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문제 정의
- 이 연구는 인삼의 대표적인 지상부 병해 점무늬 · 탄저병 방제용 길항미생물을 선발 및 동정하여 화학농약 사용을 절감하고 친환경적인 인삼 병해 방제를 위해 수행되었다.
제안 방법
- 16s rRNA 분석을 위한 PCR 프라이머는 universal primer 27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3‘)와 1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)를 사용하였고 (Reysenbach et al., 1992), 정방향 프라이머 27F 1 ㎕, 역방향 프라이머 1492R 1 ㎕, DNA 20 ng/㎕, 4dNTP(10 mM) 2 ㎕, 10 × Tagq 버퍼 2.5 ㎕, solgent EF Tag 0.3 ㎕, 멸균수 17.2 ㎕가 혼합된 총 25 ㎕의 PCR 혼합 반응액을 94℃ 20초동안 가열하여 DNA의 변성(denature)을 유도한 후 50℃로 온도를 낮추어 단일 가닥으로 변성된 움에 프라이머가 일치하는 sequence에 결합할 수 있도록 40초 동안 반응시켰으며 이 후 72℃에서 온도를 높여 DNA 복제를 1분 30초 동안 유도하는 주기(cycle)를 1 주기(cycle)로 하여 30 주기를 실시하였다.
- A. panax와 C. gloeosporioides을 petri dish (85 × 15 ㎜)에 25℃에서 7일간 암 배양한 뒤, 포자의 생성정도를 현미경으로 관찰한 다음 petridish에 적당량의 멸균수를 넣고 loop로 병원균을 모두 긁은 뒤 4겹의 거즈에 거른 후 거른 여액에 멸균수를 추가하여 50 ㎖로 조정하였다.
- 실험에 사용된 인삼은 7년근 재래종으로 병은 자연발병을 유도하였으며, 분리 배양한 길항미생물 KC1을 50배 희석하여 4반복으로 처리하였다. Negative control로 아무런 약제도 처리하지 않은 실험구를 사용하였고, positive control 로는 이미녹타딘트리스아베실레이트(iminoctadime albesilate) 계통의 인삼 점무늬병, 탄저병 억제에 쓰이는 약제를 규정대로 희석하여 사용하였으며 병 방제가 조사는 7일 뒤에 이루어졌다. 병 방제가의 계산은 다음과 같다.
- 2 ㎕가 혼합된 총 25 ㎕의 PCR 혼합 반응액을 94℃ 20초동안 가열하여 DNA의 변성(denature)을 유도한 후 50℃로 온도를 낮추어 단일 가닥으로 변성된 움에 프라이머가 일치하는 sequence에 결합할 수 있도록 40초 동안 반응시켰으며 이 후 72℃에서 온도를 높여 DNA 복제를 1분 30초 동안 유도하는 주기(cycle)를 1 주기(cycle)로 하여 30 주기를 실시하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 16s rRNA 부분이라 예상되는 부분을 분리하여, RNA 염기서열 분석을 솔젠트(Solgent, Daejeon Korea)에 의뢰하였다.
- 길항미생물의 병 치료효과 검정을 위해 준비한 pot에 포자현탁액 50 ㎖을 먼저 처리한 후 24시간동안 비닐봉투를 덮어 과습한 발병환경을 조성하였고, 하루 뒤에 희석한 길항미생물 50 ㎖을 엽면 살포하고 다시 비닐봉투를 덮어 7일 후 조사를 실시하였다. 길항미생물의 병 예방효과 검정을 휘해서는 병원균을 처리하기 하루 전에 희석한 길항미생물을 50 ㎖씩 엽면 살포하였고, 위와 같은 방법으로 발병환경을 조성하였다. 각 실험은 5 반복으로 실시하였다.
- 또한 positive control로 이미녹타딘트리스아베실레이트 (iminoctadime albesilate) 계통의 화학농약을 사용했으며, 규정대로 희석하여 50 ㎖씩 엽면 살포하고, negative control은 증류수를 사용하여 50 ㎖씩 엽면 살포하였다. 길항미생물의 병 치료효과 검정을 위해 준비한 pot에 포자현탁액 50 ㎖을 먼저 처리한 후 24시간동안 비닐봉투를 덮어 과습한 발병환경을 조성하였고, 하루 뒤에 희석한 길항미생물 50 ㎖을 엽면 살포하고 다시 비닐봉투를 덮어 7일 후 조사를 실시하였다. 길항미생물의 병 예방효과 검정을 휘해서는 병원균을 처리하기 하루 전에 희석한 길항미생물을 50 ㎖씩 엽면 살포하였고, 위와 같은 방법으로 발병환경을 조성하였다.
- 5 × 1010 cfu/㎖로 희석하여 폿트 당 50 ㎖씩 엽면 살포하여 처리하였다. 또한 positive control로 이미녹타딘트리스아베실레이트 (iminoctadime albesilate) 계통의 화학농약을 사용했으며, 규정대로 희석하여 50 ㎖씩 엽면 살포하고, negative control은 증류수를 사용하여 50 ㎖씩 엽면 살포하였다. 길항미생물의 병 치료효과 검정을 위해 준비한 pot에 포자현탁액 50 ㎖을 먼저 처리한 후 24시간동안 비닐봉투를 덮어 과습한 발병환경을 조성하였고, 하루 뒤에 희석한 길항미생물 50 ㎖을 엽면 살포하고 다시 비닐봉투를 덮어 7일 후 조사를 실시하였다.
- 각 실험은 5 반복으로 실시하였다. 병의 예방 및 치료 방법 조사는 접종 후 7일 후에 실시하였으며 병의 치료 및 예방 효과는 병발생지수로 조사하였다. 발병엽율 (Disease incidence, %) 계산은 다음과 같다.
- 선발한 길항미생물은 TSB 액체 배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 120 rpm으로 3일간 진탁 배양하고, 배양한 균주 50 ㎎ 는 솔젠트 (Solgent, Deajeon Korea)의 SolgTM Genomic DNA Prep Kit와 동봉된 프로토콜에 따라 genomic DNA를 추출하였고 전기 영동하여 PCR에 사용하였다. 16s rRNA 분석을 위한 PCR 프라이머는 universal primer 27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3‘)와 1492R(5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)를 사용하였고 (Reysenbach et al.
- 선발한 길항미생물의 A. panax에 대한 방제효과를 조사하였다 (Table 3). 인삼 점무늬병이 발병하기 전 길항미생물을 처리하여 점무늬병의 예방효과를 관찰한 결과 KC1, KC4이 발병률 9%, 15%로 병원균만 처리한 대조구의 발병률 17%보다 낮은 발병률을 보였다.
- 염기서열은 BioEdit program (Tom Hall, Carlsbad USA) 을 이용해 편집하였으며, NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색프로그램을 통해 염기서열의 상동성을 분석하였다. 계통도는 MEGA v4.
- , 2002). 이 후 단일군집를 형성 하는 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물는 Tryptic Soy Broth(TSB) 액체배지에 배양한 후 생리식염수(0.
- 전통 발효식품에서 분리한 11종 미생물의 항균력을 조사하기 위해 A. panax와 C. gloeosporioides과의 대치배양으로 실시하였다. 대치배양을 통한 우수 길항 균수 선발실험에서 항균력을 조사한 결과 인삼 점무늬병원균에 대해서 저지선이 5 ㎜ 이상인 균은 KC1, KC2, KC4, DJ5으로 총 5개의 균이 우수한 길항작용을 보였고, 인삼 탄저병원균과 대치 배양했을때 좀 더 강력한 길항력을 보인 균은 4균주로 KC1, KC2, KC4, DJ2, DJ5가 선발되었다.
대상 데이터
- 1) 두 균주와 Bacillus속 균주 Bacillus sp. B SAP01 (GenBank: JN872502.1), Bacillus thuringiensis Pp14 (GenBank: JQ861546.1) 및 Bacillus megaterium Z2 (GenBank: JQ864207.1) 16s rRNA의 염기서열을 사용하였다.
- 길항미생물의 포장에서의 실제 병 억제 효과를 검증하기 위해 충북 음성에 위치한 인삼특작부 시험포장에 실증 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 인삼은 7년근 재래종으로 병은 자연발병을 유도하였으며, 분리 배양한 길항미생물 KC1을 50배 희석하여 4반복으로 처리하였다.
- 생물검정에 사용한 인삼은 1년생 자경종으로 한 폿트 (10 × 10 ㎝, W × H)당 3개씩 정식하여 약 2개월 동안 온실에서 재배하였다.
- 길항미생물의 포장에서의 실제 병 억제 효과를 검증하기 위해 충북 음성에 위치한 인삼특작부 시험포장에 실증 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 인삼은 7년근 재래종으로 병은 자연발병을 유도하였으며, 분리 배양한 길항미생물 KC1을 50배 희석하여 4반복으로 처리하였다. Negative control로 아무런 약제도 처리하지 않은 실험구를 사용하였고, positive control 로는 이미녹타딘트리스아베실레이트(iminoctadime albesilate) 계통의 인삼 점무늬병, 탄저병 억제에 쓰이는 약제를 규정대로 희석하여 사용하였으며 병 방제가 조사는 7일 뒤에 이루어졌다.
- 자연발효식품의 보관과정에서 발생하는 Bacillus 균을 분리하기 위해 재래식 된장 5종류, 김치 6종류에서 10 ~ 20 g 씩 수시로 채집하여 길항미생물의 분리원으로 이용하였다. 된장, 김치 등은 0.
데이터처리
- *Means separation was conducted with by Duncan’ multiple range test.
이론/모형
- 염기서열은 BioEdit program (Tom Hall, Carlsbad USA) 을 이용해 편집하였으며, NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST 검색프로그램을 통해 염기서열의 상동성을 분석하였다. 계통도는 MEGA v4.1 program (Nei and Kumar, 2000; Tamura et al., 2007)으로 neighbor joining method (Saitou and Nei, 1987)를 이용하여 작성하였고, Bootstrap analysis 1000 반복으로 수행하였다. 계통도 작성은 우리가 선발한 길항 균의 염기서열과 문헌 검색을 통하여 길항력이 인정된 Bacillus subtilis LSBA1975 (GenBank: FJ908706.
성능/효과
- Bacillus subtilis KC1을 화학농약을 대신하여 포장에 처리해본 결과, 58%의 방제가를 보였다. 이는 화학농약 대조구의 방제가 77%의 약 2/3 수준으로 화학농약만큼은 아니지만 포장에서도 어느 정도의 방제효과가 있음을 알 수 있다 (Fig.
- 1) 와도 99%의 유사도를 보였다. KC2는 Bacillus subtilis (GenBank: JQ308571.1)와 99%, Bacillus amyloliquefaciens (GenBank: JF460736.1) 와 99%의 유사도를 보였고, KC4는 Bacillus subtilis (EU346662.1), Bacillus amyloliquefaciens (JQ229807.1)와 99% 유사도를 보였다. DJ5는 Bacillus subtilis (GenBank: HQ441254.
- 1)와 99%의 유사도를 보였다. 길항미생물 KC1, KC2, KC4 및 DJ5를 16s rRNA sequence로 동정하고 길항력이 인정된 B. subtilis LSBA1975, B. subtilis LEV-006 두 균주, Bacillus속 균주 3종의 16s rRNA와 neighbor joining method를 활용하여 계통도를 작성한 결과 선발한 길항미생물을 Bacillus subtilis로 동정되었다 (Fig. 1).
- gloeosporioides과의 대치배양으로 실시하였다. 대치배양을 통한 우수 길항 균수 선발실험에서 항균력을 조사한 결과 인삼 점무늬병원균에 대해서 저지선이 5 ㎜ 이상인 균은 KC1, KC2, KC4, DJ5으로 총 5개의 균이 우수한 길항작용을 보였고, 인삼 탄저병원균과 대치 배양했을때 좀 더 강력한 길항력을 보인 균은 4균주로 KC1, KC2, KC4, DJ2, DJ5가 선발되었다. 인삼점무늬병과 탄저병에 공통 적으로 길항력을 보이는 미생물은 KC1, KC2, KC4, DJ5으로 총 4종의 Bacillus균이 생물적 방제 균주로서 가능성이 확인되었다.
- 대치배양을 통해 탄저병 억제효과를 보였던 길항미생물 4종의 탄저병에 대한 예방효과 실험결과 무처리 대조구가 95%의 높은 이병률을 보인 반면에 길항미생물은 12~19%의 낮은 발병률을 보여 탄저병에 대한 예방효과가 있음을 입증하였다 (Fig. 3). 반대로 탄저병의 치료효과 검정을 위한 생물실험 결과, 선발한 균주 4종 모두 치료효과가 없음을 확인하였다.
- 반대로 탄저병의 치료효과 검정을 위한 생물실험 결과, 선발한 균주 4종 모두 치료효과가 없음을 확인하였다. 무처리 대조구는 95%의 이병률을 보였고, 4종의 길항미생물은 99~100%의 이병률을 보였지만 이들 사이의 유의성은 나타나지 않았고 모두 발병하였음을 알 수 있다. 화학농약을 처리한 대조구만이 탄저병원균을 효과적으로 치료하여 0 %의 발병률을 보였다 (Table 4).
- 3). 반대로 탄저병의 치료효과 검정을 위한 생물실험 결과, 선발한 균주 4종 모두 치료효과가 없음을 확인하였다. 무처리 대조구는 95%의 이병률을 보였고, 4종의 길항미생물은 99~100%의 이병률을 보였지만 이들 사이의 유의성은 나타나지 않았고 모두 발병하였음을 알 수 있다.
- 분리된 길항균의 16s rRNA PCR 생산물의 염기서열을 NCBI Genebank에 등록된 다른 균주와 염기서열을 비교, 분석한 결과, 길항미생물 KC1은 Bacillus subtilis (GenBank: JQ308555.1)와 99%, Bacillus amyloliquefaciens (GenBank: GQ340497.1)와 99%, Bacillus vallismortis (GenBank: JQ735970.1) 와도 99%의 유사도를 보였다. KC2는 Bacillus subtilis (GenBank: JQ308571.
- panax에 대한 방제효과를 조사하였다 (Table 3). 인삼 점무늬병이 발병하기 전 길항미생물을 처리하여 점무늬병의 예방효과를 관찰한 결과 KC1, KC4이 발병률 9%, 15%로 병원균만 처리한 대조구의 발병률 17%보다 낮은 발병률을 보였다. 하지만 Duncan분석 결과 유의성은 입증되지 않다.
- 대치배양을 통한 우수 길항 균수 선발실험에서 항균력을 조사한 결과 인삼 점무늬병원균에 대해서 저지선이 5 ㎜ 이상인 균은 KC1, KC2, KC4, DJ5으로 총 5개의 균이 우수한 길항작용을 보였고, 인삼 탄저병원균과 대치 배양했을때 좀 더 강력한 길항력을 보인 균은 4균주로 KC1, KC2, KC4, DJ2, DJ5가 선발되었다. 인삼점무늬병과 탄저병에 공통 적으로 길항력을 보이는 미생물은 KC1, KC2, KC4, DJ5으로 총 4종의 Bacillus균이 생물적 방제 균주로서 가능성이 확인되었다. (Table 2)
- 재래식 된장 5종류, 김치 6종류에서 분리한 후 80℃에서 10분간 가열하고 난 후에 생존 미생물을 조사한 결과 된장에서 6종, 김치에서 5종 총 11종의 미생물이 분리되었다(Table 1).
- 또한 무처리 대조구와 같거나 조금 높은 발병률을 보인 KC2, DJ5 또한 Duncan분석 결과 유의적인 차이가 나타나지 않아 병 발생을 조장하지는 않았다. 점무늬병을 먼저 일으키고 길항미생물의 치료효과 검정결과 KC1, KC2, KC4이 6%, 7%, 6%의 발병률을 보였다. 이는 화학농약을 처리한 대조구와 같은 수준의 점무늬병 치료효과가 있음을 나타내었지만 무처리 대조구가 낮은 발병률을 보여 추가적인 실험이 필요하다 (Fig.
- 무처리 대조구는 95%의 이병률을 보였고, 4종의 길항미생물은 99~100%의 이병률을 보였지만 이들 사이의 유의성은 나타나지 않았고 모두 발병하였음을 알 수 있다. 화학농약을 처리한 대조구만이 탄저병원균을 효과적으로 치료하여 0 %의 발병률을 보였다 (Table 4).
후속연구
- 선발한 Bacillus subtilis 또한 이러한 효소를 분비하여 길항작용을 할 것이라 예상된다. 따라서 항균활성 물질탐색 및 생산의 최적 조건을 검토하고 실용화에 필요한 부가적인 연구를 수행한다면 산업적으로 충분히 가치 있을 것으로 판단된다.
- 점무늬병을 먼저 일으키고 길항미생물의 치료효과 검정결과 KC1, KC2, KC4이 6%, 7%, 6%의 발병률을 보였다. 이는 화학농약을 처리한 대조구와 같은 수준의 점무늬병 치료효과가 있음을 나타내었지만 무처리 대조구가 낮은 발병률을 보여 추가적인 실험이 필요하다 (Fig. 2).
- , 2008). 이처럼 Bacillus균은 다양한 작목의 다양한 병 방제에 효과가 있었으므로 본 연구에서 선발한 길항 균들도 인삼뿐 아니라 다양한 작목에 적용해본다면 높은 방제가를 형성 할 수 있을 것이라 기대된다.
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