본 연구를 통하여 청시닥나무의 에탄올 추출물은 쥐 대식세포인 Raw264.7 세포에 LPS로 유도된 염증반응에 미치는 효과가 있음을 확인하였다. 청시닥나무 목질부와 수피부에 에탄올을 가하여 추출한 뒤 그 추출물과 분획물의 NO 생성능 및 세포증식능을 실험한 결과 수피부의 EtOAc 분획이 세포증식능에 영향을 주지 않으면서 NO의 생성을 억제함을 확인하였다. 청시닥나무 수피부 에탄올 추출물 EtOAc 분획(EFEBA)은 Raw264.7 세포에서 LPS에 의해 생성된 NO의 분비와 iNOS의 단백질 및 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰고, 염증 반응 시 생성되는 IL-6, IL-$1{\beta}$ 그리고 TNF-${\alpha}$의 mRNA의 발현도 현저히 감소시켰다. 또한 $I{\kappa}B{\alpha}$의 degradation을 감소시키고 p65의 인산화를 감소시켜 NF-${\kappa}B$ signaling을 통해 염증작용을 조절함을 확인하였다.
본 연구를 통하여 청시닥나무의 에탄올 추출물은 쥐 대식세포인 Raw264.7 세포에 LPS로 유도된 염증반응에 미치는 효과가 있음을 확인하였다. 청시닥나무 목질부와 수피부에 에탄올을 가하여 추출한 뒤 그 추출물과 분획물의 NO 생성능 및 세포증식능을 실험한 결과 수피부의 EtOAc 분획이 세포증식능에 영향을 주지 않으면서 NO의 생성을 억제함을 확인하였다. 청시닥나무 수피부 에탄올 추출물 EtOAc 분획(EFEBA)은 Raw264.7 세포에서 LPS에 의해 생성된 NO의 분비와 iNOS의 단백질 및 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰고, 염증 반응 시 생성되는 IL-6, IL-$1{\beta}$ 그리고 TNF-${\alpha}$의 mRNA의 발현도 현저히 감소시켰다. 또한 $I{\kappa}B{\alpha}$의 degradation을 감소시키고 p65의 인산화를 감소시켜 NF-${\kappa}B$ signaling을 통해 염증작용을 조절함을 확인하였다.
Acer barbinerve Maxim belongs to the Aceraceae tree family and is often consumed as an Oriental medicine. In this study, we investigated whether or not ethanol extract from the bark of A. barbinerve Max. (EBA) inhibits lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory responses in Raw264.7 macrophages. ...
Acer barbinerve Maxim belongs to the Aceraceae tree family and is often consumed as an Oriental medicine. In this study, we investigated whether or not ethanol extract from the bark of A. barbinerve Max. (EBA) inhibits lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory responses in Raw264.7 macrophages. EBA was fractionated using n-hexane, $CH_2Cl_2$, ethyl acetate (EtOAc), and water. Raw264.7 cells were treated with 20 ${\mu}g/mL$ of EBA and the EBA fractions. EBA inhibited LPS-induced nitric oxide (NO) production. Among the three fractions, EtOAc fraction of EBA (EFEBA) was the most effective in inhibiting LPS-induced NO production without significant cytotoxicity in Raw264.7 cells. EFEBA futher reduced LPS-induced expression of inducible NO synthase (iNOS) proteins and its corresponding mRNA. Additionally, EFEBA decreased the mRNA levels of interleukin (IL)-6, IL-$1{\beta}$, and tumor necrosis factor-${\alpha}$ in LPS-treated Raw264.7 cells. Lastly, EFEBA inhibited LPS-induced degradation of the inhibitor of kappaBalpha ($I{\kappa}B{\alpha}$) as well as phosphorylation of p65 nuclear factor-${\kappa}B$ (NF-${\kappa}B$). These results indicate that EFEBA exhibits strong anti-inflammatory effects and can be developed as a potential anti-inflammatory agent.
Acer barbinerve Maxim belongs to the Aceraceae tree family and is often consumed as an Oriental medicine. In this study, we investigated whether or not ethanol extract from the bark of A. barbinerve Max. (EBA) inhibits lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory responses in Raw264.7 macrophages. EBA was fractionated using n-hexane, $CH_2Cl_2$, ethyl acetate (EtOAc), and water. Raw264.7 cells were treated with 20 ${\mu}g/mL$ of EBA and the EBA fractions. EBA inhibited LPS-induced nitric oxide (NO) production. Among the three fractions, EtOAc fraction of EBA (EFEBA) was the most effective in inhibiting LPS-induced NO production without significant cytotoxicity in Raw264.7 cells. EFEBA futher reduced LPS-induced expression of inducible NO synthase (iNOS) proteins and its corresponding mRNA. Additionally, EFEBA decreased the mRNA levels of interleukin (IL)-6, IL-$1{\beta}$, and tumor necrosis factor-${\alpha}$ in LPS-treated Raw264.7 cells. Lastly, EFEBA inhibited LPS-induced degradation of the inhibitor of kappaBalpha ($I{\kappa}B{\alpha}$) as well as phosphorylation of p65 nuclear factor-${\kappa}B$ (NF-${\kappa}B$). These results indicate that EFEBA exhibits strong anti-inflammatory effects and can be developed as a potential anti-inflammatory agent.
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문제 정의
NO는 신경전달과 혈관확장 등 생리적인 기능을 조절하는 중요한 역할을 하지만, 과발현된 NO는 혈관 투과성, 부종 그리고 염증을 심화시켜 조직을 손상시키고 암으로의 진행을 촉진한다(32,33). 따라서 본 연구에서는 대식세포인 Raw264.7 세포에 LPS로 염증반응을 유도시켜 청시닥나무 에탄올 추출물 중 염증반응을 억제하는 분획물을 찾고, 그 분획물이 염증관련단백질 및 cytokine 발현에 미치는 영향을 조사하였다. Raw 264.
이러한 결과로 보면 청시닥나무 수피 EtOAc 분획물은 다양한 생리활성을 나타낼 것으로 사료되나 이에 대한 연구는 보고되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 염증성 질환의 예방 및 치료제로서 청시닥나무의 이용 가능성을 밝히기 위하여 LPS로 염증반응을 유도한 Raw264.7세포에서 청시닥나무 수피와 목질부의 에탄올 추출물의 항염증 효능을 조사하였다.
제안 방법
(EFEBA)를 0, 5, 10, 20 μg/mL의 농도로 처리한 뒤 다음의 방법(25)으로 cell lysate를 수행하였다.
그 후 anti-mouse 또는 anti-rabbit Goat anti-Rabbit IgG-h＋l HRP conjugated antibody를 첨가하여 1시간 교반하였다. 각 단백질 밴드는 ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 가시화 하였다. 각각의 단백질의 발현량은 Image J(ver.
각 단백질 밴드는 ImmobilonTM Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 가시화 하였다. 각각의 단백질의 발현량은 Image J(ver. 1.42, NIH Image, developed and maintained by the National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 수치화 하였다.
1A). 대식세포의 증식에는 아무런 영향을 주지 않았으므로 LPS와 청시닥나무 에탄올 추출물의 수피와 목질부를 24시간 처리한 배지에서 염증 시 분비되는 NO를 측정하였다. 그 결과 LPS 처리에 의해 증가한 NO의 분비가 목질부보다 수피부에서 감소하였고, 수피부에서는 EtOAc 분획이 가장 효과가 좋았다(Fig.
청시닥나무 수피 EtOAc 분획물의 주성분은 methyl gallate와 methyl gallate-4-O-βD-glucoside로 보고된 바 있으며 특히, methyl gallate는 항염증 활성 성분으로 알려져 있어 이러한 성분이 청시닥나무 수피부 EtOAc 분획물의 항염증 활성과 관련이 있을 것으로 생각된다. 따라서 생리활성에 대한 연구가 미진한 청시닥나무 수피부의 EtOAc 분획을 대상으로 다음과 같은 다양한 염증관련 활성 시험을 진행하였다.
청시닥나무의 수피와 목질부에서 추출한 분획물의 NO 생성 억제 능력을 조사하기 위해 위 실험의 세포배양액 중에 존재하는 NO2-를 Griess reagent system(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 측정하였다. 상층액을 96 well plate에 각각 분주한 후 제조사에서 제시한 방법대로 Griess 시약을 첨가하여 반응시킨 뒤 540 nm 파장에서 microplate reader(BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용하여 nitrite 농도를 측정하였다.
세포를 여러 농도의 EFEBA로 처리한 후, total RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 추출하였고, 3 μg의 total RNA에서 cDNA를 합성하기 위하여 oligo-(dT) primer와 SuperScript II reverse transcriptase(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다(24).
동일한 SDM에 LPS(1 μg/mL)가 포함되지 않은 것 또는 포함한 배지에 청시닥나무 수피와 목질부에서 추출한 다양한 분획물을 24시간 처리하여 세포의 생존율을 MTT assay 방법으로(24) 측정하였다. 청시닥나무의 수피와 목질부에서 추출한 분획물의 NO 생성 억제 능력을 조사하기 위해 위 실험의 세포배양액 중에 존재하는 NO2-를 Griess reagent system(Promega, Madison, WI, USA)을 이용하여 측정하였다. 상층액을 96 well plate에 각각 분주한 후 제조사에서 제시한 방법대로 Griess 시약을 첨가하여 반응시킨 뒤 540 nm 파장에서 microplate reader(BIO-RAD, Hercules, CA, USA)를 이용하여 nitrite 농도를 측정하였다.
iNOS, IL-6, IL-1β, TNF-α 그리고 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 mRNA의 발현은 real-time RT-PCR 방법으로 Rotor-GeneTM 6000(Corbett Life Science, Sydney, Australia)을 이용해 cDNA를 증폭시켜 측정하였다(26). 측정하고자 하는 mRNA는 GAPDH로 수치를 정량화 하였고 Rotor-gene software(ver. 6, Corbett Life Science, Sydney, Australia)를 사용하여 계산하였다. 각각의 수치는 LPS control(1 μg/mL LPS＋0 μg/mL EFEBA)을 100%의 기준으로 나타낸 것이다.
대상 데이터
(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, iNOS antibody는 BD Transduction Laboratories(Palo Alto, CA, USA)에서, anti-NF-κB p65(C-20) antibody는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
Murin macrophage인 Raw264.7세포는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 세포배양에 사용한 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)은 Welgene(Daegu, Korea)에서 구입하였고, fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin 등은 Cambrex Bio Technology(Biowhittaker, Walkersville, MD, USA)에서 구입하였다.
Raw264.7 세포를 DMEM에 10% FBS, penicillin(100 U/mL) 및 streptomycin(100 μg/mL)을 혼합한 배지를 사용하여 37℃의 습윤한 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
iNOS primer는 Laml 등(27)의 논문을, IL-6, IL-1β, TNF-α와 GAPDH는 Shin 등(28)의 논문을 참고하였다. mRNA primer는 Bioneer(Daejeon, Korea)에서 제작하였다.
데이터처리
수집된 결과는 SAS(Statistical Analysis system) Windows v. 8.12 프로그램(SAS Institute, Cary, NC, USA)을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군의 평균치간의 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 분석하였다.
iNOS, IL-6, IL-1β, TNF-α 그리고 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 mRNA의 발현은 real-time RT-PCR 방법으로 Rotor-GeneTM 6000(Corbett Life Science, Sydney, Australia)을 이용해 cDNA를 증폭시켜 측정하였다(26).
2A). 그리고 NO의 분비 억제가 iNOS 단백질 발현 억제에 의한 것인지 조사하기 위해 Western blot를 수행하였다. 그 결과 iNOS 단백질의 발현이 LPS 처리에 의해 증가하였으며, EFEBA 처리에 의해 감소하였다(Fig.
동일한 SDM에 LPS(1 μg/mL)가 포함되지 않은 것 또는 포함한 배지에 청시닥나무 수피와 목질부에서 추출한 다양한 분획물을 24시간 처리하여 세포의 생존율을 MTT assay 방법으로(24) 측정하였다.
성능/효과
NF-κB signaling을 통해 EFEBA가 염증관련 인자들을 조절하는지 확인하기 위하여 Western blot를 수행한 결과 LPS 자극에 의해 IκBα의 degradation이 EFEBA의 처리에 의해 감소함을 확인하였고, LPS에 의해 증가된 p65의 인산화 역시 EFEBA의 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 4).
Pro-inflammatory cytokine인 IL-6, IL-1β 그리고 TNF-α의 mRNA 수준을 조사한 결과 LPS 처리에 의해 cytokine의 mRNA 수준이 증가하였고, EFEBA의 처리 10 μg/mL에서부터 IL-6와 IL-1β의 mRNA 수준이 유의적으로 감소하였으며, TNF-α는 EFEBA의 처리 20 μg/mL에서 mRNA 수준이 유의성 있게 감소하였다(Fig. 3).
대식세포의 증식에는 아무런 영향을 주지 않았으므로 LPS와 청시닥나무 에탄올 추출물의 수피와 목질부를 24시간 처리한 배지에서 염증 시 분비되는 NO를 측정하였다. 그 결과 LPS 처리에 의해 증가한 NO의 분비가 목질부보다 수피부에서 감소하였고, 수피부에서는 EtOAc 분획이 가장 효과가 좋았다(Fig. 1B). 청시닥나무 수피 EtOAc 분획물의 주성분은 methyl gallate와 methyl gallate-4-O-βD-glucoside로 보고된 바 있으며 특히, methyl gallate는 항염증 활성 성분으로 알려져 있어 이러한 성분이 청시닥나무 수피부 EtOAc 분획물의 항염증 활성과 관련이 있을 것으로 생각된다.
그리고 NO의 분비 억제가 iNOS 단백질 발현 억제에 의한 것인지 조사하기 위해 Western blot를 수행하였다. 그 결과 iNOS 단백질의 발현이 LPS 처리에 의해 증가하였으며, EFEBA 처리에 의해 감소하였다(Fig. 2B). 또한 mRNA의 수준에서 iNOS 발현을 확인한 결과 LPS에 의해 증가한 mRNA의 발현이 EFEBA 20 μg/mL를 처리한 군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
7 세포에서 LPS에 의해 생성된 NO의 분비와 iNOS의 단백질 및 mRNA의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰고, 염증 반응 시 생성되는 IL-6, IL-1β 그리고 TNF-α의 mRNA의 발현도 현저히 감소시켰다. 또한 IκBα의 degradation을 감소시키고 p65의 인산화를 감소시켜 NF-κB signaling을 통해 염증작용을 조절함을 확인하였다.
또한 mRNA의 수준에서 iNOS 발현을 확인한 결과 LPS에 의해 증가한 mRNA의 발현이 EFEBA 20 μg/mL를 처리한 군에서 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2C).
본 연구를 통하여 청시닥나무의 에탄올 추출물은 쥐 대식세포인 Raw264.7 세포에 LPS로 유도된 염증반응에 미치는 효과가 있음을 확인하였다. 청시닥나무 목질부와 수피부에 에탄올을 가하여 추출한 뒤 그 추출물과 분획물의 NO 생성능 및 세포증식능을 실험한 결과 수피부의 EtOAc 분획이 세포증식능에 영향을 주지 않으면서 NO의 생성을 억제함을 확인하였다.
앞의 실험에서 EFEBA가 세포생존율에 영향을 미치지 않으면서 NO를 감소시키는 가장 효과적인 분획물임을 확인하였기 때문에 EFEBA의 농도를 0, 5, 10, 20 μg/mL로 세분화하여 NO의 분비를 확인한 결과, EFEBA의 처리에 의해 NO의 분비가 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 2A).
0%였다. 얻어진 추출물은 물에 현탁하여 n-hexane, CH2Cl2 및 ethyl acetate로 순차 추출한 후 각각의 분획물을 동결 건조하여 수피부에서는 n-hexane(0.2%), CH2Cl2(0.4%), EtOAc(4.4%) 및 H2O(5.2%)를 얻었으며 목질부에서는 EtOAc(0.4%) 및 H2O(0.6%)를 얻었다.
2C). 위 결과는 EFEBA에 의한 NO의 분비 억제가 iNOS의 단백질과 mRNA의 발현 감소에 의한 것임을 증명할 수 있다.
또한 청시닥나무 수피 EtOAc 분획물의 주성분중 하나인 methyl gallate는 iNOS, COX-2를 억제하며 이와 관련된 ERK1/2 signaling을 억제한다고 보고되 었다(38). 위 결과를 종합하여 보면 청시닥나무수피 EtOAc 분획물의 methyl gallate가 iNOS, COX-2 등의 단백질 및 mRNA를 억제함으로써 염증을 억제한다고 사료된다.
7 세포에 LPS로 유도된 염증반응에 미치는 효과가 있음을 확인하였다. 청시닥나무 목질부와 수피부에 에탄올을 가하여 추출한 뒤 그 추출물과 분획물의 NO 생성능 및 세포증식능을 실험한 결과 수피부의 EtOAc 분획이 세포증식능에 영향을 주지 않으면서 NO의 생성을 억제함을 확인하였다. 청시닥나무 수피부 에탄올 추출물 EtOAc 분획(EFEBA)은 Raw264.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
nuclear factor(NF)-κB는 무엇인가?
염증반응에서 iNOS는 중요한 역할을 하며, gramnegative bacteria 외막의 주요성분인 lipopolysaccharide(LPS)는 iNOS 및 다양한 염증성 cytokine인 interleukin (IL)-6, IL-1β, tumor necrosis factor(TNF)-α 등을 유도한다(14). 염증반응에서 중요한 역할을 하는 nuclear factor(NF)-κB는 다양한 cytokine, chemokine, growth factor의 합성을 조절하는 transcription factor이다(15). NF-κB는 p50과 p65로 구성되어 핵 안으로 들어가 전사인자로서 작용하여 iNOS, COX-2 및 염증관련 cytokine을 합성하며, 일반적으로 세포질에서 IκBα와 결합함으로 NF-κB의 작용이 억제된다(16).
청시닥나무의 국내 서식지는?
청시닥나무(A. babrbinerve)는 단풍나무과의 낙엽 활엽소교목으로 울릉도와 제주도를 제외한 대한민국 전역의 깊은 산에서 서식하며, 일본, 만주 등지에도 분포하고 있다. 높이는 10 m 정도까지 자라며 잎은 마주 나고 넓은 달걀 모양 또는 원형의 형태를 가지며, 민간에서는 나무껍질을 약용으로 쓰기도 한다(17).
nitric oxide synthase의 형태에는 어떤 것들이 있는가?
활성화된 대식세포는 NO를 분비하여 상피세포의 상태 변화 및 DNA의 변이와 세포 사멸 및 괴사를 유도하여 암이나 동맥경화를 유도할 수 있다(11). NOS에는 endothelial NOS, neuronal NOS, inducible NOS(iNOS)의 세 가지 형태가 있으며, 이들 중 iNOS에 의한 NO 생성은 병리학적으로 중요한 역할을 한다고 알려졌다(12). 일반적으로 iNOS에 의한 NO의 생성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거하는 면역반응의 역할을 한다(13).
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