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문제 정의
- 이에 본 실험에서는 alfacalcidol과 ethylene glycol을 투여한 신장결석 유도 흰쥐를 사용하여 천연물에서 신장결석의 치료제를 개발할 목적으로 민간요법으로 많이 이용하고 있는 참가시나무를 대상으로 혈중의 뇨산 농도 및 신장의 효소활성을 즉정하고 조직검사를 병행하여 참가시나무 열수 추출물이 신장기능에 미치는 영향 및 신장결석의 저해효과를 관찰하고자 하였다.
제안 방법
- 투여 당일에는 투여 후 6 시간까지 매 시간, 투여 후 1일부터 14일까지는 1일 1회 이상씩 일반상태의 변화, 중독증상의 발현, 사망 동물 의 유무 및 시험물질 투여 후 시험물 질에 의하여 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 관찰하였다. 14일의 시험기간이 끝난 후 생존 한 모든 실험동물을 CO2로 마취시킨 후 치사 시켜 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안으로 관찰하였다.
- Alfacalcidol과 ethylene glycol에 의해 신장결석을 유발한 흰쥐에 참가시나무 추출물을 투여한 후 조직의 변화를 광학현미경에서 비교 관찰하였다(Fig. 3).
- 그리고 Quercus dentana 로부터 분리한 플라보노이드인 Kaempferol 3-O-β-Dglucopyranoside, quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside, Kaempferol 3-O-(6″-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside, Kaempferol 3-O-(2″-6″-di-trans-pcoumaroyl)-β-D-glucopyranoside 그리고 Kaempferol 3-O-(2″,4″-di-acetyl-3″-cis-p-coumaroyl-6″-trans-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside를 분리하였으며, 이에 대한 superoxide 생성 억제 활성을 시험관내 에서 확인하였다(Meng et al., 2001).
- 뇨에서 pH, volume을 측정하였으며, uric acid, creatinine 를 혈청 생화학기(Rochu Ltd, Basel, Switzerland)로 분석하였다. 해부일까지 매일 1회씩 일반 증상의 변화, 독성 증상 및 사망 동물의 유무를 관찰하였으며, 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 체중을 2~3일 간격으로 측정하였다.
- 얻어진 혈액은 약 30 분간 실온에서 방치시킨 후 3,000 rpm에서 15 분간 윈심분리하여 혈청을 얻어 혈청 생화학분석에 사용하였다. 분리된 혈액 상층액은 혈청생화학기(Rochu Ltd., Basel, Switzerland)로 BUN, creatinine, uric acid 을 분석하였다. 신장은 관류하여 적출 한 후, 냉각된 0.
- 신장 조직 중 Ca, Mg 함량의 변동을 관찰하였다(Fig. 2). Ca, Mg 함량 모두 alfacalcidol과 ethylene glycol을 투여하여 신장결석을 유도한 대조군에서 가장 높게 나타났으며, leaf 200 mg/kg 투여군에서 정상군과 비슷한 함량을 나타내었다.
- 신장결석의 유발은 Manabu등의 방법(Manabu et al., 2007)을 참조하여 5 ml의 0.5%(w/v)을 kg/body weight로 ethylene glycol을 28일동안 매일 경구투여하였으며, 고칼슘을 유도하기 위하여 alfacalcidol(125 ng/kg) 또한, 매일 경구 투여 하였다. 28일이 경과한 뒤, 실험 동물을 metabolic cage에 나눈 뒤 24시간 뇨를 획득하였다.
- , Basel, Switzerland)로 BUN, creatinine, uric acid 을 분석하였다. 신장은 관류하여 적출 한 후, 냉각된 0.9% 생리식염수로 충분히 세척 하고 물기를 제거한 다음 지방 등을 깨끗하게 정리 하여 무게를 측정하고, 조직 검사에 사용하였다.
- 실험식이 투여 4주 후 최종일에 실험동물을 12 시간 이상 절식시킨 후, CO2로 마취시켜 복부 대동맥으로부터 채혈하였다. 얻어진 혈액은 약 30 분간 실온에서 방치시킨 후 3,000 rpm에서 15 분간 윈심분리하여 혈청을 얻어 혈청 생화학분석에 사용하였다.
- 로 마취시켜 복부 대동맥으로부터 채혈하였다. 얻어진 혈액은 약 30 분간 실온에서 방치시킨 후 3,000 rpm에서 15 분간 윈심분리하여 혈청을 얻어 혈청 생화학분석에 사용하였다. 분리된 혈액 상층액은 혈청생화학기(Rochu Ltd.
- 이 원리를 바탕으로 본 실험은 수산의 전구물질인 ethylene glycol을 경구로 투여하여 결석의 원인이 되는 물질을 증가 시켰다. 특히 기존의 ethylene glycol 뿐만 아니라 vitamin D로 알려진 alfacalcidol을 함께 투여하는 방법으로 만성 신장결석을 유도하였다.
- 이것을 rotary microtome을 사용 하여 5 μm의 두께로 조직 절편을 만들어 hematoxylin-eosin으로 염색 한 후 광학 현미경(Nikon Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- 특히 기존의 ethylene glycol 뿐만 아니라 vitamin D로 알려진 alfacalcidol을 함께 투여하는 방법으로 만성 신장결석을 유도하였다. 이후 참가시나무 추출물(잎, 열매, 가지)이 결석치료제인 furosemide와 같은 유효성이 있는지에 대하여 살펴보았다.
- 참가시나무 잎, 가지, 열매 열수추출물을 생리식염수에 용해한 후 실험동물에 투여하였다. 투여용량은 투여 직전 체중의 변화에 따라 산출하였다.
- 투여 당일에는 투여 후 6 시간까지 매 시간, 투여 후 1일부터 14일까지는 1일 1회 이상씩 일반상태의 변화, 중독증상의 발현, 사망 동물 의 유무 및 시험물질 투여 후 시험물 질에 의하여 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 관찰하였다. 14일의 시험기간이 끝난 후 생존 한 모든 실험동물을 CO2로 마취시킨 후 치사 시켜 외관 및 내부 장기의 이상 유무를 육안으로 관찰하였다.
- Sprague-Dawley계 흰쥐 암수 각각 84마리를 6마리씩 무작위로 군 분리하고 체중을 측정하였다. 투여 용량은 OECD 의 급성독성 시험 허용 한계용량인 2,000 mg/kg을 고용량 군으로 1,000 mg/kg을 저용량군으로 설정하였다.
- 대조군은 동일 량의 상기의 용매를 사용하였다. 투여용량과 기간은 예비실험을 행한 후, 본 실험에 효과가 있는 것으로 사료되는 각 시료 100, 200 mg/kg 및 positive control로 사용된 furosemide를 하루에 한번, 28일간 각각의 실험군에 경구용 needle zonde을 사용하여 투여하였다.
- 이 원리를 바탕으로 본 실험은 수산의 전구물질인 ethylene glycol을 경구로 투여하여 결석의 원인이 되는 물질을 증가 시켰다. 특히 기존의 ethylene glycol 뿐만 아니라 vitamin D로 알려진 alfacalcidol을 함께 투여하는 방법으로 만성 신장결석을 유도하였다. 이후 참가시나무 추출물(잎, 열매, 가지)이 결석치료제인 furosemide와 같은 유효성이 있는지에 대하여 살펴보았다.
- , 2009). 특히, 저자들이 실험에서 사용한 용량(100, 200 mg/kg)및 4주간 투여하였을 때의 수치가 유사하였으며, 이 결과를 바탕으로 xanthine oxidase의 활성을 관찰 하였다.
- 7 g, 질산 7 ml을 넣은 뒤, vessel을 넣은 후 microwave unit를 이용하여 시료를 분해 시켰다. 표준 분석 시료는 각각의 일정량에 표준 Ca, Ma을 0.1 g, 0.2 g, 0.3 g을 첨가한 후 ICP(PerkinElmer Inc., Massachusetts, USA)측정하여 검정 곡선을 작성한 후 분석하였다.
- 뇨에서 pH, volume을 측정하였으며, uric acid, creatinine 를 혈청 생화학기(Rochu Ltd, Basel, Switzerland)로 분석하였다. 해부일까지 매일 1회씩 일반 증상의 변화, 독성 증상 및 사망 동물의 유무를 관찰하였으며, 시험에 사용된 모든 동물에 대하여 체중을 2~3일 간격으로 측정하였다.
- 혈청 생화학적 분석 결과를 바탕으로 뇨에서 참가시나무잎, 가지, 열매가 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다(Table 3). 뇨의 pH에서는 군간의 유의성은 명확하지 않았으나, volume, creatinine 그리고 uric acid농도의 경우 혈청 생화학적 분석과 비슷한 경향을 보였다.
대상 데이터
- 5%(w/v)을 kg/body weight로 ethylene glycol을 28일동안 매일 경구투여하였으며, 고칼슘을 유도하기 위하여 alfacalcidol(125 ng/kg) 또한, 매일 경구 투여 하였다. 28일이 경과한 뒤, 실험 동물을 metabolic cage에 나눈 뒤 24시간 뇨를 획득하였다.
- Sprague-Dawley계 흰쥐 암수 각각 84마리를 6마리씩 무작위로 군 분리하고 체중을 측정하였다. 투여 용량은 OECD 의 급성독성 시험 허용 한계용량인 2,000 mg/kg을 고용량 군으로 1,000 mg/kg을 저용량군으로 설정하였다.
- 투여용량은 투여 직전 체중의 변화에 따라 산출하였다. 대조군은 동일 량의 상기의 용매를 사용하였다. 투여용량과 기간은 예비실험을 행한 후, 본 실험에 효과가 있는 것으로 사료되는 각 시료 100, 200 mg/kg 및 positive control로 사용된 furosemide를 하루에 한번, 28일간 각각의 실험군에 경구용 needle zonde을 사용하여 투여하였다.
- 7%의 수율을 얻었다. 또한 alfacalcidol, ethylene glycol 그리고 furosemide(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. USA)은 HPLC grade를 구입하여 사용하였다.
- 실험동물(효창사이언스㈜, 대구, 한국)은 고형사료와 물을 자유공급하면서 경성대학교 동물사에 서 일정한 조건 (온도: 22 ± 1℃, 습도: 55 ± 3%, 명암: 12 시간 light/ dark cycle)으로 1주일간 적응시킨 후, 체중 200 ± 10 g의 Sprague-Dawley계 웅성흰쥐를 사용하였다.
- 실험재료인 참가시나무(Quercus salicina Blume)는 전라남도 산림자원연구소로부터 제공받았으며, 참가시나무잎, 가지, 열매를 각각 500 g을 3 회 열수추출하여 여과하고 rotary evaporator로 감압농축한 결과 약 7.7%, 8.2%, 6.7%의 수율을 얻었다. 또한 alfacalcidol, ethylene glycol 그리고 furosemide(Sigma Chemical Co.
- , 1994)에 준하여 측정하였다. 이 실험에서 사용한 표준용액은 accutrace referenece standard, plasma emission standard 1,000 mg/L 표준용액을 묽힌 후 사용하였다.
데이터처리
- 2) Values sharing the same superscript letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 4) Values sharing the same superscript letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 각 항목에 대한 유의 한 차이를 나타내는지의 비교분석은 student’s t-test one-way ANOVA(Turkey’s multiple comparison test)를 이용하여 통계적 유의성을 검증하였다.
- 통계적 검정은 SPSS통계 프로그램을 이용 하여 수행하였으며, p<0.05 이하일 경우 통계 적으로 유의한 것으로 검정하였다.
이론/모형
- 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법(Lowry et al., 1951)에 준하여 bovine serum albumin(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. USA)를 표준품으로 하여 측정하였다.
- 신장의 Ca, Mg 함량시험은 AOAC법(Bernard et al., 1994)에 준하여 측정하였다. 이 실험에서 사용한 표준용액은 accutrace referenece standard, plasma emission standard 1,000 mg/L 표준용액을 묽힌 후 사용하였다.
- 신장조직 중 xanthine oxidase(XO)활성의 측정은 Stripe 와 Della의 방법(Stripe and Della., 1969)에 준하여 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 3.0 ㎕를 가하여 37℃에서 반응시킨 후 20% trichloroacetic acid를 가하여 제단백시키고 상징액을 취한 후 생성된 uric acid를 파장 292 nm에서 흡광도를 측정하고 표준검량선에 근거하여 1 분당 1 mg protein이 생성하는 uric acid의 양을 nmol로 나타내었다.
성능/효과
- 2) Values are mean ± S.D. Data followed by different superscript are statistically significant by Duncan’s new multiple range test from normal (p<0.05).
- Ca함량의 경우 수치상 참가시나무 시료 처치군 전체에서 furosemide군과 비슷한 수치를 나타냄을 확인할 수 있었고, Mg함량의 경우 leaf 100, 200 mg/kg 투여군에서 199.97 ± 16.63 ppm, 207.98 ± 20.23 ppm으로 normal 군과 비슷한 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
- 신기능 이상과 함께 광학현미경 검사에서 alfacalcidol 및 ethylene glycol의 투여로 인하여 근위 및 원위세뇨관의 광범위한 괴사가 특히, furosemide군(C)과 QS leaf군인 F, G에서 사구체와 핵의 형태가 온전한 것으로 미루어 보아 앞선 실험의 결과들과 동일한 결과를 알 수 있었고, 참가시나무 잎 열수 추출물이 신장기능 향상에 큰 도움을 주는 것으로 사료된다.
- 실험에서 사용한 참가시나무 잎 열수추출물 또한 XO의 활성을 저해시켰다. 이러한 결과로 미루어 보아 정상쥐에 alfacalcidol과 ethylene glycol의 투여로 의하여 나타나는 신장결석이 참가시나무 잎 등 열수추출물 동시투여로 xanthine oxidase반응을 억제하며 uric acid생성에 영향을 주는것으로 사료된다.
- 정상군에 비하여 alfacalcidol 과 ethylene glycol을 투여하여 신장결석을 유도한 control 군의 xanthine oxidase의 활성이 증가하였다. 이에 반하여 furosemide군과 leaf 100, 200 mg/kg 투여군의 경우 xanthine oxidase의 농도가 감소하는 경향을 보였고, 이는 정상군과 비슷한 수준으로 감소하는 것으로 미루어보아 leaf 군이 다른 투여군에 비하여 효과가 두드러지는 것을 확인할 수 있었다.
- 정상군에 alfacalcidol과 ethylene glycol을 투여하였을 때 혈액 및 뇨중 요소질소, 요산 및 creatinine함량이 현저히 증가함을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 참가시 나무 추출물을 oxalate를 유도한 세포에서 MTT 및 SOD 의 저해효과가 있다는 보고(Manabu et al.
- 또한 positive control로 사용된 furosemide의 경우 강력 이뇨제에 속하는 약물로써 뇨의 농축, 희석기구를 억제 하여 혈장과 거의 동일한 침투압의 뇨를 생성한다. 참가시 나무 열수 추출물의 경우 furosemide군과 비슷한 양의 뇨를 얻었으며, uric acid수치 또한 유의한 결과를 얻었다.
- 참가시나무 잎, 열매, 가지의 분획의 독성을 검사할 목적으로 단회경구투여룰 하여 본 결과 시험 전기간을 통하여 최고 용량 군을 비롯 하여 암･수의 모든 마우스 동물군에서 사망 동물은 발생 하지 않았으며, Sprague-Dawley계 흰쥐 암･수에서 본 시험물질의 최소치사량(minimal lethal dose)는 암수 모두 2,000 mg/kg 이상이었다(Table 1).
- 혈액 및 뇨의 생화학적 분석으로 미루어 보아 alfacalcidol 과 ethylene glycol에 의해 결석이 유도되었음을 확인하였고, 참가시나무 시료투여로 인하여 상당히 결과가 호전된 것으로 사료된다.
후속연구
- 이로보아 신장결석에 의한 참가시나무 열수추출물의 작용은 이뇨작용 및 요산의 생성억제로 인하여 신장결석을 개선하여 줄 것으로 사료된다.
- 조직학적 검사에서 apotosis score 또는 acute tubular necrosis score(Ramesh G. Reeves WB. 2004)를 관찰하지는 않았으나, 추가 연구시에 이에 대한 면밀한 검토가 병 행이 된다면 조직괴사와 자멸사에 대한 영향 및 항산화제 사용으로 인한 세포독성의 회복에 대해 더 보완적인 정보를 제공할 수 있을 것이라 기대된다.
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