선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 실리콘 코 보형물의 기계적 성질은 임상에 사용할 수 있는지 판단하기 위한 척도로 사용될 수 있다. 본 연구에서는 3 점 굽힘 시험을 통한 코 보형물 인공지지체와 임상허가를 받은 실리콘 코 보형물 사이의 굽힘 거동의 비교를 통해 제작된 인공지지체의 기계적 성질을 평가하였다.
제안 방법
- Polycaprolactone (PCL)은 Food and Drug Administration (FDA)의 승인을 받은 합성 재료로서 연골 조직 재생에 적합한 성질들을 가지고 있다.(4) 또한 본 연구에서는 상용 CAD 프로그램으로 코 보형물 형상을 디자인 하였으며, 자유형상제작 장비 중에 하나인 다축 적층 시스템을 이용해 PCL 로 구성된 코 보형물 형상의 인공지지체를 제작하였다. 그리고 연골 세포를 인공지지체에 파종한 후, 세포의 증식, 분화 결과를 관찰하였고, 이를 통해 코 연골 조직 재생의 가능성을 확인할 수 있었다.
- 7, 14 일째에 인공지지체 안에 존재하는 연골 세포 및 생성된 세포 외 기질(Extracellular matrix, ECM)의 분포를 확인하기 위하여 주사전자현미경(JEOL, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- 코 성형에 많이 사용되고 있는 코 보형물로부터 단면 모양을 측정하여 CAD 모델을 디자인할 수 있었다. CAD 모델은 다축 적층 시스템의 가공 정보로 변환시키기 위해 Standard Template Library (STL) 포맷으로 변환하였다.
- CAD/CAM 시스템을 이용하여 코 보형물 인공지지체의 가공 정보를 생성하였고, 다축 적층 시스템의 4 개의 축을 이용하여 PCL 재료의 인공지지체를 빠르게 제작할 수 있었다. 제작된 인공지지체의 대략적인 크기는 길이 55 mm, 너비 10 mm, 높이 8 mm 이고 공극률은 약 66.
- 대체적 인공지지체의 모든 부분에서 세포들이 균일한 환경에 노출되어 있는지 확인하기 위해 코보형물 모양의 인공지지체를 삼등분 하여 양 끝부분의 세포 특성과 가운데 부분의 세포 특성을 비교하는 실험을 수행하였다.
- 01 mm/s 의 속도로 변형을 가하여 굽힘을 발생시켰고, 변형량에 따른 반력을 측정하였다. 또한 비교 분석을 위해 임상허가를 받은 실리콘 코 보형물의 굽힘 거동을 같은 방법으로 측정하였고, 코 보형물 인공지지체 결과와 비교하였다.
- 본 연구에서 자유형상제작 기술을 이용하여 시술에 사용되고 있는 코 보형물의 외형을 모방하여 코 보형물 형태의 인공지지체를 제작할 수 있었다.
- 생분해성 생체고분자인 PCL 을 10 cc 용량의 시린지(Syringe)에 주입한 뒤 재료의 녹는점인 65 ℃ 에서 약 20 분간 가열하여 충분히 녹인 후, 640kPa 의 공압 및 이송 속도 등 가공에 필요한 파라미터 값을 설정하여 150 μm 의 선폭과 300 μm의 삼각형 모양의 공극을 가지는 코 보형물 형상의 인공지지체를 제작하였다.
- 세포 배양 7, 14 일 때에 인공지지체를 길이 방향으로 삼등분 하여 내부에 있는 세포를 Papain 으로 Digestion 하고, 그 후 상층액을 이용하여 DNA와 Glycosaminoglycan(GAG)의 농도를 정량 하였다. DNA 는 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, USA)를 이용한 정량 방법(9)을, GAG 은 1,9-dimethylmethylene blue(Sigma-Aldrich, USA)를 이용한 정량 방법(4)을 사용하였으며, 각각 Shark chondroitin sulfate A(Sigma-Aldrich, USA)와 Calf thymus DNA(SigmaAldrich, USA)로 Standard curve 를 작성하여 측정값을 정량화 하였다.
- 세포의 생존능력을 확인하는 Live/dead cell assay를 수행하기 위하여 동적 배양 1, 7, 14 일째에 Calcein AM(Live cells, Green color)과 Ethidium homodimer(Dead cells, Red color)을 염색하였고 Confocal laser microscope (LSM 510 Meta, Carl Zeiss, Switzerland)를 이용하여 관찰하였다.
- 제작된 코 보형물 인공지지체가 코 성형에 적합한 물성을 가지고 있는지 확인하기 위해 3 점 굽힘 시험에 의한 굽힘 거동을 평가하였다. Figure 3의 그림처럼 인공지지체의 양 끝을 고정한 후, 중간 부분에 약 0.
- 결국 배양액은 인공지지체 내부로 골고루 퍼지게 된다. 진공파종법의 적용을 위해 비중격 유래 연골 세포가 포함되어 있는 배양액(1x 105 cells/scaffold)을 인공지지체 위에 파종한 후, 진공 상태를 30 초간 유지해주고 인공지지체로부터 흘러내린 배양액을 다시 인공지지체에 파종하는 과정을 6 회 반복하였다. 파종 후, 대체적 인공지지체 내부에 충분한 양의 산소, 영양분을 공급해주기 위해 Spinner flask 를 이용한 동적 배양법(Dynamic culture method)을 수행하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 세포는 사람 비중격 유래 연골 세포이며 DMEM High glucose(Sigma-Aldrich, USA)에 10% FBS(Sigma-Aldrich, USA)와 1% Penicillin-streptomycin(GIBCO/BRL, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 배지를 공급하여 배양하였다. 대체적 인공지지체에 세포를 균일한 분포로 파종하기 위하여 진공파종법(Vacuum seeding method)를 사용하였다.
- 대체적의 코 보형물 형상을 지닌 인공지지체의 증식 및 기능 평가 실험 후, 코 보형물의 위치에 따른 세포의 증식과 기능의 차이를 비교 분석하기 위해 일원 배치 분산 분석(One-way ANOVA)를 이용하였다. 통계학적 분석을 위해 각 실험 군 별로 3 개의 샘플을 이용하였으며, 유의 수준은 95%로 설정하였다.
데이터처리
- 대체적의 코 보형물 형상을 지닌 인공지지체의 증식 및 기능 평가 실험 후, 코 보형물의 위치에 따른 세포의 증식과 기능의 차이를 비교 분석하기 위해 일원 배치 분산 분석(One-way ANOVA)를 이용하였다. 통계학적 분석을 위해 각 실험 군 별로 3 개의 샘플을 이용하였으며, 유의 수준은 95%로 설정하였다.
이론/모형
- 세포 배양 7, 14 일 때에 인공지지체를 길이 방향으로 삼등분 하여 내부에 있는 세포를 Papain 으로 Digestion 하고, 그 후 상층액을 이용하여 DNA와 Glycosaminoglycan(GAG)의 농도를 정량 하였다. DNA 는 Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, USA)를 이용한 정량 방법(9)을, GAG 은 1,9-dimethylmethylene blue(Sigma-Aldrich, USA)를 이용한 정량 방법(4)을 사용하였으며, 각각 Shark chondroitin sulfate A(Sigma-Aldrich, USA)와 Calf thymus DNA(SigmaAldrich, USA)로 Standard curve 를 작성하여 측정값을 정량화 하였다.
- 본 실험에서 사용된 세포는 사람 비중격 유래 연골 세포이며 DMEM High glucose(Sigma-Aldrich, USA)에 10% FBS(Sigma-Aldrich, USA)와 1% Penicillin-streptomycin(GIBCO/BRL, Grand Island, NY, USA)을 첨가한 배지를 공급하여 배양하였다. 대체적 인공지지체에 세포를 균일한 분포로 파종하기 위하여 진공파종법(Vacuum seeding method)를 사용하였다.(7) Figure 4 에 보이는 것처럼 보통 세포배양액을 인공지지체에 파종하면 공기의 저항에 가로막혀 배양액이 인공지지체 내부로 골고루 침투하지 못하고 공기는 내부에 갇히게 된다.
- 본 연구에서는 코 보형물 형상의 인공지지체를 제작하기 위하여 자유형상기반 제작 기술 중 하나인 다축 적층 시스템을 이용하였다.(6) 본 시스템은 리니어 모터와 엔코더를 이용하여 X-Y 축의 위치 제어를 구현하였고, 볼 스크류와 AC 서보 모터를 이용한 4 개의 Z 축에는 각 헤드의 구동 축이 별도로 존재하여 개별적 위치 제어가 가능하다.
- 코 보형물의 CAD 모델을 설계하기 위해 CATIA 라는 상용 CAD 프로그램을 이용하였다. 코 성형에 많이 사용되고 있는 코 보형물로부터 단면 모양을 측정하여 CAD 모델을 디자인할 수 있었다.
- 진공파종법의 적용을 위해 비중격 유래 연골 세포가 포함되어 있는 배양액(1x 105 cells/scaffold)을 인공지지체 위에 파종한 후, 진공 상태를 30 초간 유지해주고 인공지지체로부터 흘러내린 배양액을 다시 인공지지체에 파종하는 과정을 6 회 반복하였다. 파종 후, 대체적 인공지지체 내부에 충분한 양의 산소, 영양분을 공급해주기 위해 Spinner flask 를 이용한 동적 배양법(Dynamic culture method)을 수행하였다.(8) 배양액은 3 일 주기로 교체하였으며 5% CO2, 37 ℃ 환경을 유지하였다.
성능/효과
- (6) 본 시스템은 리니어 모터와 엔코더를 이용하여 X-Y 축의 위치 제어를 구현하였고, 볼 스크류와 AC 서보 모터를 이용한 4 개의 Z 축에는 각 헤드의 구동 축이 별도로 존재하여 개별적 위치 제어가 가능하다. 생분해성 생체고분자는 온도 및 공압 조절장치에 의하여 분사되며 각각의 조건들은 독립적으로 조절이 가능하다.
- 또한 Figure 8 에서는 주사전자현미경의 이미지를 통하여 세포 및 기질의 분포가 시간이 지남에 따라 증가함을 확인할 수 있었다. 7 일 후에는 세포 및 기질의 분포가 인공지지체 선을 따라 증가하고 있고, 14 일 차에는 선과 공극이 모두 덮어질 만큼 세포와 기질의 양이 증가하였음을 확인할 수 있었다.
- Figure 7 에서 보이는 바와 같이 배양 1 일째에 획득한 결과에서 대부분의 세포가 인공지지체 표면 및 내부에서 생존하고 있고, 균일하게 분포되어 있음을 확인할 수 있었다. 7 일 후에도 거의 모든 세포는 생존해 있었고 인공지지체의 선을 따라 증식하고 있었으며, 14 일 후에는 세포가 공극사이를 모두 메울 만큼 많이 증식해 있음을 확인할 수 있었다.
- (4) 또한 본 연구에서는 상용 CAD 프로그램으로 코 보형물 형상을 디자인 하였으며, 자유형상제작 장비 중에 하나인 다축 적층 시스템을 이용해 PCL 로 구성된 코 보형물 형상의 인공지지체를 제작하였다. 그리고 연골 세포를 인공지지체에 파종한 후, 세포의 증식, 분화 결과를 관찰하였고, 이를 통해 코 연골 조직 재생의 가능성을 확인할 수 있었다.
- 이는 추후에 코 보형물 인공지지체를 조직 재생에 사용하여도 최종적으로 조직 재생과 분화가 균일하게 일어날 것이라는 지표가 될 수 있다. 또한 대체적임에도 불구하고 인공지지체 가운데와 양 끝 부분, 그리고 표면과 내부의 증식 정도가 비교적 균일함을 각각 DNA 정량과 Live/dead cell assay 를 통해 관찰할 수 있었고, 이는 동적배양법에 의한 효과라고 유추할 수 있다.
- 또한 진공파종법을 이용하여 연골 세포를 인공지지체에 균일한 분포로 파종을 할 수 있었고, 동적배양법으로 인공지지체 내부에 부착된 세포에 충분한 양의 산소와 영양분을 공급하여 증식률과 생존율을 높일 수 있었다. 또한 연골 기질을 구성하는 물질인 GAG 도 시간에 따라 다량 생성되어 있었고, 이를 통해 연골 조직으로서의 기능이 잘 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 하지만 실제 임상에 적용하기 위해서는 성형에서 안면의 치수 변화에 민감한 것만큼, 인공지지체의 생분해되는 부분을 연골 조직이 잘 채워나가는지에 대한 확인이 필요할 것이다.
- 또한 진공파종법을 이용하여 연골 세포를 인공지지체에 균일한 분포로 파종을 할 수 있었고, 동적배양법으로 인공지지체 내부에 부착된 세포에 충분한 양의 산소와 영양분을 공급하여 증식률과 생존율을 높일 수 있었다. 또한 연골 기질을 구성하는 물질인 GAG 도 시간에 따라 다량 생성되어 있었고, 이를 통해 연골 조직으로서의 기능이 잘 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
- 단면 모양에 맞춰 분사 경로 생성시키기 위해, 단면의 외곽 루프를 이루고 있는 직선들로부터 교점 계산을 통해 횡 방향의 직선들을 정의한다. 이러한 직선들을 각 층마다 120 도씩 반복적으로 회전시켜 삼각형 모양의 공극 구조를 가지는 인공지지체의 가공정보를 얻을 수 있었다.(5) Figure 1 은 코 보형물의 CAD 모델이 코 보형물 인공지지체의 가공정보로 변환되는 과정을 나타내고 있다.
- 이는 인공지지체의 굽힘에 대한 저항이 실리콘 보형물보다 크다는 것을 나타낸다. 이상적인 보형물은 굽힘에 대한 저항이 작고 유연해야 한다는 점을 고려했을 때, 본 연구에서 제작된 인공지지체는 실리콘 코 보형물에 비해 코 성형에 좋지 않은 기계적 성질을 가지고 있다고 판단할 수 있으며, 이는 인공지지체가 조직을 완전히 대체하기 전까지 기계적 성질과 관련된 문제들을 일으킬 가능성이 크다는 것을 뜻한다. 그러나 본 연구는 생분해성 재료를 이용해 기존의 실리콘 코 보형물과 같은 외형 및 사이즈를 지닌 인공지지체를 제작한 것의 의의가 크며, 기계적 성질의 문제는 향후 선폭이나 공극률을 조절함으로써 실리콘 코 보형물 수준으로 맞춰 나갈 수 있을 것으로 기대된다.
- CAD/CAM 시스템을 이용하여 코 보형물 인공지지체의 가공 정보를 생성하였고, 다축 적층 시스템의 4 개의 축을 이용하여 PCL 재료의 인공지지체를 빠르게 제작할 수 있었다. 제작된 인공지지체의 대략적인 크기는 길이 55 mm, 너비 10 mm, 높이 8 mm 이고 공극률은 약 66.7 % 로 계산되었다.
후속연구
- 이상적인 보형물은 굽힘에 대한 저항이 작고 유연해야 한다는 점을 고려했을 때, 본 연구에서 제작된 인공지지체는 실리콘 코 보형물에 비해 코 성형에 좋지 않은 기계적 성질을 가지고 있다고 판단할 수 있으며, 이는 인공지지체가 조직을 완전히 대체하기 전까지 기계적 성질과 관련된 문제들을 일으킬 가능성이 크다는 것을 뜻한다. 그러나 본 연구는 생분해성 재료를 이용해 기존의 실리콘 코 보형물과 같은 외형 및 사이즈를 지닌 인공지지체를 제작한 것의 의의가 크며, 기계적 성질의 문제는 향후 선폭이나 공극률을 조절함으로써 실리콘 코 보형물 수준으로 맞춰 나갈 수 있을 것으로 기대된다.
- 하지만 실제 임상에 적용하기 위해서는 성형에서 안면의 치수 변화에 민감한 것만큼, 인공지지체의 생분해되는 부분을 연골 조직이 잘 채워나가는지에 대한 확인이 필요할 것이다. 따라서 향후에는 인체 내에서 인공지지체가 연골 조직으로 잘 대체될 수 있는지 확인하기 위한 동물 실험을 진행할 계획이다.
- 또한 연골 기질을 구성하는 물질인 GAG 도 시간에 따라 다량 생성되어 있었고, 이를 통해 연골 조직으로서의 기능이 잘 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 하지만 실제 임상에 적용하기 위해서는 성형에서 안면의 치수 변화에 민감한 것만큼, 인공지지체의 생분해되는 부분을 연골 조직이 잘 채워나가는지에 대한 확인이 필요할 것이다. 따라서 향후에는 인체 내에서 인공지지체가 연골 조직으로 잘 대체될 수 있는지 확인하기 위한 동물 실험을 진행할 계획이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.