농약을 포함한 화학물질의 독성을 평가하기 위하여 많은 실험동물이 사용되고 있다. 최근 동물실험에 대한 규제 강화와 실험동물의 윤리적 보호를 위해 동물실험을 대체하려는 동물대체시험법 연구가 활발히 진행되고 있다. 우리나라에서 화학농약 등록 시 급성경구독성시험, 급성경피독성시험, 피부자극성시험 등 여러 시험에서 실험동물을 이용하여 인축독성평가를 하고 있다. 세계적인 추세에 맞춰 농약의 안전성 평가를 위한 동물대체시험법 연구제시와 규제가 시급한 실정이다. 본 연구는 국제적으로 승인된 대체시험법 중 인공피부모델을 이용한 피부자극성평가 적용 가능성을 검토하기 위하여 실시하였다. 시험물질은 기존의 토끼를 이용한 피부자극성시험에서 피부반응을 평점화하여 산출한 피부 1차 자극지수(P. I. I.) 0-7(구분:없음-강도) 값을 가진 농약제품 16종을 선발, 인공피부(KeraSkin$^{TM}$)를 이용하여 피부자극성평가를 수행하였다. 그 결과, 중도이상의 농약인 경우 세포생존율 50% 이하로 자극성 물질로 나타났으며, 경도 이하의 농약인 경우 세포생존율 50% 이상으로 비자극성 물질로 나타났다. 피부의 자극성이 있는 경도에서 강도의 농약의 경우 현재 농촌진흥청 고시 농약표시 기준에 따라 주의사항을 표시하게 되어 있고(RDA, 2012b), 농약의 피부자극성의 경우 민감도가 사람에 따라 많은 차이를 보이기 때문에 피부자극성 대체시험법 적용여부는 추후 추가적인 검토가 필요할 것으로 판단되며, 앞으로 농약안전성평가를 위한 동물실험을 대체할 수 있는 시험법 검증연구를 통해 농약등록 시험기준과 방법을 개선할 필요성이 있다고 사료된다.
농약을 포함한 화학물질의 독성을 평가하기 위하여 많은 실험동물이 사용되고 있다. 최근 동물실험에 대한 규제 강화와 실험동물의 윤리적 보호를 위해 동물실험을 대체하려는 동물대체시험법 연구가 활발히 진행되고 있다. 우리나라에서 화학농약 등록 시 급성경구독성시험, 급성경피독성시험, 피부자극성시험 등 여러 시험에서 실험동물을 이용하여 인축독성평가를 하고 있다. 세계적인 추세에 맞춰 농약의 안전성 평가를 위한 동물대체시험법 연구제시와 규제가 시급한 실정이다. 본 연구는 국제적으로 승인된 대체시험법 중 인공피부모델을 이용한 피부자극성평가 적용 가능성을 검토하기 위하여 실시하였다. 시험물질은 기존의 토끼를 이용한 피부자극성시험에서 피부반응을 평점화하여 산출한 피부 1차 자극지수(P. I. I.) 0-7(구분:없음-강도) 값을 가진 농약제품 16종을 선발, 인공피부(KeraSkin$^{TM}$)를 이용하여 피부자극성평가를 수행하였다. 그 결과, 중도이상의 농약인 경우 세포생존율 50% 이하로 자극성 물질로 나타났으며, 경도 이하의 농약인 경우 세포생존율 50% 이상으로 비자극성 물질로 나타났다. 피부의 자극성이 있는 경도에서 강도의 농약의 경우 현재 농촌진흥청 고시 농약표시 기준에 따라 주의사항을 표시하게 되어 있고(RDA, 2012b), 농약의 피부자극성의 경우 민감도가 사람에 따라 많은 차이를 보이기 때문에 피부자극성 대체시험법 적용여부는 추후 추가적인 검토가 필요할 것으로 판단되며, 앞으로 농약안전성평가를 위한 동물실험을 대체할 수 있는 시험법 검증연구를 통해 농약등록 시험기준과 방법을 개선할 필요성이 있다고 사료된다.
It is common to use many experiment animals to evaluate the toxicity of chemicals including pesticides. For protecting animal, the concepts of 3R (Reduction, Replacement, Refinement) were introduced and in vitro alternatives methods actively have been developed all over the world. Many experimental ...
It is common to use many experiment animals to evaluate the toxicity of chemicals including pesticides. For protecting animal, the concepts of 3R (Reduction, Replacement, Refinement) were introduced and in vitro alternatives methods actively have been developed all over the world. Many experimental animals for toxicological tests have been used, so that it is important to establish the alternative methods. In this study, the alternative method using reconstituted human skin model (Keraskin$^{TM}$) was conducted for classification of skin irritation on pesticides. Sixteen formulations selected on the basis of the degree of irritation were treated by Keraskin$^{TM}$ test. The percent of cell viability was measured into the culture medium collected after treatment of the pesticides for 24-72 hrs. The skin irritations of formulations were evaluated by the cell viability. In this study, The 4 formulations with mild irritation in rabbits were evaluated as nonirritant, the 6 formulations with moderate and severe irritation were evaluated as irritant in human skin model test. We suggest that the alternative test using Keraskin$^{TM}$ model could be used as toxicity evaluation for primary irritation index (P.I.I.) score of greater than or equal to 2.1 of pesticides. The further studies should be required to apply for hazardous assessment of pesticides on alternative skin irritation methods because of the interindividual variability of the sensitivity of skin irritation on pesticides.
It is common to use many experiment animals to evaluate the toxicity of chemicals including pesticides. For protecting animal, the concepts of 3R (Reduction, Replacement, Refinement) were introduced and in vitro alternatives methods actively have been developed all over the world. Many experimental animals for toxicological tests have been used, so that it is important to establish the alternative methods. In this study, the alternative method using reconstituted human skin model (Keraskin$^{TM}$) was conducted for classification of skin irritation on pesticides. Sixteen formulations selected on the basis of the degree of irritation were treated by Keraskin$^{TM}$ test. The percent of cell viability was measured into the culture medium collected after treatment of the pesticides for 24-72 hrs. The skin irritations of formulations were evaluated by the cell viability. In this study, The 4 formulations with mild irritation in rabbits were evaluated as nonirritant, the 6 formulations with moderate and severe irritation were evaluated as irritant in human skin model test. We suggest that the alternative test using Keraskin$^{TM}$ model could be used as toxicity evaluation for primary irritation index (P.I.I.) score of greater than or equal to 2.1 of pesticides. The further studies should be required to apply for hazardous assessment of pesticides on alternative skin irritation methods because of the interindividual variability of the sensitivity of skin irritation on pesticides.
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문제 정의
본 연구에서는 피부자극성에 대체시험법을 농약에 대한 피부자극성시험법으로의 적용 가능성을 평가하기 위하여 국내에서 개발되어 검증한 엠씨티티의 KeraSkinTM을 이용하여 OECD TG 439 인공피부모델 시험법을 실시하였다(Moon et al., 2007, 2010).
제안 방법
약제 당 5분 간격으로 액상수화제, 유제 등 액상인 경우 30 ul를 적용, 입상 수화제, 수화제 등 고상인 경우 PBS 30 ul로 표면을 적신 후 30 mg을 넣고 상온에서 30분간 적용하였다. 각각의 well을 PBS로 overflowing 하여 물질을 제거하고, 여과지를 이용하여 물질 및 PBS를 제거하였다. 12 well plate에 각각의 cell을 넣고 PBS로 overflowing 시킨 상태에서 1분간 정체시킨 후 꺼내면서 shaking 하였다.
상기의 결과를 바탕으로 in vitro KeraSkinTM모델의 MTT assay 시험결과의 자극성분류 결과와 in vivo 시험결과의 비교 평가하기 위하여 in vitro 시험결과가 비자극성일 때 비자극성으로 판정되는 비율, 자극성일 때 자극성 자극성로 판정하는 비율을 백분율(%)로 산출하여 기존의 시험의 자극성 분류와의 유사성정도를 평가하였다.
시험에 사용된 농약은 등록된 농약제품으로 기존 토끼를 이용한 피부 자극성시험에서 피부반응을 평점화하여 산출한 피부 1차 자극지수(P. I. I.)를 Table 1의 기준에 따라 자극성 정도를 고려하여 선발하였다(RDA, 2012a).
연구에 사용된 농약은 토끼를 이용한 시험 결과를 토대로 현행 피부자극성분류기준에 따라 분류된 자극성이 없는 농약 6품목, 경도 4품목, 중도 3품목, 강도 3품목을 선발하였으며, 본 시험에 사용한 인공피부 KeraSkinTM모델의 피부자극성시험과 기존의 토끼를 이용한 in vivo 피부자극성 시험의 결과를 비교하여 Table 4에 나타내었다.
인공피부는 국내의 엠씨티티에서 판매되는 KeraSkinTM을 사용하였다. 약 4℃ 상태로 배송 후 well 당 0.
이론/모형
KeraSkinTM모델의 피부자극성 판정은 MTT assay를 이용한 세포생존율을 이용하였다. 세포생존율은 대조군을 100%으로 기준하여 계산하였으며, 세포생존율은 Table 3에 나타내었다.
배양이 끝난 후 세포생존율 측정을 위하여 MTT[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma] assay를 실시하였다. 0.
인공피부모델시험은 실험동물을 이용하지 않고 세포를 이용하여 피부자극성을 평가할 수 있는 시험으로 실험동물 대체시험법이다. 본 연구에서 사용한 인공피부세포는 국내에서 검증된 것으로 알려진 (주)엠티티에서 개발된 인공피부 모델 KeraskinTM을 사용하여 MTT assay를 실시하였다.
성능/효과
In vivo 시험과 in vitro 시험 결과 간의 민감성을 평가하기 위하여 in vitro 시험결과가 비자극성일 때 비자극성으로 판정되는 비율, 자극성일 때 자극성으로 판정하는 비율을 백분율(%)로 산출하여 기존의 시험의 자극성 분류와의 유사성정도를 평가한 결과, in vivo 시험에서 무자극성 농약 6품목 in vitro 시험에서도 무자극성을 나타내어 100% 의 동일한 결과를 나타내었다. 경도의 자극성 농약 4품목은 in vitro 시험에서 무자극성을 나타내어 0%를 나타내어 결과의 유사성은 없는 것으로 평가되었다.
In vivo 시험에서 자극성이 없는 농약은 in vitro 시험에서 85% 이상의 세포생존율을 보였고, 경도의 자극성이 있는 농약 또한 78.8%이상의 세포생존율을 나타내었다. 따라서 세포생존율이 50% 이상일 경우 자극성이 없는 물질로 분류되는 기준에 따라 자극성 없는 농약과 경도의 자극성 농약은 비자극성 물질로 평가되었다.
MTT assay를 이용하여 세포생존율을 측정한 결과, 자극성이 없는 농약 6 품목 Kasugamycin-thiophanate-methyl SC은 95.7%, Bensulfuron-methyl-Mefenacet SC 97.3%, Carbosulfan-halosulfuron-methyl-mefenacet GR 93.1%, Bifenazate SC 85.0%, Carbosulfan EW 92.2%, Metolachlor Pendimethalin EC 90.1%의 세포생존율은 나타내었다. 경도의 자극성 농약 4품목 Metalaxyl-M SL은 78.
In vivo 시험과 in vitro 시험 결과 간의 민감성을 평가하기 위하여 in vitro 시험결과가 비자극성일 때 비자극성으로 판정되는 비율, 자극성일 때 자극성으로 판정하는 비율을 백분율(%)로 산출하여 기존의 시험의 자극성 분류와의 유사성정도를 평가한 결과, in vivo 시험에서 무자극성 농약 6품목 in vitro 시험에서도 무자극성을 나타내어 100% 의 동일한 결과를 나타내었다. 경도의 자극성 농약 4품목은 in vitro 시험에서 무자극성을 나타내어 0%를 나타내어 결과의 유사성은 없는 것으로 평가되었다. 중도 및 강도의 자극성 농약 6품목은 in vitro 시험에서도 자극성으로 분류되어 100% 동일한 결과를 나타애서 유사성이 높은 것으로 평가되었다.
그러나 현행 기준과 같이 토끼를 이용한 in vivo 시험에서는 자극성은 비자극성, 경도, 중도 및 강도로 4등급으로 분류되나 세포를 이용한 자극성은 비자극성 및 자극성 물질 2단계로 분류되어 특히 경도자극성에 대한 평가가 불분명한 결과를 보였다. Moon et al.
농약은 다양한 형태의 제품으로 생산되고 있는데 유제, 액상수화제 등의 액상 형태는 시험수행에 있어서 문제점이 없었으나, 수화제, 입제 등이 고상형태의 경우에는 세포전체에 도포되면서 약제에 의한 영향보다는 배양이 어려운 문제가 발생되었으며, 경도의 자극성을 가진 농약에 대한 in vitro 인공피부모델시험은 비자극성물질로 분류되어 in vivo 시험과의 차이를 나타내어 민감도 부분에서는 단점으로 평가되었다.
8%이상의 세포생존율을 나타내었다. 따라서 세포생존율이 50% 이상일 경우 자극성이 없는 물질로 분류되는 기준에 따라 자극성 없는 농약과 경도의 자극성 농약은 비자극성 물질로 평가되었다.
이상의 결과에서 중도 이상의 농약의 경우 in vivo 시험과 in vitro 시험의 결과간의 유사성이 인정되었으며, KeraSkinTM 모델로도 피부자극성 평가가 가능한 것으로 판단되었다.
경도의 자극성 농약 4품목은 in vitro 시험에서 무자극성을 나타내어 0%를 나타내어 결과의 유사성은 없는 것으로 평가되었다. 중도 및 강도의 자극성 농약 6품목은 in vitro 시험에서도 자극성으로 분류되어 100% 동일한 결과를 나타애서 유사성이 높은 것으로 평가되었다.
후속연구
농약의 피부노출은 특히 농작업자가 농약을 살포시 자주 그리고 직접적으로 노출되는 경로이며 농약의 피부자극성의 경우 민감도가 사람에 따라 많은 차이를 보이기 때문에 피부자극성 대체시험법 적용여부는 추후 추가적인 검토가 필요할 것으로 판단되며, 앞으로 농약안전성평가를 위한 동물실험을 대체할 수 있는 시험법에 대하여 지속적인 검증연구를 통해 농약등록 시험기준과 방법을 개선할 필요성이 있다고 사료된다.
본 연구를 통해 인공피부모델시험은 실험동물을 이용하지 않고 또한 용이한 사용방법으로 피부의 자극성 정도를 분류할 수 있는 시험으로는 인정되었으나, 시험수행 및 자극성 평가에 있어서 문제점이 제시되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동물시험을 대체하려는 연구는 국내에서는 어디를 중심으로 진행되는가?
현재 동물시험을 대체하려는 연구는 유럽 ECVAM (European Center for the Validaton of Alternative Methods) 및 ICCVAM(Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) 등을 중심으로 진행되고 있고(EC, 1999), 국내에서는 KoCVAM(Korean center for the Validation of Alternative Methods) 중심으로 진행되고 있다(Sohn et al., 2010).
3R 원칙은 무엇인가?
농약 등을 포함한 화학물질의 독성을 평가하기 위해 많은 실험동물을 사용하고 있다. 최근 각국에서 동물실험에 대한 생명윤리 강화와 3R 원칙(Reduction, Replacement, Refinement) 으로 실험동물 보호를 위해 동물시험에 대하여 규제를 강화하고 있으며, 실험동물 대체법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Botham, 2004; Fentem, 2001; Kimber, 1999).
농약을 위해 인공피부모델시험을 할때, 시험수행 및 자극성 평가에 있어서 문제점은 무엇인가?
농약은 다양한 형태의 제품으로 생산되고 있는데 유제, 액상수화제 등의 액상 형태는 시험수행에 있어서 문제점이 없었으나, 수화제, 입제 등이 고상형태의 경우에는 세포전체에 도포되면서 약제에 의한 영향보다는 배양이 어려운 문제가 발생되었으며, 경도의 자극성을 가진 농약에 대한 in vitro 인공피부모델시험은 비자극성물질로 분류되어 in vivo 시험과의 차이를 나타내어 민감도 부분에서는 단점으로 평가되었다.
참고문헌 (14)
Botham, P. A. (2004) The validation of in vitro methods for skin irritation. Toxicology Letter 149:387-390.
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Fentem, J. H., D. Briggs, C. Chesne, G. R. Elliott, J. W. Harbell , J. R. Heylings, P. Portes, R. Roguet, van de Sandt JJ and P. A. Botham (2001) A prevalidation study on in vitro test for acute skin irritation: results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 15:57-93.
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