선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 이 논문에서는 자가형광 기반 이광자 현미경의 촬영 속도를 증가시키는 방법의 한가지인 시공간적 집중을 이용한 라인스캐닝 이광자 현미경을 개발함을 보인다. 그리고 일반적인 이광자 현미경은 외부형광체를 세포에 붙여서 거동을 살펴보기 때문에 형광체가 실제 조직의 환경에 어떠한 영향을 줄지 밝혀지지 않았다.
제안 방법
- 레이저 파워를 조절하기 위해 반파장 판과 편광자를 이용하였다. Ti:Sapphire 레이저는 선형 편광 성질을 가지고 있어 반파장판을 이용하여 선형 각을 바꾼 뒤 편광자를 이용해서 S편광성분은 반사시키고 남은 P편광성분만을 통과시키는 원리고 파워를 조절하였다. 파워가 조절된 여진광은 검류계 스캐너(galvanometric scanner, 6215H, Cambridge Technology)통해서 y축 방향으로 스캔 된다.
- 각 시스템의 실험적인 해상도 값을 구하기 위해서 아가 로스 젤에 2㎛ 청색 마이크로스피어를 심어서 포인트스캐닝 이광자 현미경과 라인스캐닝 이광자 현미경으로 촬영하였다. Fig.
- 개발된 시스템의 형광신호의 세기 비교하기 위해서 기존의 포인트 스캐닝 이광자 현미경과 라인 스캐닝 이광자현미경으로 5000μM L-tryptophan solution응 촬영하였다.
- 에 의해 개발된 라인스캐닝 이광자 현미경을 토대도 라인스캐닝 이광자 현미경을 개발하였다. 라인 스캐닝을 위해서 구형렌즈와 검류계 스캐너를 이용하였고, 형광신호의 탐지를 위해서 EMCCD를 감지기로 사용하였다.
- 앞서 개발된 시공간적 집중을 이용한 라인스캐닝 이광자 현미경을 이용하여 고정된 백혈구(fixed leukocyte)를 촬영하였다. 얻어진 이미지의 해상도 차이를 직접적으로 비교하기 위해서 포인트스캐닝 이광자 현미경과 실험결과를 비교하였다.
- 앞서 개발된 시공간적 집중을 이용한 라인스캐닝 이광자 현미경을 이용하여 고정된 백혈구(fixed leukocyte)를 촬영하였다. 얻어진 이미지의 해상도 차이를 직접적으로 비교하기 위해서 포인트스캐닝 이광자 현미경과 실험결과를 비교하였다.
- 자가형광 이미징을 위한 시스템으로 시공간적인 집중을 이용한 라인 스캐닝 이광자 현미경을 개발하였다. 572nm 펨토초 레이저 기반의 라인 스캐닝 이광자 현미경에서는 깊이 방향 해상도가 3μm로 구해졌다.
대상 데이터
- 높은 세기의 출력을 내기 위해서 140fs의 펄스 폭과 80MHz의 반복률을 가지는 Ti:Sapphire 레이저 (Chameleon II, Coherent)를 사용하였다. Ti:Sapphire 레이저를 펌핑 소스로 활용하여 OPO를 구동하였고, 펄스폭이 200fs이며 파장이 572nm인 여진광을 만들어 냈다. 레이저 파워를 조절하기 위해 반파장 판과 편광자를 이용하였다.
- 각 시스템의 시계(Field of View, FOV)비교는10㎛ 마이크로스피어를 촬영한 자료와 L-tryptophan을 촬영한 자료를 이용하여 구했으며, 포인트스캐닝 이광자 현미경의 경우 39.4㎛이상의 시계를 가질 수 있는 반면 라인스캐닝 이광자 현미경의 경우 12.3㎛의 시계를 가지게 되었다. 사용된 에너지를 살펴보면 라인스캐닝 이광자 현미경에서는 3797.
- 이광자 여기는 여진광의 파워의 제곱에 비례하므로 순간적으로 높은 에너지를 필요로 한다. 높은 세기의 출력을 내기 위해서 140fs의 펄스 폭과 80MHz의 반복률을 가지는 Ti:Sapphire 레이저 (Chameleon II, Coherent)를 사용하였다. Ti:Sapphire 레이저를 펌핑 소스로 활용하여 OPO를 구동하였고, 펄스폭이 200fs이며 파장이 572nm인 여진광을 만들어 냈다.
- Ti:Sapphire 레이저를 펌핑 소스로 활용하여 OPO를 구동하였고, 펄스폭이 200fs이며 파장이 572nm인 여진광을 만들어 냈다. 레이저 파워를 조절하기 위해 반파장 판과 편광자를 이용하였다. Ti:Sapphire 레이저는 선형 편광 성질을 가지고 있어 반파장판을 이용하여 선형 각을 바꾼 뒤 편광자를 이용해서 S편광성분은 반사시키고 남은 P편광성분만을 통과시키는 원리고 파워를 조절하였다.
- 튜브 렌즈를 지나게 된 여진광은 680nm 하이 패스 이색성 거울(high pass dichroic mirror, T680dclpxr, chroma)을 투과하여 대물렌즈로 입사한다. 오일 담금 대물렌즈(oil immersion objective, 100x,NA=1.4, Olympus)를 사용하였다. 대물렌즈의 후개구에서 회절 된 각각의 레이저가 라인으로 지나간 후 초점평면에서 라인으로 나타난다.
- 회절격자에서 여진광은 회절이 되어 펄스 폭이 넓어지게 된다. 튜브 렌즈는 초점거리가 500mm인 렌즈(NIR Achromatic lens, Thorlabs)를 사용하였다. 튜브 렌즈를 지나게 된 여진광은 680nm 하이 패스 이색성 거울(high pass dichroic mirror, T680dclpxr, chroma)을 투과하여 대물렌즈로 입사한다.
이론/모형
- 각 시스템의 이론적인 해상도는 Point Spread Function 의 반치전폭 (Full Width Half Maximum, FWHM)을 통해서 구할 수 있으며, 이론 식은 다음과 같이 Gaub 근사에 의해서 유도되었다. 따라서 Axial과 Lateral 해상도는 식 (1), (2), (3)를 통해 이론 값을 얻을 수 있다.
- 이 개발되었다. 라인스 캐닝 이광자 현미경의 경우에는 펨토초 레이저의 펄스 폭을 조절하는 방법인 시간적 집중(temporal focusing) 방법을 이용한 것으로 1차원 스캐닝만을 이용한다. 따라서, 스캐너의 부피가 줄어들어 시스템의 소형화가 기대된다.
성능/효과
- 그리고 일반적인 이광자 현미경은 외부형광체를 세포에 붙여서 거동을 살펴보기 때문에 형광체가 실제 조직의 환경에 어떠한 영향을 줄지 밝혀지지 않았다. 그래서 여기서는 광파라메트릭 발진기(Optical parametric oscillator, OPO) 를 이용한 572nm 펨토초 펄스 레이저를 이용하여 외부형광체를 사용하지 않고 세포촬영이 가능함을 보여 준다.
- 이는 이론적인 해상도와 비교해볼 때 25%이내의 오차를 가지는 값이나 포인트 스캐닝 이광자 현미경의 해상도에 비해서는 2~3배정도 떨어지는 해상도가 된다. 그리고 고정 된 백혈구를 촬영을 한 결과 포인트스캐닝 이광자 현미경에 비해서 흐릿한 영상을 얻을 수 있었는데 이를 통해서 평면 방향 해상도도 떨어지는 것으로 볼 수 있다. 이와 같은 현상이 발생한 가장 큰 이유로는 사용하는 레이저의 펄스 폭에 의한 것이다.
- OPO를 이용하여 572nm 펨토초 펄스 레이저를 얻을 수 있으나 사용할 수 있는 최대출력은 650mW로 제한이 된다. 그리고 사용되는 회절격자에 의해서 에너지 효율이 30%가량 손실이 되며, 실험에 사용한 EMCCD는 가시광선 영역에 대해서 95%의 효율을 가지지만 자외선 영역에 대해서는 25%의 효율만을 가진다. 이런 요소들은 라인 스캐닝 이광자 현미경의 이미징 속도를 제한하는 요소가 된다.
- 1㎛로 오차가 5% 이내에 있다고 볼 수 있다. 라인스캐닝 이광자 현미경으로 촬영한 2㎛ 청색 마이크로스피어의 FWHM을 구해보면 3㎛로 실제 마이크로스피어의 크기와 50%정도의 오차가 발생하였으나, 앞에서 제시한 FWHM 식에서 구한 이론 값은 2.41㎛으로 실험값과는 24.5%의 오차가 발생했음을 알 수 있다.
- 형광신호는 초점거리가 150mm인 가시광선 색지움 렌즈(VIS Achromatic lens, Thorlabs)와 460nm barrier filter(E460SPUV V2, chroma)를 지나서 EMCCD(iXon+ 885, ANDOR) 로 감지된다. 사용된 EMCCD는 530nm에서 양자효율이 95%로 형광신호를 감지하기에 충분한 성능을 가진다. 3차원 영상 촬영을 위해서 대물렌즈에는 피에조 스테이지(piezo stage, P725, PI)가 달려있어 Labview 프로그램을 이용하여 깊이 방향으로 제어할 수 있다.
- 사용된 에너지를 살펴보면 라인스캐닝 이광자 현미경에서는 3797.0μJ/㎛2 포인트스캐닝 이광자 현미경에서는 465.8μJ/㎛2의 에너지를 사용하여 라인스캐닝에 8배정도 많이 사용한 결과가 구해졌다.
- 시스템의 검증이 끝난 후 고정된 세포를 이용하여 외부 형광체를 사용하지 않고 트립토판의 자가형광만을 이용하여 세포촬영이 가능함을 보여 시공간적 집중을 이용한 라인스캐닝 이광자 현미경 시스템이 572nm 펨토초 펄스 레이저로 작동이 가능함을 보인다.
- 이는 평면 방향 해상도가 나쁘기 때문에 일어난 현상으로 생각이 되며, 면적당 소모된 에너지를 살펴보면 대략 7배 정도의 차이가 나는데 앞서 L-tryptophan용액을 촬영할 때 소모된 에너지 차이와 유사하다. 하지만 촬영속도에 있어서는 라인 스캐닝 방식이 2.6배정도 빠른 속도를 가질 수 있었고, 얻어지는 신호의 세기를 볼 때 더 빠른 속도의 촬영이 가능함을 보였다.
후속연구
- 이런 요소들은 라인 스캐닝 이광자 현미경의 이미징 속도를 제한하는 요소가 된다. 고정 된 백혈구를 촬영하는 속도에 있어서 라인스캐닝 이광자 현미경은 포인트스캐닝 이광자 현미경에 비해서 2.6배가량 빠른 이미징 속도를 가지고 있는데 더 효율이 좋은 회절격자를 사용하고 자외선 영역에 적합한 EMCCD를 사용하여 시스템을 최적화시키면 고속의 이미징 시스템으로써 성능의 향상이 가능할 것이라 기대된다.
- 이를 활용하면 펄스 폭을 줄일 수 있을 것이고 해상도 역시 향상시킬 수 있을 것이라 기대된다. 그리고 좁은 시계를 넓히는 데에 도움이 될 것이라 기대되며, 이와 더불어 사용되는 레이저의 직경을 회절격자의 각도에 맞춰서 최적화시키면 더 넓은 시계를 가질 것이다.
- 앞선 문제점들을 보완하게 된다면 자가형광을 이용한 고속 이광자 시스템으로 활용이 가능할 것이라 생각되며 면역세포의 동역학적인 거동에 관한 연구를 하는데 있어서 적합한 시스템으로 활용할 수 있을 것이다.
- 이는 이광자 현미경을 이용한 깊은 조직 이미징(deep tissue imaging)에 널리 이용되고 있다. 이를 활용하면 펄스 폭을 줄일 수 있을 것이고 해상도 역시 향상시킬 수 있을 것이라 기대된다. 그리고 좁은 시계를 넓히는 데에 도움이 될 것이라 기대되며, 이와 더불어 사용되는 레이저의 직경을 회절격자의 각도에 맞춰서 최적화시키면 더 넓은 시계를 가질 것이다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.