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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 신장섬유화를 연구모델로 하여 모링가 추출물들을 신장섬유화 유도 세포에 처리하여 PAI-1과 Type І collagen, fibronectin의 발현확인을 통해 모링가 추출물의 항섬유화 효과를 확인하였으며, 이들 발현에 대한 모링가 추출물의 조절 기전을 연구하였다.
- 본 실험에서는, 모링가 뿌리추출물에 의한 섬유화 유도 인자의 발현억제에 TβR와 MAPK의 인산화 정도에 영향이 있는 지를 확인 하였다.
제안 방법
- 6시간과 12시간 동안 모링가 추출물을 처리한 신장 섬유아세포에 WST-1 reagent를 4시간 동안 처리한 후 분광광도계를 이용하여 세포 증식 수치를 측정하였다.
- RNA 분리는 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를이용하였으며 1 μg의 RNA를 사용하여 Moloney murin leukemia virus reverse transcriptase (Promega, Meadison, WI)로 역전사 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다.
- 따라서 섬유화 유도인자들의 단백질 및 mRNA 발현 감소가 모링가 씨와 뿌리추출물 처리에 의한 것임을 예상할 수 있다. 그리고 PAI-1, Type І collagen의 mRNA발현은 모링가 뿌리추출물에 의해서만 감소되어 이후 실험은 섬유화 유도 인자 발현에 가장 영향이 있는 모링가 뿌리추출물을 이용하여 진행하였다.
- 기존의 배양액을 제거하고, 무혈청 배양액에 모링가 추출물 처리 30 분 전 유도 물질인 TGF-β 2 ng/ml을 처리하여 모링가 추출물과 함께 6시간 동안 배양하였다.
- 모링가 추출물에 의한 섬유화 관련 인자의 발현 저해 효과 TGF-β에 의한 신장 섬유아세포의 섬유화 유도 유무와 모링가 추출물에 의한 섬유화 억제 효과를 확인하고자 섬유화 유도 유전자인 PAI-1과 Type І collagen의 단백질과 mRNA 발현 정도를 확인하였다.
- 모링가는 씨, 뿌리, 잎, 꽃, 껍질 등이 화장품이나 의약품 등의 소재로 이용되고, 항염증 및 항암, 항산화제 등의 다양한 기능이 검증되고 있어[1,3,11,28], 본 연구에서는 TGF-β를 처리한 신장섬유화 모델에 다양한 모링가 추출물을 처리하여 신장섬유화를 비롯한 섬유화 유도 유전자들에 대한 발현 및 조절기전을 확인하였다.
- 본 실험에 사용한 모링가는 스리랑카에서 구입하여 부위별로 분말화 된 시료를 주식회사 유림물산(대구시 달서구 월암동 1-83)에서 제공받아 사용하였다. 시료 무게의 10배(w/v)의 80% 메탄올에 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출하였다. 추출액을 여과하여 rotary vacuum evaporator (R-3000, Büchì Switzerland)로 55℃에서 농축한 다음 건조하여 사용하였다.
- 신장 섬유아세포 증식에 대한 모링가 추출물의 작용신장 섬유아세포를 1×104/ml로 96 wells에서 1 일 동안 배양한 후, 모링가 뿌리, 씨, 열매, 잎 추출물을 각각 50, 100, 200, 400 μg/ml로 6 시간과 12 시간 동안 처리한 뒤 WST-1 reagent를 4 시간 동안 반응시켜 모링가 추출물이 세포증식에 미치는 영향을 확인하였다.
- 신장 섬유아세포에 TGF-β를 처리하여 섬유 화를 유도시킨 뒤 모링가 뿌리 추출물을 농도 별로 처리하여 TβRІІ, Smad4, ERK의 발현과 인산화를 확인하였다.
- 신장 섬유아세포에 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도한 뒤 모링가 뿌리추출물을 농도 별로 처리하여 섬유화 유도 인자인 PAI-1과 Type І collagen, fibronectin의 mRNA 발현에 대한 모링가 뿌리추출물의 영향을 확인하였다.
- RNA 분리는 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를이용하였으며 1 μg의 RNA를 사용하여 Moloney murin leukemia virus reverse transcriptase (Promega, Meadison, WI)로 역전사 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 PAI-1과 Type І collagen, fibronectin의 primer를 이용하여 PCR을 수행하였고, 생성된 결과물은 1% agarose gel로 전기 영동하여 ethidium bromide와 결합시켜 가시화하여 결과를 확인하였다. PCR을 위한 primer 염기서열은 다음과 같다.
대상 데이터
- TGF-β, PAI-1, Type І collagen, Smad4, p-ERK, p-JNK, p-p38, p-AKT, p-PI3K, β-actin은 Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- TGF-β, PAI-1, Type І collagen, Smad4, p-ERK, p-JNK, p-p38, p-AKT, p-PI3K, β-actin은 Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, USA)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용한 모링가는 스리랑카에서 구입하여 부위별로 분말화 된 시료를 주식회사 유림물산(대구시 달서구 월암동 1-83)에서 제공받아 사용하였다. 시료 무게의 10배(w/v)의 80% 메탄올에 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출하였다.
- 신장 섬유아 세포주(rat kidney fibroblast cell, NRK-49F)는 American type culture collection으로부터 구입하였다. 신장 섬유아세포는 10% 혈청(fetal bovine serum,FBS) (Gibco-BRL, Grand Island, NY)과 1% 항생제(Gibco)를 함유한 DMEMlow glucose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Gibco) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하였다.
- 신장 섬유아세포는 10% 혈청(fetal bovine serum,FBS) (Gibco-BRL, Grand Island, NY)과 1% 항생제(Gibco)를 함유한 DMEMlow glucose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Gibco) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과에 대한 통계처리는 각 실험 군별로 표준차이가 있는가를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며 다양성 분석은 Duncan’s test로 분석하였다.
- Membrane은 일차항체 anti-p-TβRII, anti-Smad4, anti-p-ERK, anti-p-p38, anti-p-AKT, anti-p-PI3K, anti-p-JNK와 반응시키고 이차항체와 각각 반응시켰다. 항체들에 대한 발현분석은 Horseradish Peroxidase-Linked 이차항체에 의해 발현되는 ECL Western Blot Analysis 시스템을 이용하여 결과를 분석하였다.
이론/모형
- Rat kidney fibroblast cells (1×104 cells/ml) were treated with various moringa extracts in the absence of serum for 6 hr (A) and 12 hr (B). Cell proliferation was determined by WST-1 assay. Results shown are means ± SE of three separate experiments.
성능/효과
- TGF-β를 처리한 신장섬유화 모델에 다양한 모링가 추출물들을 처리한 결과 PAI-1과 Type І collagen의 mRNA와 단백질 발현이 감소함을 확인하였으며, 그 중 모링가 뿌리추출물에 의해 가장 많이 감소되었다(Fig. 2).
- 결과적으로 모링가 뿌리추출물에 의한 PAI-1과 Type І collagen, fibronectin의 발현은 ERK와 TβRІІ/Smad4의 발현 및 인산화 저해를 통해 조절 되는 것으로 예상된다.
- 결론적으로 TGF-β로 유도된 신장섬유화 세포에서 모링가 뿌리추출물이 ERK와 TβRІІ/Smaad4의 신호기전 조절을 통해 PAI-1과 Type І collagen, fibronectin의 발현을 저해하며, 이 결과로 모링가 뿌리추출물이 신장섬유화 저해 물질로의 개발이 가능함을 예상할 수 있다.
- 따라서 Smad family와 MAPK, PI3K / AKT 신호전달 기전이 TGFβ-TβR 기전을 통한 신장섬유화 유도 및 발현 조절에 중요한 기전인 것으로 확인되며[7], 이러한 다양한 신호전달 기전 가운데 모링가 뿌리추출물이 Smad와 ERK의 활성 저해를 통해 섬유화 조절에 주요하게 작용하는 것으로 생각된다(Fig. 5).
- 3). 따라서 이 결과로 모링가 뿌리추출물이 섬유화 유도 인자들 중 PAI-1의 mRNA 발현조절에 가장 영향이 있음을 예상할 수 있다.
- 또한 모링가 뿌리추출물에 의한 섬유화 유도 인자의 조절기전을 규명하기 위해 TGF-β 관련 신호 기전의 인산화 정도를 확인한 실험에서 모링가 뿌리추출물 처리 시 TβRІІ와 그 하위의 신호기전인 ERK, Smad4의 인산화 및 발현이 저해되었으며 JNK와 p38, PI3K / AKT의 인산화에는 영향이 없었다(Fig. 4).
- 2). 본 결과를 재확인하기 위해 모링가 뿌리추출물을 농도 별로 처리한 경우에도 PAI-1, Type І collagen, fibronectin의 발현이 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 3). 이 결과는 최근 확인된 모링가 씨 추출물이 간경화 완화를 통한 간 기능 보호 연구결과와 일치하며 모링가 추출물들이 섬유화 억제 및 보호 효과가 있음을 확인할 수 있다[13].
- 실험 결과 무처리구와 비교하였을 때, 6 시간과 12 시간 모두 뿌리와 씨 추출물에 대한 세포 증식은 큰 영향이 없었으나, 열매와 잎을 처리한 경우 농도 의존적으로 60% 미만으로 세포증식을 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig. 1). 결과적으로 이후 실험에서의 약물 처리 농도는 신장 섬유아세포 증식에 영향이 없는 100 μg/ml 이하 범위에서 진행하였다.
- 실험 결과, TGF-β 처리에 의해 증가된 섬유화 유도 인자들의 mRNA 발현이 모링가 뿌리추출물 처리에 의해 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 모링가 뿌리추출물에 의해 PAI-1의 발현이 가장 많이 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 실험결과 TGF-β에 의해 증가된 TβRІІ의 인산화가 모링가 뿌리추출물에 의해 감소되는 것으로 나타났으며, 그 하위의 신호기전인 ERK와 Smad4의 인산화 또한 감소하였다.
후속연구
- 결론적으로 TGF-β로 유도된 신장섬유화 세포에서 모링가 뿌리추출물이 ERK와 TβRІІ/Smaad4의 신호기전 조절을 통해 PAI-1과 Type І collagen, fibronectin의 발현을 저해하며, 이 결과로 모링가 뿌리추출물이 신장섬유화 저해 물질로의 개발이 가능함을 예상할 수 있다. 또한 본 연구결과는 모링가 뿌리 추출물뿐만 아니라 다양한 모링가 추출물이 섬유화에 관한 연구에 사용될 수 있음을 제시한다.
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