Lactobacillus brevis LH8이 생산하는 효소에 의한 Ginsenoside Rd의 Compound K로의 전환 Conversion of Ginsenoside Rd to Compound K by Crude Enzymes Extracted from Lactobacillus brevis LH8원문보기
인삼사포닌 ginsenoside는 인삼의 주요한 약리성분으로 인삼을 경구투여 시 major 사포닌의 생체 내에서의 흡수는 매우 낮아 인삼사포닌의 약효를 증대시키기 위해서 기존에 많이 존재하는 major 사포닌을 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 minor 사포닌으로의 전환이 요구된다. 본 연구는 김치에서 분리한 ${\beta}-glucosidase$ 활성균주 L. brevis LH8이 분비하는 효소를 이용하여 ginsenoside Rd를 compound K로 전환시켰다. L. brevis LH8의 효소액은 반응 온도 $30^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 좋았고 $35^{\circ}C$이상에서는 활성이 급격히 저하되었으며, pH $6.0{\sim}12.0$ 사이에서 효소활성이 가장 좋았고, pH 5.0 이하 및 pH 13.0 이상에서는 활성도가 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 ginsenoside Rd는 반응 48시간부터 ginsenoside F2로 전환되기 시작하였으며, 반응 72 시간 이후에는 대부분 compound K로 전환되었다.
인삼사포닌 ginsenoside는 인삼의 주요한 약리성분으로 인삼을 경구투여 시 major 사포닌의 생체 내에서의 흡수는 매우 낮아 인삼사포닌의 약효를 증대시키기 위해서 기존에 많이 존재하는 major 사포닌을 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 minor 사포닌으로의 전환이 요구된다. 본 연구는 김치에서 분리한 ${\beta}-glucosidase$ 활성균주 L. brevis LH8이 분비하는 효소를 이용하여 ginsenoside Rd를 compound K로 전환시켰다. L. brevis LH8의 효소액은 반응 온도 $30^{\circ}C$에서 효소활성이 가장 좋았고 $35^{\circ}C$이상에서는 활성이 급격히 저하되었으며, pH $6.0{\sim}12.0$ 사이에서 효소활성이 가장 좋았고, pH 5.0 이하 및 pH 13.0 이상에서는 활성도가 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 ginsenoside Rd는 반응 48시간부터 ginsenoside F2로 전환되기 시작하였으며, 반응 72 시간 이후에는 대부분 compound K로 전환되었다.
Ginsenosides have been regarded as the principal components responsible for the pharmacological and biological activities of ginseng. Absorption of major ginsenosides from the gastrointestinal tract is extremely low, when ginseng is orally administered. In order to improve absorption and its bioavai...
Ginsenosides have been regarded as the principal components responsible for the pharmacological and biological activities of ginseng. Absorption of major ginsenosides from the gastrointestinal tract is extremely low, when ginseng is orally administered. In order to improve absorption and its bioavailability, conversion of major ginsenosides into more active minor ginsenoside is very much required. Here, we isolated lactic acid bacterium (Lactobacillus brevis LH8) having ${\beta}-glucosidase$ activity from Kimchi. Bioconversion ginsenoside Rd by this bacterium in different temperatures was investigated. The maximum activities of crude enzymes precipitated by ethanol were shown in $30^{\circ}C$ and then gradually decreased. In order to compare the effect of pH, the crude enzymes of L. brevis LH8 were mixed in 20mM sodium phosphate buffer (pH 3.5 to pH 8.0) and reacted ginsenoside Rd. Ginsenoside Rd was almost hydrolyzed between pH 6.0 and pH 12.0, but not hydrolyzed under pH 5.0 and above pH 13.0. Ginsenoside Rd was hydrolyzed after 48 h incubation, whereas ginsenoside F2 appeared from 48 h to 72 h, and ginsenoside Rd was almost converted into compound K after 72 h.
Ginsenosides have been regarded as the principal components responsible for the pharmacological and biological activities of ginseng. Absorption of major ginsenosides from the gastrointestinal tract is extremely low, when ginseng is orally administered. In order to improve absorption and its bioavailability, conversion of major ginsenosides into more active minor ginsenoside is very much required. Here, we isolated lactic acid bacterium (Lactobacillus brevis LH8) having ${\beta}-glucosidase$ activity from Kimchi. Bioconversion ginsenoside Rd by this bacterium in different temperatures was investigated. The maximum activities of crude enzymes precipitated by ethanol were shown in $30^{\circ}C$ and then gradually decreased. In order to compare the effect of pH, the crude enzymes of L. brevis LH8 were mixed in 20mM sodium phosphate buffer (pH 3.5 to pH 8.0) and reacted ginsenoside Rd. Ginsenoside Rd was almost hydrolyzed between pH 6.0 and pH 12.0, but not hydrolyzed under pH 5.0 and above pH 13.0. Ginsenoside Rd was hydrolyzed after 48 h incubation, whereas ginsenoside F2 appeared from 48 h to 72 h, and ginsenoside Rd was almost converted into compound K after 72 h.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
본 연구에서는 김치 유산균을 이용한 인삼사포닌 변환기술을 개발하여 기능성 식품소재로 활용할 수 있는 compound K를 대량 생산하고자 실험을 수행하였다.
제안 방법
10개 지역에서 수집한 배추김치 시료를 멸균수로 10-1~10-3 희석하고 MRS agar plate에 100 pd씩 smear한 후 30oC에서 24시간 배양하여 유산균을 100주 분리하였다. 분리된 유산균들은 esculin agar법14)을 이용하여 P-glucosidase 활성균주를 선발하였다.
Esculin 방법을 이용하여 김치에서 분리한 P-glucosidase 활성을 가진 LH8 균주를 MRS 배지를 사용하여 37oC, 190 rpm에서 현탁 배양하였다. 균배양액은 4oC에서 15,000 x g로 10분 원심분리 하여 세포를 제거하고 상층액은 4배의 냉각 EtOH을 첨가하여 충분히 혼합시킨 후 이에서 40분 방치하여 단백질을 침전시켰다.
Ginsenoside Rd의 전환효소의 최적 반응 온도를 알기 위해 온도 별로(25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 50oC, 60oC) 60시간 반응시켜 그 결과를 확인하였다(Fig. 5). LH8 균주의 조효소액과 Rd의 반응은 Fig.
6 ml/min, UV detector로 203 nm에서 측정하였다. Gradient 조건은 solvent A/solvent B: 15/85, 21/79, 58/42, 90/10, 90/10, 15/85, 15/85; run time: 0-5, 5-25, 25-70, 70-72, 72-82, 82-84, 84-100 min 로 하였다.
L. brevis LH8이 생산하는 효소에 의한 ginsenoside Rd의전환을 HPLC를 이용하여 확인하였다. Fig.
LH8 균주를 MRS broth에서 호기성 조건하에서 37oC, 190 rpm에서 O.D600 1.0되게 배양한 후 조효소액을 조제하여 0.2 mM ginsenoside Rd와 시간 별로 24시간부터 72시간까지 24시간 간격으로 반응시켰다. Fig.
1). Lactobacillus genus 내에 속해있는 모든 species들의 type strain의 16S rRNA gene 염기서열을 조사하여 Bioedit program과 Clustal X program을 이용하여 alignment한 후 MEGA3 program으로 phylogenetic tree를 그려 본 후, 이들 중 LH8 균주와 가까운 유연관계에 있는 species들을 선별하여 다시 phylogenetic tree를 작성하였다(Fig. 1). LH8 균주는 Lactobacillus brevisT M58810와 99% 상동성을 나타내어 최종 Lactobacillus brevis LH8로 동정하였다.
2 mM ginsenoside Rd와 1:2 (v/v)의 비율로 혼합하고 30oC, 190 rpm에서 72시간 반응시켰다. 반응과정 중 24시간 간격으로반응혼합물을 1.5 m 씩 취하여 동량의 수포화부탄올로 추출하고 TLC plate에 점적하여 Rd의 전환여부를 확인하였다. 점적한 TLC plate를 CHCl3/MeOH/H2O(65:35:10, v/y 하층) 혼합용매로 5.
본 연구는 김치에서 분리한 P-glucosidase 활성균주 L. brevis LH8이 분비하는 효소를 이용하여 ginsenoside Rd를 compound K로 전환시켰다. L.
사용하여 인삼잎 사포닌으로부터 분리하였다. 인삼잎 사포닌 1 g을 MeOH 에 녹인 후 먼저 flash chromatography system(RP-18; Discovery supelco, ①4.6 mm x 25 cm)을이용하여 acetonitrile과 HPLC용 증류수를 이동상으로 실온에서 아래와 같은 gradient 조건으로 분리하였다. 처음에 10% acetonitrile로 시작하여 20분까지는 30%로 순차적으로 늘려주었으며, 20분에서 30분까지는 30%를 유지시켰고, 30분에서 45분까지 45%로 순차적으로 늘려주었으며, 45분에서 50 분까지 45%를 유지하였다.
대상 데이터
, Ltd. NS 3000i system을 사용하였다.
경기도 10개 지역에서 수집하였다. 인삼 사포닌 지표 물질 Rb1, F2, Rg3, compound K 및 Rh2는 인삼 유전자 소재 은행에서 분양받아 사용하였고 Rd는 본 연구실에서 분리한 것을 사용하였으며 TLC plate는 60 F-254 Silica gel plate (Merck)를 사용하였고, HPLC 기기는 Futecs Co., Ltd. NS 3000i system을 사용하였다.
인삼잎 사포닌은 중국 Fusong에서 구입하여 사용하였고, 배추김치는 경기도 10개 지역에서 수집하였다. 인삼 사포닌 지표 물질 Rb1, F2, Rg3, compound K 및 Rh2는 인삼 유전자 소재 은행에서 분양받아 사용하였고 Rd는 본 연구실에서 분리한 것을 사용하였으며 TLC plate는 60 F-254 Silica gel plate (Merck)를 사용하였고, HPLC 기기는 Futecs Co.
이론/모형
24시간 배양하여 유산균을 100주 분리하였다. 분리된 유산균들은 esculin agar법14)을 이용하여 P-glucosidase 활성균주를 선발하였다.
성능/효과
Esculin 방법을 이용하여 김치에서 분리한 P-glucosidase 활성을 가진 LH8 균주의 16S rRNA sequence를 NCBI에서 BLAST를 이용하여 등록된 균주들과의 상동성을 비교한결과 Lactobacillus와 가장 높은 상동성을 나타내었다(Fig. 1). Lactobacillus genus 내에 속해있는 모든 species들의 type strain의 16S rRNA gene 염기서열을 조사하여 Bioedit program과 Clustal X program을 이용하여 alignment한 후 MEGA3 program으로 phylogenetic tree를 그려 본 후, 이들 중 LH8 균주와 가까운 유연관계에 있는 species들을 선별하여 다시 phylogenetic tree를 작성하였다(Fig.
2 mM ginsenoside Rd와 시간 별로 24시간부터 72시간까지 24시간 간격으로 반응시켰다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 ginsenoside Rd는 시간이 경과되면서 점차 감소하고 중간 산물인 ginsenoside F2는 그 양이 증가하다가 60 시간 이후로 점차 감소되었으며, 반응시간 72 시간 이후에는 ginsenoside Rd는 전부 분해되어 ginsenoside F2와 compound K로 전환되는 것을 관찰할 수 있었다.
brevis LH8이 분비하는 효소를 이용하여 ginsenoside Rd를 compound K로 전환시켰다. L. brevis LH8의 효소액은 반응온도 30oC 에서 효소활성이 가장 좋았고 35oC 이상에서는 활성이 급격히 저하되었으며, pH 6.0~12.0 사이에서 효소 활성이 가장 좋았고, pH 5.0 이하 및 pH 13.0 이상에서는 활성 도가 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 ginsenoside Rd는 반응 48시간부터 ginsenoside F2로 전환되기 시작하였으며, 반응 72 시간 이후에는 대부분 compound K로 전환되었다.
6B에 나타냈다. LH8의 조효소액은 pH 6.0- 12.0에서 높은 활성을 나타내었고 그 중 pH 10.0에서 가장높은 ginsenoside Rd의 전환활성을 나타내었으며, pH 6.0 이하 및 pH 12.0 이상에서는 활성도가 70% 이하로 떨어지는 것을 관찰할 수 있었다. 이것은 이미 알려진 인삼사포닌가수분해효소인 A.
5에서 보다시피 온도의 영향을크게 받는다. TLC분석에서 LH8의 조효소액의 활성은 30oC 에서 가장 뛰어나며, 25oC와 35oC 이상의 온도에서는 효소의활성이 급격히 저하되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5A). 효소에 의한 반응은 일반 화학반응에 비해 활성화 에너지가매우 크다.
5B). 즉효소의 활성은 30oC에서 가장 높은 활성을 보였고 25oC 이하 및 35oC 이상의 온도에서는 활성이 급격히 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이는 인삼사포닌의 가수분해효소인 R.
따라서인삼사포닌의 약효를 증대시키기 위해서 기존에 많이 존재하는 major 사포닌을 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더뛰여난 minor 사포닌으로의 전환이 요구된다. 현재 인삼사포닌의 전환연구는 여러가지 방법이 있지만 그 중에서도 효소에 의한 전환은 상온과 상압 및 중성에 가까운 pH 에서 반응을 진행할 수 있고 효소의 기질특이성으로 특정사포닌의 생산이 가능하여 많은 연구가 이루어 졌다2V 본 실험에서는 5-glucosidase 활성을 가지는 미생물을 이용하여 인삼사포닌을 변환시키고자 하는 실험으로 상용으로 사용되고 있는 한국전통음식인 김치로부터 유산균을 분리하여 16S rRNA sequence를 이용하여 동정하였으며 활성도를 조사한 결과 본미생물에서 분비된 효소는 인삼사포닌 Rd를 F2를 걸쳐 compound K로 변환시킨것을 확인할 수 있었다. 따라서 추후인삼 엑스등을 이용하여 본 미생물을 사용한다면 부가가치가높은 인삼사포닌을 가지는 식품을 만들 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
현재 인삼사포닌의 전환연구는 여러가지 방법이 있지만 그 중에서도 효소에 의한 전환은 상온과 상압 및 중성에 가까운 pH 에서 반응을 진행할 수 있고 효소의 기질특이성으로 특정사포닌의 생산이 가능하여 많은 연구가 이루어 졌다2V 본 실험에서는 5-glucosidase 활성을 가지는 미생물을 이용하여 인삼사포닌을 변환시키고자 하는 실험으로 상용으로 사용되고 있는 한국전통음식인 김치로부터 유산균을 분리하여 16S rRNA sequence를 이용하여 동정하였으며 활성도를 조사한 결과 본미생물에서 분비된 효소는 인삼사포닌 Rd를 F2를 걸쳐 compound K로 변환시킨것을 확인할 수 있었다. 따라서 추후인삼 엑스등을 이용하여 본 미생물을 사용한다면 부가가치가높은 인삼사포닌을 가지는 식품을 만들 수 있을 것으로 생각된다.
참고문헌 (21)
Benishin, C. G. : Actions of ginsenoside Rb1 on choline uptake in central cholinergic nerve endings. Neurochem. Int. 21(1), 1-5 (1992)
Saito, H. and Nishiyama, N. : Effect of ginseng and its saponins on experimental amnesis in mice and on cell cultures of neurons. p. 92-98. In: Proc. 5th Int'l. Ginseng Symp. Seoul, Korea. (1988)
Kikuchi, Y., Sasa, H., Kita, T., Hirata, J. and Tode, T. : Inhibition of human ovarian cancer cell proliferation in vitro by ginsenoside-Rh2 and adjuvant effects of cisplatin in vivo. Anticancer Drugs(England). 2(1), 63-67 (1991)
Singh, V. K., Agarwal, S. S. and Gupta, B. M. : Immunomodulatory activity of Panax ginseng extract. p. 225-232. In: Proc. 4th Int'l. Ginseng Symp. Seoul, Korea. (1984)
Huo, Y. and Chen. Y. : The effect of Panax ginseng extract (GS) on insulin and corticosteroid receptors. J. Traditional Chinese Medicine. 8(4), 293-295 (1998)
Liu, X., Cui, Y. and Yang, L. :Roles of glycosidase in drug discovery and development. Tian Ran Chan Wu Yan Jiu Yu Kai Fa. 17(2), 223-228 (2005)
Akao, T. : Metabolic activation of crude drug components by intestinal bacterial enzymes. Med. Pharm. Soc. 9, 1-13 (1992)
Dreessen, M., Eyssen, H. and Lemli. J. : The metabolism of sennosides A and B by the intestinal microflora: in vitro and in vivo studies on the rat and the mouse. J. Pharm. Pharmacol. 33(10), 679-681 (1981)
Shin, J. E., Park, E. K., Kim, E. J., Hong, Y. H., Lee, K. T. and Kim, D. H. : Cytotoxicity of compound K (IH-901) and ginsenoside Rh2, Main biotransformants of ginseng saponins by bifidobacteria, against some tumor cells. Ginseng Res. 27, 129-134 (2003)
Zhou, W., Feng, M. Q., Li, J. Y. and Zhou, P. : Studies on the preparation, crystal structure and bioactivity of ginsenoside compound K. Journal of Asian Natural Products Research. 8(6), 519-527 (2006)
Bae, E. A., Kim, N. Y., Han, M. J., Choo, M. K. and Kim, D. H. :Transformation of ginsenoside to compound K (IH-901) by lactic acid bacteria of human intestine. J. Microbiol. Biotechnol. 13(1), 9-14 (2003)
Chi, H., Kim, D. H. and Ji, G. E. : Transformation of ginsenosides Rb2 and Rc from Panax ginseng by food microorganisms. Biol Pharm Bull. 28(11), 2102-2105 (2005)
Cheng, L. Q., Kim, M. K., Lee, J. W. and Yang, D. C. : Conversion of major ginsenoside Rb1 to ginsenoside F2 by Caulobacter leidyia. Biotechnol. Lett. 28, 1121-1127 (2006)
Karikura, M., Miyase,T., Tanizawa, H., Taniyama, T. and Takino, Y. : Studies on absorption, distribution, excretion and metabolism of ginseng saponins. VII. Comparison of the decomposition modes of ginsenoside-Rb1 and Rb2 in the digestive tract of rats. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 39(9), 2357-2361 (1991)
Park, S. Y., Bae, E. A., Sung, J. H., Lee, S. K. and Kim, D. H. : Purification and characterization of ginsenoside Rb1-metabolizing beta-glucosidase from Fusobacterium K-60, a human intestinal anaerobic bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 65(5), 1163-1169 (2001)
Zhang, C., Yu, H., Bao, Y., An, L. and Jin, F. : Purification and characterization of ginsenoside-beta-glucosidase from ginseng. Chem. Pharm. Bull. 49(7), 795-798 (2001)
Wang, B. X., Cui, J. C., Liu, A. J. and Wu, S. K. : Studies on the anti-fatigue effect of the saponins of stems and leaves of Panax ginseng (SSLG). J Tradit Chin Med. 3(2), 89-94 (1983)
Kim, S. D. and Seu, J. H. : Enzymatic properties of the convertible enzyme of ginseng aaponin produced from Rhizopus japonicus. Kor. J. App. Microbiol Bioeng. 17(2), 126-130 (1989)
Zhang, D., Liu, Y. P., Yu, H. S., Jin, F. X. and Chen, G. X. : Purification of ginsenoside $\beta$ -glucosidase hydrolase and its characteristics. Ying Yong Yu Huan Jing Sheng Wu Xue Bao. 9(3), 259-262 (2003)
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.