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문제 정의
- OO대학교 부속한방병원 산후클리닉에서 生化湯加減方을 복용 중인 산모를 대상으로 하는 연구이므로, 본 병원에서 시행하는 임상투여 원칙에 따라서 진행하였다. 임상시험 기간 동안 生化湯加減方의 약재는 동일한 구입처에서 일괄 구입한 것을 사용했으며, 처방의 첩당 분량과 구성 및 가감 약재는 아래와 같다(Table 1).
- 이에 저자는 모유수유 중 한약 복용이 모유에 미치는 영향을 평가하기 위해 生化湯 加減方을 복용하고 있는 건강한 산모 20명을 대상으로 한약 복용 후 이행 유에 해당하는 모유를 채취한 후, HPLC와 liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC/MS/MS)를 이용하여 生化湯의 지표물질로 amygdalin, liquiritin,6-gingerol, decursin 및 decursinol angelate를 선정, 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- LC/MS/MS 분석 조건으로 MRM(Multiple Reaction Monitoring) mode에서 monitor되었으며, ESI(electrospray ionization source)interface가 사용되었다. Decursin 분석은 positive ion mode에서, liquiritin 분석은 negative ion mode에서 수행하여 확인하였다. Profile 데이터는 m/z 50-1200에서 scanning하였으며, decursin의 이온화 monitoring은 m/z 329>229로 liquiritin의이온화 monitoring은 m/z 417>225로 확인하였다.
- HPLC chromatogram에서 LOD 또는 S/N ratio가 작아 peak로 판단하기가 어려워 일부 시료를 대상으로 LC/MS/MS를 이용하여 추가 분석을 시행하였다. HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP11에서 나타난 당귀의 decursin에 해당하는 LC/MS/MS chromatogram은 다음과 같다(Fig.
- 약재를 첩당 분량 무게를 맞추어 거름망보자기에 싼 후 약탕기에 넣고, 물을 약재의 10배로 첨가하여 100℃에서 120분간 전탕하였다. 生化湯 加減方은 4℃ 이하 냉장보관을 원칙으로 하고, 냉장보관 기간은 7일 이내로 하였다
- 生化湯加減方을 1첩 분량으로 하여,하루에 2첩을 3회에 나누어 1회에 120 ml를 복용하였다. 대상 산모는 生化湯加減方을 5.
- 生化湯加減方을 복용한 산모에게서 채취한 모유의 분석을 위해 amygdalin,liquiritin, 6-gingerol, decursin 및 decursinolangelate의 표준물질을 HPLC을 이용하여 profiling을 실시하였으며(Table 2), 각 표준물질에 대한 chromatogram은 다음과 같다(Fig. 1). 표준성분들의 검출시간(retentiontime)은 amygdalin이 3.
- 대상 산모는 生化湯加減方을 5.55±1.05일 동안 복용하였으며, 최소 3일에서 최대 7일 동안 복용하였다.
- 대상 산모의 모유 채취는 분만일을 1일로 하여 분만일로부터 9.4±0.94일에 이루어졌으며, 최소 8일에서 최대 11일째에 시행하였고, 입원일로부터 6.55±1.05일에 이루어졌으며 최소 4일에서 최대 8일째에 시행하였다.
- 대조 표준품으로는 amygdalin, liquiritin,6-gingerol, decursin, decursinol angelate를 μg/ml 농도로 1, 2, 5, 10, 20 μg/ml에 희석하여 사용하였다.
- 하지만 이들 peak들의 limit of detection(LOD) 또는 signal to noise(S/N) ratio가 작아 peak로 판단하기가 어려워 좀 더 정확한 표준물질 검증을 위해 LC/MS/MS를 이용한 추가 분석을 실시하였다. 모유 시료 HMSP 02, HMSP 04,HMSP 06, HMSP 11에 대해서 decursin성분의 검출 여부를 검토하고, HMSP13~HMSP 18에 대해 liquiritin 성분의 검출 여부를 LC/MS/MS를 이용하여 알아보았다.
- 모유수유 중 生化湯 加減方을 일정 기간 복용한 20명의 산모의 모유를 채취하여 모유에 나타난 生化湯加減方의 지표물질 amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin 및 decursinol angelate의 함량을 정량 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 본 연구에서는 生化湯加減方을 복용하고 있는 20명의 건강한 산모를 대상으로 하여 한약 복용 후 이행유에 해당하는 모유를 채취한 후, HPLC와 LC/MS/MS를 이용하여 生化湯의 지표물질로 선정한 amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin및 decursinol angelate를 분석하였다.
- 兒枕痛에 白灼藥, 소화력이 약한 경우에 香附子, 砂仁을 가미하였고,변비에 大黃을 가미하였다. 약재를 첩당 분량 무게를 맞추어 거름망보자기에 싼 후 약탕기에 넣고, 물을 약재의 10배로 첨가하여 100℃에서 120분간 전탕하였다. 生化湯 加減方은 4℃ 이하 냉장보관을 원칙으로 하고, 냉장보관 기간은 7일 이내로 하였다
- 모유 채취 당일 아침, 연구자가 방문 혹은 전화로 피험자에게 모유 채취 시간 및 채취 방법에 대해 고지하였다. 오전 9시에서 12시 사이에 피험자 임의대로 유축기를 사용하거나 손으로 한쪽 유방의 모유를 짜내며, 모유의 전유와 후유의 불균형을 방지하기 위해 피험자의 판단에 의해 한쪽 젖을 다 비울 때까지 유축하는 것을 원칙으로 하였다. 유축한 모유의 양은 50~160 ml 정도로 피험자에 따라서 다양하게 나타났다.
- 7 μm였다. 이동상 조건은 0.1% 포름산 수용액(A)과 0.1% 포름산을 함유한 아세토니트릴 용액(B)로 구성되어 gradient 분리 방법을 사용하였다. 용매 비율은 0-4 min(30⟶90, B), 4-4.
- 일부 시료의 추가 분석을 위한 LC/MS/MS기기는 Waters사(Waters Corp., UK)의ACQUITY TQD로, AcquityTM Ultra Performance LC system과 AcquityTMTQD를 구성으로 하는 system을 사용하였다. 소프트웨어는 MassLynxTM 4.
- 표준원액 및 내부표준 용액의 diluent로서 사용하기 위해 메스실린더를 이용하여 deionized water와 methanol을 각각 50 ml씩 측정 후 100 ml bottle에 넣고 5분 동안 sonication하여 50% methanol 수용액(v/v)을 제조하였다. 조제 시약은 실온에서 보관하고, 사용 기한을 조제 후 2주간으로 하였다.
- 임상시험 기간 동안 生化湯加減方의 약재는 동일한 구입처에서 일괄 구입한 것을 사용했으며, 처방의 첩당 분량과 구성 및 가감 약재는 아래와 같다(Table 1). 처방은 生化湯 원방을 기준으로, 산모의 증상에 따라 개별 약재를 가감하여 활용하였다. 乳汁不足이나 乳汁不通에 王不留行, 木通을 가미하고, 浮腫에 澤蘭, 燈心, 黑小豆를 가미하였다.
- 표준원액 및 내부표준 용액의 diluent로서 사용하기 위해 메스실린더를 이용하여 deionized water와 methanol을 각각 50 ml씩 측정 후 100 ml bottle에 넣고 5분 동안 sonication하여 50% methanol 수용액(v/v)을 제조하였다. 조제 시약은 실온에서 보관하고, 사용 기한을 조제 후 2주간으로 하였다.
- 다 짜낸 모유는 30~50 ml 정도의 양을 저밀도 폴리에틸렌(LLDPE) 재질의 모유 저장팩에 담아 밀봉하였다. 피험자가 모유를 보관하는 시간 및 연구원 이동시간을 포함하여 냉장보관 다섯 시간 이내에 연구자가 방문 확인한 후, 알미늄 호일로 싸서 분석 직전까지 -20℃의 냉동고에 보관하였다.
- 3). 하지만 이들 peak들의 limit of detection(LOD) 또는 signal to noise(S/N) ratio가 작아 peak로 판단하기가 어려워 좀 더 정확한 표준물질 검증을 위해 LC/MS/MS를 이용한 추가 분석을 실시하였다. 모유 시료 HMSP 02, HMSP 04,HMSP 06, HMSP 11에 대해서 decursin성분의 검출 여부를 검토하고, HMSP13~HMSP 18에 대해 liquiritin 성분의 검출 여부를 LC/MS/MS를 이용하여 알아보았다.
대상 데이터
- Profile 데이터는 m/z 50-1200에서 scanning하였으며, decursin의 이온화 monitoring은 m/z 329>229로 liquiritin의이온화 monitoring은 m/z 417>225로 확인하였다. Desolvation gas로 질소를 사용하였으며, decursin 분석을 위한 collision voltage와 energy는 각각 34와 28이었으며,liquiritin 분석을 위한 collision voltage와 collision energy는 각각 34와 22이었다. ESI source temperature는 120℃로 설정되었다.
- HPLC 분석을 위해 사용된 컬럼은Phenomenex사(USA)의 Gemini-NX C18(5 μm, 3.0 mm×150 mm)를 사용하였고,컬럼 온도는 25℃로 유지하였다.
- 대상 산모의 신장은 161.29±4.11 cm, 임신 전 체중은 59.4±7.84 kg, 임신 전 체질량지수(BMI)는 22.85±3.09 kg/m2, 만삭 체중은 72.45±4.95 kg, 만삭 BMI는 27.9±2.37kg/m2, 입원 당시 체중은 68.79±5.01 kg,입원 당시 BMI는 26.51±2.38 kg/m2이었다(Table 4).
- 본 연구는 2013년 4월부터 6월까지 OO대학교 부속한방병원 산후클리닉에 입원하여 生化湯 加減方을 복용 중이며, 임상시험 모집과정에 참여의사를 밝힌 건강한 산모를 대상으로 하였다. 최초 지원자는 21명이었으며, 모유 채취에 대한거부감으로 1명이 임상시험 참여를 중단하여 최종적으로 총 20명이 임상시험을 마쳤다.
- 본 임상시험에 참여 의사를 밝힌 사람은 총 21명이었다. 이 중 모유 채취에 대한 거부감으로 1명이 임상시험 참여를 중단하여 총 20명이 임상시험을 시행하였다.
- 분석에 이용된 UPLC에적용된 컬럼은 Acquity UPLC® BEHC18 컬럼으로 2.1 mm 내경의 50 mm 길이였으며, pore size는 1.7 μm였다.
- 시료 분석을 위한 HPLC 기기는 Agilent 1200Series(USA)로, Automatic liquid sampler(ALS, G1329A), Binary pump(G1312A), Multi-wavelength detector(G1365D),Thermostatted column compartment(TCC,G1316A), Degasser(G1322A)를 사용하였으며, 소프트웨어는 Chemstation(Agilent,USA)을 사용하였다.
- 본 임상시험에 참여 의사를 밝힌 사람은 총 21명이었다. 이 중 모유 채취에 대한 거부감으로 1명이 임상시험 참여를 중단하여 총 20명이 임상시험을 시행하였다.
- OO대학교 부속한방병원 산후클리닉에서 生化湯加減方을 복용 중인 산모를 대상으로 하는 연구이므로, 본 병원에서 시행하는 임상투여 원칙에 따라서 진행하였다. 임상시험 기간 동안 生化湯加減方의 약재는 동일한 구입처에서 일괄 구입한 것을 사용했으며, 처방의 첩당 분량과 구성 및 가감 약재는 아래와 같다(Table 1). 처방은 生化湯 원방을 기준으로, 산모의 증상에 따라 개별 약재를 가감하여 활용하였다.
- 본 연구는 2013년 4월부터 6월까지 OO대학교 부속한방병원 산후클리닉에 입원하여 生化湯 加減方을 복용 중이며, 임상시험 모집과정에 참여의사를 밝힌 건강한 산모를 대상으로 하였다. 최초 지원자는 21명이었으며, 모유 채취에 대한거부감으로 1명이 임상시험 참여를 중단하여 최종적으로 총 20명이 임상시험을 마쳤다.
데이터처리
- 연구 결과의 분석은 한글판 SPSS for window 21.0을 이용하여, P<0.05를 유의기준으로 하였다.
이론/모형
- LC/MS/MS 분석 조건으로 MRM(Multiple Reaction Monitoring) mode에서 monitor되었으며, ESI(electrospray ionization source)interface가 사용되었다. Decursin 분석은 positive ion mode에서, liquiritin 분석은 negative ion mode에서 수행하여 확인하였다.
성능/효과
- 1. 본 연구에 참여한 산모의 평균 연령은 31.05±1.96세이며, 자연분만이 15명, 제왕절개분만이 5명이었고, 초산부는 12명, 경산부는 8명이었다.
- 2. HPLC 분석 결과, 20개의 모유 시료 중 生化湯의 해당 표준 성분의 peak retention time과 일치하는 LOQ 수준의 peak는 검출되지 않았다.
- 3. LC/MS/MS 분석 결과, 당귀의 decursin은 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서 검출되었으며, 그 농도는 각각 16, 2, 64, 11 ppb였다. 감초의 liquiritin은 HMSP 13~HMSP 18에서 모두 검출되지 않았다.
- 生化湯加減方을 복용한 대상 산모에게서 채취한 모유의 chromatogram에서 20개의 모유 시료 중 해당 표준성분의 검출시간과 일치하는 limit of quantitation(LOQ) 수준의 뚜렷한 peak는 검출되지 않았다. 그러나 일부 시료에서 표준성분 중 감초의 liquiritin (2), 당귀의 decursin(4) 및 decursinol angelate (5)의 검출시간과 일치되는 작은 peak가 확인되었다(Fig.
- 2). 生化湯의 주요 약재들이 함유하고 있는 표준성분들의 검출시간은 amygdalin이 약 13.6 min, liquiritin은 약 18.2 min, 6-gingerol은 약 33.6 min,decursin은 약 43.2 min, decursinol angelate는 약 43.4 min으로 확인되었다.
- 生化湯加減方을 복용한 대상 산모에게서 채취한 모유의 chromatogram에서 20개의 모유 시료 중 해당 표준성분의 검출시간과 일치하는 limit of quantitation(LOQ) 수준의 뚜렷한 peak는 검출되지 않았다. 그러나 일부 시료에서 표준성분 중 감초의 liquiritin (2), 당귀의 decursin(4) 및 decursinol angelate (5)의 검출시간과 일치되는 작은 peak가 확인되었다(Fig. 3). 하지만 이들 peak들의 limit of detection(LOD) 또는 signal to noise(S/N) ratio가 작아 peak로 판단하기가 어려워 좀 더 정확한 표준물질 검증을 위해 LC/MS/MS를 이용한 추가 분석을 실시하였다.
- 대상 산모의 평균 분만 횟수는 1.5±0.69회였으며, 최소분만 횟수는 1회, 최대 분만 횟수는 3회였다.
- 대상 산모의 평균 임신 주수는 39.44±0.87주였으며, 최소임신 주수는 38주 1일이었고, 최대 임신주수는 41주 4일이었다.
- 먼저, HPLC를 이용한 분석 결과 모든 시료에서 生化湯의 지표물질로 보이는 성분은 관찰되지 않았다. 다만 감초의 liquiritin의 peak retention time과 유사한 peak이 HMSP 13~HMSP 18에서 나타났고, 당귀의 decursin 및 decursinol angelate의 peak retention time과 유사한 peak이 HMSP02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서 확인되었다.
- 의심되는 모유 시료를 대상으로 LC/MS/MS를 이용하여 추가 분석한 결과, 당귀의decursin은 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서 모두 검출되었으며,그 농도는 각각 16, 2, 64, 11 ppb였다. 감초의 liquiritin은 HMSP 13~HMSP 18에서 모두 검출되지 않았다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 모유수유 중 한약 복용시 모유를 통해 유아에게 미치는 정도를 파악하기 위한 방법 중에서 유효 성분의 정량화를 통한 Human model의 접근이 가장 타당하며19), 본 연구는 이를 최초로 시도한 임상시험이었다는 데 그 의의가 있다. 향후 더 많은 수의 모유 시료를 수집하여 확대 연구를 진행하거나, 生化湯加減方을 복용하기 전과 복용 후의 모유 시료를 비교 연구한다면 生化湯加減方 복용이 모유에 미치는 영향에 관해 더욱 정확하게 검증할 수 있을 것으로 사료된다.
- 1). 표준성분들의 검출시간(retentiontime)은 amygdalin이 3.6 min, liquiritin은 약 18.2 min, 6-gingerol은 약 33.6 min,decursin은 약 43.2 min, decursinol angelate는 약 43.4 min으로 확인되었다.
후속연구
- , 본 연구는 이를 최초로 시도한 임상시험이었다는 데 그 의의가 있다. 향후 더 많은 수의 모유 시료를 수집하여 확대 연구를 진행하거나, 生化湯加減方을 복용하기 전과 복용 후의 모유 시료를 비교 연구한다면 生化湯加減方 복용이 모유에 미치는 영향에 관해 더욱 정확하게 검증할 수 있을 것으로 사료된다.
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