으로 compound K로 전환시키는 것으로 사료된다(Fig. 7).
- 따라서 본 연구에서는 김치에서 β-glycosidase 활성을 가진 Lactobacillus brevis THK-D57를 분리․동정하였으며, 분리 균주를 이용하여 효소 분해 및 발효법을 통하여 기질로 첨가된 고분자 진세노사이드인 ginsenoside Rb1을 ginsenoside Rd, ginsenoside F2, C-K 등으로 전환시키는 것을 확인하였다.
- 배양 9일 이후 가장 분자량이 작은 저분자 진세노사이드인 compound K(CK)로의 전환이 관찰되었으며, 배양 12일 후에는 첨가된 ginsenoside Rb1의 감소가 확연하게 보였다. 배양 20일에서는 ginsenoside Rb1이 모두 저분자화 되어 spot이 사라지고 ginsenoside Rd, ginsenoside F2, C-K 등으로 전환되었음을 확인하였다.
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