[논문]한방 입욕제 조성물이 MC/9 mast cell에서의 Th2 cytokine 발현에 미치는 영향

장문희; 최재송; 최애련; 안택원

doi:10.7730/jscm.2012.24.3.80

한방 입욕제 조성물이 MC/9 mast cell에서의 Th2 cytokine 발현에 미치는 영향
Effects of Korean Herbal Bathing Extracts Composition on Th2 Cytokine Production in MC/9 Mast Cells 원문보기

사상체질의학회지 = Journal of Sasang Constitutional Medicine, v.24 no.3, 2012년, pp.80 - 92

장문희 (대전대학교 한의과대학 사상체질의학과) , 최재송 (대전대학교 한의과대학 사상체질의학과) , 최애련 (대구한의대학교 한의과대학 사상체질의학과) , 안택원 (대전대학교 한의과대학 사상체질의학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives The purpose of this study is to investigate the effects of korean herbal bathing extracts composition 1 and composition 2 on Th2 cytokine production in MC/9 mast cells. Methods The effects of composition 1, 2 was analyzed by ELISA and Real-time PCR in MC/9 mast cells. Levels of IL-5, IL-13 were measured using enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA). mRNA levels of IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 were analyzed with Real-time PCR. Results Composition 1, 2 inhibited the IL-5, IL-13 production significantly(p<.001) in comparison to PI-control group at concentration of 100 ${\mu}g/mL$, 200 ${\mu}g/mL$. Composition 1, 2 inhibited the IL-4, IL-5, IL-13 mRNA expression significantly in comparison to PI-control group at concentration of 100 ${\mu}g/mL$, 200 ${\mu}g/mL$. Composition 1 inhibited the IL-6 mRNA expression significantly in comparison to PI-control group at concentration of 200 ${\mu}g/ml$. Composition 2 inhibited the IL-6 mRNA expression significantly in comparison to PI-control group at concentration of 100 ${\mu}g/mL$, 200 ${\mu}g/mL$. Conclusions These results indicate that composition 1, 2 has the effect of decreasing the Th2 cytokine production in the MC/9 mast cell.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

각종 피부 질환에 효능이 있다^13,14고 알려진 약재 중 少陰人要藥에 속하는 당귀, 고련피, 작약, 백출, 인삼, 인진, 소목, 울금, 황기와 少陽人要藥에 속하는 금은화, 삼백초, 박하, 어성초, 산두근, 고삼, 목단피, 조구등, 우방자와 太陰人要藥에 속하는 창이자, 백선피, 석창포, 상백피, 포공영, 비파엽, 산약 25가지의 입욕제 한약추출물을 선정하여 MC/9 mast cell을 이용하여 세포 독성 및 IL-5, IL-13 단백질 생성을 조절할 수 있는지를 분석하여 25가지의 입욕제 한약추출물 중 IL-5, IL-13 단백질 생성량을 대조군에 비하여 유의성 있게 억제 시킨 당귀, 황기, 산약, 비파엽, 포공영을 입욕제 조성물로 선정하여 각각 20%의 비율로 조합한 조성물 1번과 각각 10%, 10%, 10%, 35%, 35%의 비율로 조합한 조성물 2번으로 IL-5, IL-13 단백질 생성 및 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 mRNA 유전자 발현을 조절할 수 있는지 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 연구에서는 25가지의 입욕제 한약추출물(Table Ⅰ)을 이용하여 ELISA와 Real-time PCR로 MC/9 mast cell을 이용하여 여기서 발현하는 cytokine을 조절할 수 있는지를 분석하여 이를 통해 한방 입욕제가 mast cell에서 어떤 신호전달 기전을 제어함으로써 활성이 억제되어 cytokine의 발현에 영향을 미치는지를 실험적으로 규명해 보고자 하였다.

제안 방법

법을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. MC/9 mast cell은 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 배양한 후 25가지의 한약 추출물(최종 농도 50, 100, 200, 400 ㎍/mL)을 48 시간 동안 처리하였다. 배양종료 6시간 전에 EZ-Cytox 용액 10 ㎕씩 각 well에 가하고 실험 종료 시까지 배양하였다.
MC/9 mast cell을 48-well plate에 4×105/mL로 250 μL씩 분주하고 24시간 동안 배양한 다음 무처리한 군은 정상군(Normal)으로 사용하였으며, PMA(50 ng/mL)와 Ionomycin(0.5 μM)만으로 자극한 군은 대조군(PI-control)으로 사용하였다.
MC/9 mast cell을 6-well plate에 2.5×105/mL로 2 mL씩 분주하고 24시간 동안 배양한 다음 무처리한 군은 정상군(Normal)으로 사용하였으며, PMA(50 ng/mL)와 Ionomycin(0.5 μM)만으로 자극한 군은 대조군(PI-control)으로 사용하였다.
Mouse IL-5와 IL-13 ELISA kit 를 사용하여 제조사의 지시에 따라 코팅 antibody를 microwell에 100 μL 씩 분주하고 4℃에서 16시간 두었다.
Real time quantitative RT-PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR system를 이용하여 수행하였다. 사용된 primers는 아래와 같다(Table 3).
기기는 열탕추출기 DWT-1800T(대웅, Korea), 감압증류장치 B-480(Buchi Labortechnik AG, Switzerland), 동결 건조기 EYELA FDU-540(Tokyo, Japan), CO₂ 배양기(Forma scientific Co., USA), 원심분리기(한일과학, Korea), plate shaker(Lab-Line, USA), spectrophotometer(Shimazue, Japan), Bio-freezer(Sanyo, Japan), Quantitative Real-Time PCR (Applied Biosystems, USA), ELISA leader(Molecular Devices, USA) 등을 사용하였다.
당귀, 황기, 산약, 포공영, 비파엽을 5가지 입욕제 조성물로 선정하여 각각의 농도를 20%로 조합한 조성물 1번과 각각 10%, 10%, 10%, 35%, 35%의 비율로 조합한 조성물 2번으로 구성하였다(Table 2). ELISA로 단백질 생성량을 측정한 결과 조성물 1번, 2번의 IL-5, IL-13 단백질 생성량은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 (p<0.
배양 후 25가지의 한약추출물(50 ㎍/mL, 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL)로 각 well에 처리하고 1시간 후에 PMA(50 ng/mL)와 Ionomycin(0.5 μM)으로 자극한 뒤 16시간 후에 상층액을 얻어 실험군으로 사용하였다.
배양 후 Cyclosporin A(10 ㎍/mL)와 입욕제 조성물 1번(100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL)과 입욕제 조성물 2번(100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL)로 각 well에 처리하고 1시간 후에 PMA(50 ng/mL)와 Ionomycin(0.5 μM)으로 자극한 뒤 6시간 후에 세포를 얻어 각각 양성대조군과 실험군으로 사용하였다.
배양 후 Cyclosporin A(이하 CsA, 10 ㎍/mL)와 입욕제 조성물 1번(100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL)과 입욕제 조성물 2번(100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL)로 각 well에 처리하고 1시간 후에 PMA(50 ng/mL)와 Ionomycin(0.5 μM)으로 자극한 뒤 16시간 후에 상층액을 얻어 각각 양성대조군과 실험군으로 사용하였다.
05mM 2-mercaptoethanol and 2mML-glutamine(Sigma-Aldrich, USA) 및 100 ㎍/㎖ streptomycin(Gibco, USA)이 함유된 DMEM 배지에 부유시켜 37℃, 5% CO2, 95% 대기에서 배양하였다. 세포는 주 2～3회씩 계대 배양하였다.
세포독성방법은 EZ-Cytox assay¹⁵법을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. MC/9 mast cell은 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 배양한 후 25가지의 한약 추출물(최종 농도 50, 100, 200, 400 ㎍/mL)을 48 시간 동안 처리하였다.
실험군인 입욕제 조성물 1번은 100 ㎍/mL 농도에서 0.836, 200 ㎍/mL 농도에서 0.604으로 대조군에 비하여 유의성 있게 억제 하였다. 입욕제 조성물 2번은 100 ㎍/mL 농도에서 0.
역전사 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 75℃에서 5분 동안 변성시키고, 이에 2.5 μL 10 mM dNTPs mix, 1 μL random sequence hexanucleotides(25 pmole/25 μL), RNA inhibitor로서 1 μL RNase inhibitor(20 U/μL), 1 μL 100 mM DTT, 4.5 μL 5×RT buffe(250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 μL의 M-MLV RT(200 U/μL)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 μL가 되도록 하였다.
유전자 발현은 Taqman PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, internal standard를 G3PDH를 사용하였으며, primer의 최종 농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건은 pre-denaturation은 2 min at 50 ℃, 10 min 94 ℃, 그리고 40 cycles을 0.
입욕제 조성물 1번(당귀 20%, 황기 20%, 산약 20%, 포공영 20%, 비파엽 20%)과 입욕제 조성물 2번(당귀 10%, 황기 10%, 산약 10%, 포공영 35%, 비파엽 35%)이 MC/9 mast cell에서의 Th2 cytokine 발현에 미치는 영향을 실험적으로 규명하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
입욕제 조성물인 당귀, 황기, 산약, 포공영, 비파엽을 각각 100g씩 증류수 1,300 mL를 가하여 열탕 추출기에서 2시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류장치로 농축하여, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조한 각각의 입욕제 추출물을 냉동보관 (-84℃)하면서 당귀, 황기, 산약, 포공영, 비파엽을 각각 20%의 비율로 조합하여 1번 조성물, 각각 10%, 10%, 10%, 35%, 35%의 비율로 조합하여 2번 조성물이라 하였다(Table 2).
표준품을 희석하고 상층액을 20배 희석한 후 microplate를 세척하고 각 표준품과 상층액을 100 μL 씩 넣었다.

대상 데이터

co.(Korea) 제품을, Deoxynucleoside triphosphate(dNTP)는 TaKaRa사(Japan) 제품을, Moloey Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)와 RNase inhibitor는 Promega사(USA) 제품을 사용하였다. SYBR master mix는 Applied Biosystems사(USA) 제품을 사용하였으며, IL-5 ELISA kit는 BD bioscience사(USA) 제품을, IL-13 ELISA kit는 Biosource사(USA) 제품을 사용하였고, 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
Dulbecco's Minimal essential medium(DMEM), Fetal bovine serum(FBS), Trypsin-EDTA, Antibiotics(penicillin, streptomycin)는 Gibco-BRL(USA) 제품을 사용하였고, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(D-PBS), Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), Ionomycin, Phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), Diethyl pyrocarbonate(DEPC), Chloroform, Isopropanol, Ethanol, magnesium chloride(MgCl2), 2-mercaptoethanal는 Sigma사(USA) 제품을 사용하였다.
(Korea) 제품을, Deoxynucleoside triphosphate(dNTP)는 TaKaRa사(Japan) 제품을, Moloey Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(M-MLV RT)와 RNase inhibitor는 Promega사(USA) 제품을 사용하였다. SYBR master mix는 Applied Biosystems사(USA) 제품을 사용하였으며, IL-5 ELISA kit는 BD bioscience사(USA) 제품을, IL-13 ELISA kit는 Biosource사(USA) 제품을 사용하였고, 그 외 시약들은 특급 및 일급을 사용하였다.
본 실험에 사용된 MC/9 murine mast cell(ATCC, USA)을 10% fetal bovine serum, 10% T-stim(BD Biosciences, USA), 0.05mM 2-mercaptoethanol and 2mML-glutamine(Sigma-Aldrich, USA) 및 100 ㎍/㎖ streptomycin(Gibco, USA)이 함유된 DMEM 배지에 부유시켜 37℃, 5% CO2, 95% 대기에서 배양하였다. 세포는 주 2～3회씩 계대 배양하였다.
본 실험에서 사용한 한약재는 대전대학교 둔산 한방병원에서 구입 정선하여 사용하였다(Table 1).

데이터처리

The results represent the mean±S.E. Statistically signigicant value was calculated by compared with PI-control group by student's t-test(*** : p<.001).
각 실험군 결과 값은 unpaired student's t-test 통계프로그램을 사용하여 통계 처리하였으며, p<0.05 이하의 수준에서 유의성 검정을 실시하였다(*** : p<.001).

성능/효과

1. 입욕제 조성물 1번과 2번의 IL-5 단백질 생성은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL 농도에서 유의성있게 (p<.001) 억제되었다.
2. 입욕제 조성물 1번과 2번의 IL-13 단백질 생성은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL 농도에서 유의성있게(p<.001) 억제되었다.
3. 입욕제 조성물 1번과 2번의 IL-4 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL 농도에서 유의성있게 억제되었다.
4. 입욕제 조성물 1번과 2번의 IL-5 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL 농도에서 유의성있게 억제되었다.
5. 입욕제 조성물 1번의 IL-6 mRNA 유전자 발현은 200 ㎍/mL 농도에서 유의성있게 억제되었다.
6. 입욕제 조성물 2번의 IL-6 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL 농도에서 유의성있게 억제되었다.
7. 입욕제 조성물 1번과 2번의 IL-13 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL 농도에서 유의성있게 억제되었다.
ELISA로 단백질 생성량을 측정한 결과 25가지 입욕제 한약추출물 중 당귀, 황기, 산약, 포공영, 비파엽의 5가지 한약추출물에서 IL-5, IL-13 단백질 생성량이 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다(Fig. 2).
ELISA로 단백질 생성량을 측정한 결과 조성물 1번, 2번의 IL-5, IL-13 단백질 생성량은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 (p<0.001) 억제되었다(Fig. 3).
IL-4, IL-6 mRNA 유전자 발현은 입욕제 조성물 1번은 200 ㎍/mL 농도에서 대조군에 비하여 유의성있게 억제하였고, 입욕제 조성물 2번은 모든 농도에서 대조군에 비하여 유의성있게 억제하였다(Fig. 5).
IL-5, IL-13 mRNA 유전자 발현은 입욕제 조성물 1번, 2번 모두 모든 농도에서 대조군에 비하여 유의성있게 억제하였다(Fig. 4).
IL-5, IL-13 단백질 생성량은 25가지 입욕제 한약추출물 중 당귀, 황기, 산약, 포공영, 비파엽에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제 하였다(Fig. 2).
IL-5, IL-13 단백질 생성량은 입욕제 조성물 1번, 2번 모두 모든 농도에서 대조군에 비하여 유의성있게 (p<.001) 억제하였다(Fig. 3).
IL-6 mRNA 유전자 발현은 정상군이 0.028이며 대조군이 1일 때 양성대조군은 0.358으로 대조군에 비하여 유의성있게 억제하였다.
Real-time PCR로 유전자 발현을 측정한 결과 조성물 1번의 IL-4, IL-5, IL-13 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었으며 IL-6 mRNA 유전자 발현은 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다. 조성물 2번의 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다(Fig.
실험 결과를 살펴보면 MC/9 mast cell을 배양하여 25가지의 입욕제 한약추출물의 세포 독성을 측정한 결과 울금이 200 ㎍/mL에서 400 ㎍/mL까지의 농도에서 세포 독성이 나타났으며 소목이 50 ㎍/mL에서 400 ㎍/mL까지의 모든 농도에서 세포 독성이 나타났다. 다른 23가지의 한약추출물에서는 세포 독성이 거의 나타나지 않았다(Fig.
이상의 결과를 통해 당귀, 황기, 산약, 포공영, 비파엽이 각각의 농도를 20%로 조합한 조성물 1번과 각각 10%, 10%, 10%, 35%, 35%의 비율로 조합한 조성물 2번 모두 활성화된 mast cell에서 발현하는 cytokine인 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13의 생성을 억제함으로써 알레르기 염증 반응을 효과적으로 조절한다고 할 수 있다. 이로써 본 입욕제 조성물을 이용하여 아토피 피부염에 보조 치료로 적용이 가능할 것으로 판단되며, 향후 추가적인 임상 연구가 필요할 것으로 사료된다.
입욕제 한약추출물의 MC/9 mast cell 세포독성을 측정한 결과 울금이 200 ㎍/mL에서 400 ㎍/mL까지의 농도에서 세포 독성이 나타났으며 소목이 50 ㎍/mL에서 400 ㎍/mL까지의 모든 농도에서 세포 독성이 나타났다. 다른 23가지의 한약추출물에서는 세포 독성이 거의 나타나지 않았다(Fig.
Real-time PCR로 유전자 발현을 측정한 결과 조성물 1번의 IL-4, IL-5, IL-13 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었으며 IL-6 mRNA 유전자 발현은 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다. 조성물 2번의 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 mRNA 유전자 발현은 100 ㎍/mL, 200 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있게 억제되었다(Fig. 4)(Fig. 5).

후속연구

등 외에는 쉽게 찾아 볼 수가 없으며 현재 외용약으로의 사용이 미미한 실정이다. 따라서 질병 치료에 있어서 외용약의 사용이 체질별 保命之主를 유지하는 것에 도움을 줄 수 있는 것인가에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이상의 결과를 통해 당귀, 황기, 산약, 포공영, 비파엽이 각각의 농도를 20%로 조합한 조성물 1번과 각각 10%, 10%, 10%, 35%, 35%의 비율로 조합한 조성물 2번 모두 활성화된 mast cell에서 발현하는 cytokine인 IL-4, IL-5, IL-6, IL-13의 생성을 억제함으로써 알레르기 염증 반응을 효과적으로 조절한다고 할 수 있다. 이로써 본 입욕제 조성물을 이용하여 아토피 피부염에 보조 치료로 적용이 가능할 것으로 판단되며, 향후 추가적인 임상 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한방 입욕제로 예전부터 쓰여진 한약재의 종류로 무엇이있는가?	한방 입욕제란 여러 가지 자연 식물에서 추출한 한방성분을 주성분으로 하는 입욕제를 말한다. 예로부터 사람들은 쑥, 창포, 녹차, 어성초 등의 한약재를 사용하는 목욕을 즐겼으며 이러한 약물 목욕이 질병예방과 치료효과를 얻는 장수 건강법으로 알려져 왔다. 이에 입욕제는 단순히 감각, 운동 후의 피로 회복만을 위한 것이라기보다는 의학적, 약리적으로도 효과가 인정되며 온열 효과 및 각종 치료를 보조하는 제품에 이용되고 있다8-10.
	아토피 피부염이란?	아토피 피부염은 피부 건조증, 소양감을 주소로 하는 대표적인 알레르기성 질환으로 환경적인 요소와 유전적인 소인이 모두 관여하는 복합적인 질환으로 알려져 있다1. 주로 유, 소아의 유병율이 높다고 알려져 있으며 최근 성인에게도 꾸준히 증가하여 많은 사람이 아토피 피부염으로 고통을 받고 있다2.
	아토피 피부염의 발병 기전과 관련된 세포는 무엇이있는가?	아토피 피부염의 발병 기전은 면역학적 측면에서 mast cell, T세포 등과 같은 세포들과 cytokine, immunoglobulin 등과 같은 인자들이 관련 되어 있다고 알려져 있으며 Th2 매개 cytokine 간의 불균형, IgE 증가, mast cell의 증가나 활성화 등이 기전으로 알려져 있다3.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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