[논문]계지인삼탕(桂枝人蔘湯)이 MIA로 유도된 골관절염 유발 Rat에 미치는 영향

안순선; 허동석

doi:10.13048/jkm.13013

계지인삼탕(桂枝人蔘湯)이 MIA로 유도된 골관절염 유발 Rat에 미치는 영향
Effects of Kyejiinsam-tang in MIA-Induced Osteoarthritis Rats 원문보기

Journal of Korean Medicine = 대한한의학회지, v.34 no.3, 2013년, pp.69 - 85

안순선 (대전대학교 한의과대학 한방재활의학과교실) , 허동석 (대전대학교 한의과대학 한방재활의학과교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives: This study investigated the anti-osteoarthritic effects of Kyejiinsam-tang (hereinafter referred to KIT) on the monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis rats. Methods: Anti-oxidative effects of KIT were measured by scavenging activities of DPPH, reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). Scavenging activities of anti-oxidation in lipopolysaccharide (LPS)-treated RAW 264.7 cells were also measured for inhibitory effects against the production of inflammatory mediators (tumor necrosis factor-${\alpha}$, interleukin-$1{\beta}$, interleukin-6). Osteoarthritis was induced in rats by injecting MIA in the knee joint. Rats were divided into a total of 4 groups (n=6). The normal group were not treated at all without inducing osteoarthritis whereas the control group were induced for osteoarthritis by MIA and oral medicated physiological saline per day. The positive comparison group was injected with MIA and after 7 days, 2 mg/kg of Indomethacin. The experimental group was injected with MIA and after 7 days was medicated with 34 mg/kg of KIT. Indomethacin and KIT were orally-medicated for each substance a total of 4 weeks, once per day. Weight-bearing on hind legs was measured every week after MIA injection. At the end of the experiment (5 weeks after MIA injection), micro CT (computed tomography)-arthrography and histopathological examinations on the articular structures of knee joint were performed. The effect on inflammatory cytokines and immunological cells in synovial fluid was measured. Volume of cartilage was measured by micro CT-arthrography. Injury to synovial tissue was measured by H & E (hematoxylin and eosin), Safranin-O immunofluorescence. Results: 1. Cytotoxicity against hFCs was insignificant. 2. KIT showed the potent full term for DPPH. 1. NO was significantly reduced by KIT (at 100, $200{\mu}g/m{\ell}$) and ROS was also reduced, but not significantly, by KIT (at $200{\mu}g/m{\ell}$). 2. IL-6 and IL-$1{\beta}$ were significantly reduced by KIT (at 100, $200{\mu}g/m{\ell}$) and TNF-${\alpha}$ was also reduced, but not significantly, by KIT (at $200{\mu}g/m{\ell}$). 1. In hind legs weight-bearing measurement, level of weight increased. 2. Functions of liver and kidney were not affected. 3. IL-$1{\beta}$ was significantly reduced and TNF-${\alpha}$, IL-6 were also reduced but not significantly. 4. PGE2 (prostaglandin E2), LTB4 (leukotriene B4) were significantly reduced in the KIT group. 5. MMP-9 (matrix metalloproteinase-9), TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases-1) and Osteocalcin were significantly reduced in the KIT group. 6. Destruction of cartilage on micro CT arthrography was reduced but had no significant differences. 7. Histopathologically, injury to synovial membrane of the KIT group was decreased and proteoglycan content of KIT group was increased. Conclusions: According to this study, Kyejiinsam-tang has inhibiting effect on the progression of arthritis in MIA-induced osteoarthritis rat. Kyejiinsam-tang has anti-oxidants and anti-inflammation effects, and is related to inhibiting the activity of inflammatory cytokine and injury of volume in cartilage.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 저자는 桂枝人蔘湯이 골관절염에 미치는 영향을 살펴보고자, lipopolysaccharide(LPS)로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 염증 유발 인자의 변화를 관찰하였고, MIA로 유발된 rat에 대한 염증 매개 인자, 뒷다리 체중 부하 능력, 연골량 및 병리조직학적 변화를 관찰한 결과, 유의한 성적을 얻었기에 보고하는 바이다.

가설 설정

1. 뒷다리 체중 부하는 유의성 있게 증가하였다.
1. 세포독성은 없었다.
2. 간 기능 및 신장 기능에 영향을 미치지 않았다.

제안 방법

24시간 동안 배양한 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 TNF-α, IL-1β, IL-6를 Milliplex map cytokine kit(Millipore Co., Bellerica, MA, USA)을 이용하여 측정하였다.
7 세포를 2×10⁵ cells/well이 되게 분주하였다. 24시간 동안 배양한 후 여기에 LPS(1 ㎍/㎖) 및 KIT(50, 100, 200 ㎍/㎖)를 각각의 well에 첨가한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후 1,200 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 모은 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후, DCF-DA 10 ㎛이 되도록 첨가하여 15분 동안 빛이 차단된 상온에서 염색하였다.
TNF-α: tumor necrosis factor-α, IL-1β: interleukin-1β, IL-6: interleukin-6. Cells were treated with LPS(1 ㎍/㎖) and control(0 ㎍/㎖), 50, 100, 200 ㎍/㎖ of KIT for 24 hours. The results are expressed as mean ± SD from three independent experiments.
Decalcification 과정을 거쳐 파라핀으로 고정된 조직을 7 ㎛의 크기로 자른 뒤, hematoxylin and eosin(H & E) 및 Safranin-O 염색을 실시하여 100배의 비율로 조직 상태를 관찰하였다.
KIT 6첩을 분말한 후, 70% 주정과 30% 증류수를 혼합한 800 ㎖에 24시간 침지 후 여과하여, 그 여액을 rotary evaporator를 이용하여 50 ㎖로 감압, 추출, 동결건조 하여 사용하였다. 추출 수율에 따른 한 첩 분량은 4.
Lipopolysaccharide(LPS)로 자극된 RAW 264.7 세포 내에서 reactive oxygen species(ROS)를 측정하기 위하여 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)를 이용하였다.
MIA 주사 7일 후에 관절염 유발 유무를 확인하여 관절염이 유발된 동물만을 대조군(Control), 양성대조군(Indomethacin), KIT 투여군(KIT)으로 나누었고, MIA를 주사하지 않은 정상군(Normal)을 포함하여 동물 수는 각 군당 6마리로 하였다. Wistar rats에 MIA를 주사하여 골관절염을 유발시킨 후 일주일이 경과된 이후부터 1일 1회 매일 오전 10시에 대조군에는 생리식염수 2 ㎎/㎏을, 양성대조군에는 Indomethacin 2 ㎎/㎏을, KIT 투여군에는 KIT 34 ㎎/㎏을 4주 동안 경구투여 하였다.
N1 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리한 후 10분간 상온에서 암소 반응 후, N1 buffer 50 ㎕를 처리한 것에 N2 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리하고 10분간 반응시킨 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
RAW 264.7 세포를 6 well plates에 3×105 cells/㎖가 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, KIT(50, 100, 200 ㎍/㎖)를 처리하고, LPS(1 ㎍/㎖)로 처리하였다.
Micro CT arthrography가 끝난 후 무릎 부위를 절단하여, 10% EDTA가 포함된 10% 포르말린 용액에 넣어 관절 조직을 탈칼슘화 시켰다. Radiographic technique를 이용하여 decalcification 유무를 확인한 후 파라핀 왁스에 관절 조직을 넣고 고정한 다음 coronal section을 실시하였다. Decalcification 과정을 거쳐 파라핀으로 고정된 조직을 7 ㎛의 크기로 자른 뒤, hematoxylin and eosin(H & E) 및 Safranin-O 염색을 실시하여 100배의 비율로 조직 상태를 관찰하였다.
MIA 주사 7일 후에 관절염 유발 유무를 확인하여 관절염이 유발된 동물만을 대조군(Control), 양성대조군(Indomethacin), KIT 투여군(KIT)으로 나누었고, MIA를 주사하지 않은 정상군(Normal)을 포함하여 동물 수는 각 군당 6마리로 하였다. Wistar rats에 MIA를 주사하여 골관절염을 유발시킨 후 일주일이 경과된 이후부터 1일 1회 매일 오전 10시에 대조군에는 생리식염수 2 ㎎/㎏을, 양성대조군에는 Indomethacin 2 ㎎/㎏을, KIT 투여군에는 KIT 34 ㎎/㎏을 4주 동안 경구투여 하였다. 모든 군에서 자유 음수와 식이를 실시하였고, 총 5주간 실시하였다.
Zoletil 0.5 ㎖와 Rompun 0.1 ㎖로 rat을 마취시킨 후 왼쪽 무릎 주변을 깨끗이 제모하고 골관절염 유발물질인 Monosodium iodoacetate(MIA)를 31G의 1 ㎖ Insulin Syringe(0.25 ㎜ × 8 ㎜, BD Medical-Diabetes Care, USA)를 사용하여 왼쪽 무릎 관절 내에 50 ㎕(60 ㎎/㎖)씩 투여하였다.
桂枝人蔘湯(KIT)의 주정 추출물을 시료로 하여 RAW 264.7 세포에서 항산화 활성과 염증 cytokine에 미치는 영향을 분석하였고, rat의 무릎 내로 monosodium iodoacetate(MIA)를 주입하여 골관절염을 유발한 후 KIT를 경구 투여하여, 뒷다리 체중 부하와 염증 cytokine 및 염증 매개 인자에 미치는 영향, 병리조직학적 소견을 관찰하였다.
桂枝人蔘湯(KIT)이 골관절염에 미치는 영향을 살펴보고자, lipopolysaccharide(LPS)로 자극된 RAW 264.7 세포에 대한 염증 유발 인자의 변화를 관찰하였고, MIA로 유발된 rat에 대한 염증 매개 인자, 뒷다리 체중 부하 능력, 연골량 및 병리조직학적 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
뒷다리 체중 부하는 Incapacitance Meter Tester를 이용하여 플라스틱 방에 60도 기울기로 세운 후, 각 뒷다리에 가해진 세기를 10초에 걸쳐 평균을 산출하였다. 처치된 동측의 뒷다리에 분포된 체중의 백분율은 다음과 같은 방정식을 이용하여 계산하였다.
Proteoglycan의 소실²⁸⁾과 연골 및 연골하골의 기질 붕괴가 일어나며, 금속효소 및 MMP, 아교질 분해 효소, gelatinase의 활성이 증가한다²⁹⁾. 또한 파골세포와 골아세포의 활동이 증가하면서 관절연골의 소실로 인해 연골하골에 부하가 증가하게 되어³⁰⁾, 연구에 적합한 병변상태라 생각하여 MIA 주사 7일 이후부터 KIT를 경구투여 하였다.
Wistar rats에 MIA를 주사하여 골관절염을 유발시킨 후 일주일이 경과된 이후부터 1일 1회 매일 오전 10시에 대조군에는 생리식염수 2 ㎎/㎏을, 양성대조군에는 Indomethacin 2 ㎎/㎏을, KIT 투여군에는 KIT 34 ㎎/㎏을 4주 동안 경구투여 하였다. 모든 군에서 자유 음수와 식이를 실시하였고, 총 5주간 실시하였다.
7 세포는 96well plates에 1×10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, KIT을 각각 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 WST solution을 첨가하여 CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 30분간 반응 시킨 후, 450 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여, only cell을 대조군으로 하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.
염색 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리한 다음 상층액을 제거하고, 다시 PBS 400 ㎕를 부유시켜 유세포 분석기(Flow cytometer, Becton, Dickinson & Company, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 변화를 분석하였다.
염증 반응 발생 유무나 활막 세포의 증식, 염증세포의 조직 침윤 여부는 H & E 염색 결과에서 확인할 수 있으며, proteoglycan 층을 염색하는 Safranin-O 염색 결과에서는 연골 조직의 손상 여부를 확인하였다.
자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH를 사용하는 방법으로 주정에 용해시킨 0.2 mM의 DPPH 용액 150 ㎕와 KIT(25, 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖) 100 ㎕를 각각 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료액 대신 증류수를 넣고, DPPH 용액 대신 주정을 넣어 보정 값을 얻었다.
최종 실험 종료 후 튜브형 주사기를 이용하여 심장에서 채혈하였다. 전혈을 바이오톡스텍(주)(청주, 한국)에 의뢰하여 AST, ALT, BUN, Creatine을 측정하였다.
조영제인 Hexabrics 320을 왼쪽 무릎에 투여하고, micro CT arthrography를 사용하여 cartilage volume을 측정하여서, 무릎관절 연골의 파괴 정도를 분석하였다.
최종 실험 종료 후 튜브형 주사기를 이용하여 심장에서 채혈하였다. 전혈을 바이오톡스텍(주)(청주, 한국)에 의뢰하여 AST, ALT, BUN, Creatine을 측정하였다.
최종 실험 종료 후 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 뒤, 염증성 지표로서 TNF-α, IL-1β, IL-6 등을 측정하고, Prostaglandin E2(PGE2), Leukotriene B4(LTB4), Matrix metalloproteinase-9(MMP-9), Tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1), Osteocalcin 등의 염증 매개 인자들을 ELISA assay kit로 측정하였다.
통증에 유효하다는 문헌적 근거와 항염증․항산화 작용이 있는 본초의 구성, 表證과 裏證을 겸한 主治와 溫性藥으로 구성되어 溫散溫通의 효능을 가지고 있음에 착안하여 桂枝人蔘湯이 초기 이후의 골관절염에 적합하리라는 가설을 세우고, 염증 유발 인자 및 MIA로 유발된 병태 동물 모델의 관절 내 염증 상태 변화를 관찰하였다.

대상 데이터

(안산, 한국)에서, Rat Total MMP-9(matrix metalloproteinase-9) kit, LTB4(leukotriene B4) kit, Rat TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1) kit, Rat IL-6(interleukin-6) kit, Rat TNF-α(tumor necrosis factor-α) kit, PGE2(prostaglandin E2) kit, Rat IL-1β(interleukin-1β) kit은 R&D System Co.(Minneapolis, USA)에서, 주정 추출에 이용된 주정은 ㈜대한주정판매(전주, 한국)에서 구입하였다. 양성대조군에는 Indomethacin(Sigma Co.
(서울, 한국)에서, Nitric oxide detection kit은 Intron Biotechnology Co.(수원, 한국)에서 구입하였다. Cytokine Milliplex Map Immunoassay kit은 Millipore Co.
, France)과 Rompun(바이엘코리아, 서울, 한국)을 사용하였다. Hematoxylin and eosin 염색과 Safranin-O 염색에는 Hematoxylin(Merck Co., Germany), Eosin Y(Wako Co., Japan), Safranin-O(Merck Co., Germany)를, Micro CT arthrography의 조영제는 Hexabrics 320(Guerbet Co., France)을 사용하였다.
동물은 수컷 6 주령의 Wistar rat(170-200g)(오리엔트바이오, 성남, 한국)을 사용하였고, 실험 당일까지 고형사료(5L79, 오리엔트바이오, 성남, 한국)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간(light-dark cycle)의 환경에서 1주간 적응시켰다.
본 실험에 사용된 기기는 Rotary vacuum evaporator(EYELA, Japan), Freeze dryer(일신바이오베이스, 한국), ELISA reader(Molecular Devices, USA), Luminex(Millipore Co., USA), HPLC (Shimadzu LC-20AD, Japan), HPLC column(ACE 5 C18, 250 × 4.6 ㎜, 5 ㎛)를, Flow cytometry system (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA), Incapacitance Meter Tester(IITC Life Science, california, USA), BD Ultra-Fine ll(Becton, Dickinson & Company, USA), Light Microscope(Carl ZEISS AXIOSKOP-40, Germany), micro CT arthrography (SkyScan, Optoscan, Belgium)를 이용하였다.
본 연구에서 이용한 RAW 264.7 세포는 대식세포주로서, cytokine의 자극만으로도 스스로 nitric oxide(NO)를 생성하여 세포독성을 갖는 물질의 독성 검정을 위해 유용하게 사용된다²⁴⁾. RAW 264.
실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 구입하여 사용하였다.
실험에 사용한 桂枝人蔘湯(Kyejiinsam-tang, 이하 KIT)은 『傷寒論』 4)과 『新古方撰次』11)에 근거하여 처방하였고, 구성 약물들은 대전대학교 둔산 한방병원에서 구입하여 정선 후 사용하였으며, 내용과 분량(1첩)은 다음과 같다(Table 1).
(Minneapolis, USA)에서, 주정 추출에 이용된 주정은 ㈜대한주정판매(전주, 한국)에서 구입하였다. 양성대조군에는 Indomethacin(Sigma Co., USA), 골관절염 유발 주사제로는 Monosodium iodoacetate (MIA)(Sigma. Chemical Co. Ltd, Cat. No. I2512, USA), 마취제로는 Zoletil(Virbae Co., France)과 Rompun(바이엘코리아, 서울, 한국)을 사용하였다. Hematoxylin and eosin 염색과 Safranin-O 염색에는 Hematoxylin(Merck Co.

데이터처리

Significant value was calculated by compared with control group by student's t-test(***p<0.001).
Significant value was calculated by compared with control group by student's t-test(**p<0.01, ***p<0.001).
, Bellerica, MA, USA)을 이용하여 측정하였다. 분석은 Milliplex analyst software(고마바이오텍, 서울, 한국)를 통해 이루어졌다.
실험결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's t-test를 이용하여 통계처리 하였으며, p< 0.05에서 유의성을 검정하였고, 그 값은 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation)로 표기하였다.

이론/모형

7 cells were treated with 50, 100, 200 ㎍/㎖ of KIT for 24 hours. Cell viability was determined using the WST assay. Extracts were incubated with DPPH solution at 37℃ for 30 mins.
Total nitric oxide(NO)의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent 방법으로 측정하였다. RAW 264.

성능/효과

1. KIT 100, 200(㎍/㎖)에서 ROS 생성량은 감소하였으나 유의성은 없었으며, NO의 생성량은 유의성 있게 감소하였다.
2. TNF-α 생성량은 KIT 200(㎍/㎖)에서 감소하였고, IL-1β와 IL-6 생성량은 KIT 100 , 200(㎍/㎖)에서 유의성 있게 감소하였다.
2. 농도 증가에 따라 DPPH 소거활성은 증가하였다.
3. TNF-α, IL-6 및 IL-1β는 감소하였으며, 그 중 IL-1β가 유의성 있게 감소하였다.
4. PGE2와 LTB4는 유의성 있게 감소하였다.
5. MMP-9, TIMP-1 및 Osteocalcin은 유의성 있게 감소하였다.
6. Micro CT arthrography에서 연골의 파괴가 감소하였다.
7. 병리조직학적 소견에서 활막의 손상정도가 감소하였고 proteoglycan의 생성은 증가하였다.
IL-6 생성량이 대조군에서 100.0±14.0%였을 때, 정상군은 77.2±11.4%, 양성대조군 78.5±11.1%, KIT 투여군 83.1±15.5%로 나타나, KIT 투여군에서 감소하였으나 유의성은 없었다(Fig. 5).
In vitro에서 RAW 264.7 세포에서 ROS와 NO 생성량을 측정한 결과, 대조군에 비해 KIT 군에서 감소하였으며, 특히 NO 생성량이 KIT 100, 200(㎍/㎖)에서 유의성 있게 감소하여, KIT의 항산화 활성이 in vitro에서 유효함을 알 수 있다(Fig. 1).
양성대조군은 관절면에 대조군에서 비해 연골과 뼈의 침윤 등이 적었으며, 붉게 염색된 proteoglycan 조직이 활막 주변에 많이 분포하였다. KIT 투여군은 대조군에 비해 붉게 염색된 강도가 높아 proteoglycan 조직의 분포가 많이 보였다(Fig. 9).
KIT의 DPPH 소거 활성을 측정한 결과, 농도가 증가함에 따라 소거활성 역시 증가하여 KIT의 항산화 효능이 확인되었다(Fig. 1).
Leukotriene B4 생성량이 대조군에서 100.0±12.3%였을 때, 정상군 67.4±10.2%, 양성대조군 69.8±6.5%, KIT 투여군 74.1±12.3%로 나타나, KIT 투여군에서 유의성 있는 감소(p<0.05)가 나타났다(Fig. 6).
Matrix metalloproteinase-9 생성량이 대조군에서 100.0±1.8%였을 때, 정상군 50.0±4.1%, 양성대조군 64.6±1.0%, KIT 투여군 81.9±8.1%로 나타나, KIT 투여군에서 유의성 있는 감소(p<0.01)가 나타났다(Fig. 6).
Micro CT arthrography를 사용하여 연골량을 측정한 결과, KIT 군이 대조군에 비해 연골량 파괴가 감소하였으며(Fig. 7), H & E 및 Safranin-O 염색을 통한 병리조직학적 검사에서도 KIT 군이 증가된 proteoglycan량과 감소된 염증세포 소견을 보여 활막의 손상 정도를 감소시켰다(Fig. 8, 9).
Osteocalcin 생성량이 대조군에서 100.0±8.5%였을 때, 정상군 41.2±3.0%, 양성대조군 60.1±4.1 %, KIT 투여군 70.4±8.6%로 나타나, KIT 투여군에서 유의성 있는 감소(p<0.01)가 나타났다(Fig. 6).
PGE2와 LTB4의 생성량은 KIT 군에서 유의성있게 감소하여(Fig. 5, 6), KIT가 COX 반응을 억제하는 항염증 작용과 더불어 통증 감소 및 연골 파괴 방지에도 효과적임을 알 수 있다.
TNF-α 생성량이 대조군에서 100.0±10.2%였을 때, 정상군은 82.8±18.5%, 양성대조군 85.0±9.0%, KIT 투여군이 94.9±7.2%로 나타나, KIT 투여군에서 감소하였으나 유의성은 없었다(Fig. 5).
TNF-α, IL-1β, IL-6 생성에 대한 KIT의 억제효과를 측정한 결과, IL-1β와 IL-6 생성량은 KIT 100, 200(㎍/㎖)에서 유의성 있게 감소하였고, TNF-α 생성량은 KIT 200(㎍/㎖)에서 감소하였으나 유의성은 없었다(Fig. 2).
Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 생성량이 대조군에서 100.0±1.6%였을 때, 정상군 54.4±3.9%, 양성대조군 72.0±4.2%, KIT 투여군 89.4±7.1%로 나타나, KIT 투여군에서 유의성 있는 감소(p<0.05)가 나타났다(Fig. 6).
간 기능을 반영하는 혈청 AST와 ALT 농도, 신장 기능을 반영하는 BUN과 사구체의 여과율을 반영하는 혈청 creatinine 농도는 모두 대조군에 비해 유의한 증감을 보이지 않아 KIT가 간과 신장 기능에 관해 안전한 약물임을 확인하였다(Fig. 4). 혈청 내 cytokine의 변화를 확인하기 위해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량을 측정한 결과, KIT 군에서 감소하였으며 그 중 IL-1β 생성량은 유의성 있게 감소하였다(Fig.
뒷다리 체중 부하를 측정한 결과 대조군이 100±11.2%였을 때, 정상군 166.9±2.3%, 양성대조군 164.1±4.7%, KIT 투여군 142.0±16.4%로, KIT 투여군에서 유의성 있는 증가(p<0.05)가 나타났다(Fig. 3).
본 연구에서 MMP-9, TIMP-1 및 Osteocalcin 생성량은 KIT 군에서 유의성 있게 감소하여(Fig. 6), KIT 투여가 MMP-9, TIMP-1, Osteocalcin의 생성을 억제하여 proteoglycan 분해와 파골세포의 분화를 감소시켜 연골 및 골을 보호하는 효과가 있음을 알 수 있다.
세포독성을 관찰한 결과 RAW 264.7 세포에서 대조군(KIT 0 ㎍/㎖)의 생존율은 100.0±0.4%로 나타난 반면, KIT의 50, 100, 200(㎍/㎖) 농도에서는 각각 112.1±11.7%, 95.9±13.8%, 91.7±13.8%로 나타났다(Fig. 1).
약재의 안정성 검증을 위한 세포 독성검사에서는 KIT 50, 100, 200(㎍/㎖) 농도에서 세포 생존율이 모두 90% 이상으로 안정성이 검증되었다(Fig. 1).
조직 염색 후 100배 비율로 관찰한 결과, 정상군의 관절은 활막 조직이 정상적으로 위치한 반면, 대조군은 관절 주변에 활막 세포의 과다침투로 인해 연골과 뼈의 침윤으로 활막 조직의 손실이 나타났다. 양성대조군은 대조군에서 비해서 연골과 뼈의 침윤 등이 상대적으로 감소하였고, KIT 투여군도 연골과 뼈의 침윤이 많이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 8).
연골량을 측정한 결과 정상군 4.64 ㎣, 대조군 1.15 ㎣, 양성대조군 3.70 ㎣, KIT 투여군이 3.29 ㎣로 나타나, 대조군에 비해 KIT 투여군에서 연골이 덜 파괴되었다(Fig. 7).
이상과 같이 桂枝人蔘湯(KIT)은 항산화 및 항염증 효과가 있으며, 골관절염 병리 과정에서 혈액 내의 염증 cytokine과 염증 매개 인자 발현 및 연골 변성 억제가 실험적으로 관찰된 바, 골관절염에 유효하리라 사료된다.
이상의 연구 결과를 종합하면, 桂枝人蔘湯(KIT)의 투여가 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 항산화 및 항염증 효과를 확인할 수 있었고, MIA 유발 골관절염 rat에서 뒷다리의 체중 부하 증가, 혈액 내의 염증 cytokine과 염증매개 인자발현을 억제하는 항염증 효과, 연골의 변성 및 파괴를 방지에 유효하였다. 따라서 임상적 범주로 확장하는 추가연구를 통하여 향후 골관절염 약물로써 치료에 이용할 수 있으리라 사료된다.
조직 염색 후 100배 비율로 관찰한 결과, 정상군의 관절은 연골조직이 정상적으로 적으로 위치하였고, 대조군은 관절 주변에 염증세포의 침투가 일어나 붉게 염색된 정상 연골 조직이 MIA에 의해 파괴되어, proteoglycan 조직이 사라진 것을 관찰할 수 있었다. 양성대조군은 관절면에 대조군에서 비해 연골과 뼈의 침윤 등이 적었으며, 붉게 염색된 proteoglycan 조직이 활막 주변에 많이 분포하였다.
조직 염색 후 100배 비율로 관찰한 결과, 정상군의 관절은 활막 조직이 정상적으로 위치한 반면, 대조군은 관절 주변에 활막 세포의 과다침투로 인해 연골과 뼈의 침윤으로 활막 조직의 손실이 나타났다. 양성대조군은 대조군에서 비해서 연골과 뼈의 침윤 등이 상대적으로 감소하였고, KIT 투여군도 연골과 뼈의 침윤이 많이 억제되는 것으로 나타났다(Fig.
혈청 AST는 정상군, 대조군, 양성대조군, KIT 투여군에서 각각 130.0±8.7, 162.7±7.1, 160.0±15.1, 172.0±28.2로, 혈청 ALT는 정상군이 32.0±1.7, 대조군 33.7±1.2, 양성대조군 37.7±4.2, KIT 투여군 43.0±8.2로 나타났다(Fig. 4).
혈청 내 cytokine의 변화를 확인하기 위해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 생성량을 측정한 결과, KIT 군에서 감소하였으며 그 중 IL-1β 생성량은 유의성 있게 감소하였다(Fig. 5).
혈청 중의 BUN 농도는 정상군이 15.30±0.89, 대조군 18.10±1.45, 양성대조군 18.90±2.03, KIT 투여군 17.50±3.04로 나타났고, 혈청 중의 creatinine 농도는 정상군이 0.53±0.02, 대조군 0.55±0.02, 양성대조군 0.58±0.01, KIT 투여군 0.59±0.02로 나타났다(Fig. 4).

후속연구

7 세포에서 항산화 및 항염증 효과를 확인할 수 있었고, MIA 유발 골관절염 rat에서 뒷다리의 체중 부하 증가, 혈액 내의 염증 cytokine과 염증매개 인자발현을 억제하는 항염증 효과, 연골의 변성 및 파괴를 방지에 유효하였다. 따라서 임상적 범주로 확장하는 추가연구를 통하여 향후 골관절염 약물로써 치료에 이용할 수 있으리라 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	이 논문에서 桂枝人蔘湯이 골관절염에 미치는 영향을 살펴본 결과는?	1. 세포독성은 없었다. 2. 농도 증가에 따라 DPPH 소거활성은 증가하였다.
	골관절염의 특징은?	골관절염은 퇴행성 관절염 또는 퇴행성 관절질환이라고도 불리며, 주로 관절 연골의 국소적 퇴행성 변화, 연골하골의 비대, 주변 골연골부의 과잉 골 형성 등을 특징으로 한다1). 골관절염의 일차적인 변화는 연골에서 시작되고 연골, 뼈, 활막 세포에서 생성된 기질 단백 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)와 세포질 분해효소(cytokine)의 국소적인 생성에 의해 유도 된다2).
	골관절염 일차적인 변화는?	골관절염은 퇴행성 관절염 또는 퇴행성 관절질환이라고도 불리며, 주로 관절 연골의 국소적 퇴행성 변화, 연골하골의 비대, 주변 골연골부의 과잉 골 형성 등을 특징으로 한다1). 골관절염의 일차적인 변화는 연골에서 시작되고 연골, 뼈, 활막 세포에서 생성된 기질 단백 분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)와 세포질 분해효소(cytokine)의 국소적인 생성에 의해 유도 된다2).

참고문헌 (57)

The Korean Academy of Oriental Rehabilitation Medicine. Oriental Rehabilitation Medicine 3rd.. Seoul:KOONJA publishing inc. 2011:84.
Eugene Braunwald, A Fauci, D Kasper, S Hauser, D. Longo. The Korean Association of Internal Medicine. Harrison's principles of internal medicine 16th ed. Seoul:MIP Publisher. 2006:2083-4,2222-7.
Yoh SB, Sul JU, Shin MS. Research trends on the treatment of knee Osteoarthritis in Korean medicine. The Korean Journal of Acupuncture. 2011;28(1): 139-55.
Park BH. The commentary sanghanron clinical applications. Kangwon:Uibang publisher. 2004: 317-8.
Kim SJ, Park SM, Kang H, Shim BS, Kim SH, Choi SH, et al. Anti-inflammatory effect of Cinnamomi ramulus on collagen induced arthritis; a model for rheumatoid arthritis in DBA/1J mice and cytokine production in raw 264.7 cells. The Korean Journal of Oriental Physiology & Pathology. 2008;22(3):542-7.

원문보기 상세보기
Park EK, Shin YW, Lee HU, Kim SS, Lee YC, Lee BY, et al. Inhibitory effect of ginsenoside Rb1 and compound K on NO and prostaglandin E2 biosynthesis of RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide. Biol Pharm Bull. 2005;28: 652-6.

상세보기
Jung TY. Inhibitory effect of Korean ginseng extract on type II collagen-induced arthritis. Seoul: Graduate school, Yonsei Univ.; 2009.
Kim SH, Park YG. Effects of Atractylodis Rhizoma Alba extract on collagen-induced arthritis in mice. The Korean Journal of herbology. 2012;27(3):1-6.
Park JP, Son JH, Kim YM, Lee EY, Lim KH, Kim EH. Suppression of inflammatory macrophage response by Glycyrrhiza Uralensis herbal acupuncture extract. The Korean Journal of Acupuncture. 2011; 28(4):49-58.
Ryu HS, Kim HS. Effect of Zingiber officinale roscoe extracts on mice immune cell activation. The Korean Journal of Nutrition Korean. 2004; 37(1):23-30.
Lee SY. The new gobangchancha. Seoul:Koonja publisher. 2012:72.
TM. Piscaer, JH Waarsing, N Kops, P Pavljasevic, JAN Verhaar, GJVM. van Osch, et al. In vivo imaging of cartilage degeneration using $\mu$ CT-arthrography. Osteoarthritis and Cartilage. 2008;16(9):1011-7.

상세보기
Murphy JM, Dixon K, Beck S, Fabian D, Feldman A, Barry f. Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritis. Arthritis and Rheum. 2002;46(3):704-13.

상세보기
Yun JH. Osteoarthritis update. The Korean Journal of Medicine. 2012;82(2):170-4.

상세보기
Goldring MB, Otero M, Plumb DA, Draqomir C, Favero M, El Hachem K, et al. Roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism:signals and multiple effectors converge upon MMP-13 regulation in osteoarthritis. Eur Cell Mater 2011;21:202-220.
Jhun HJ, Ahn K, Lee SC. Estimation of the prevalence of osteoarthritis in Korean adults based on the data from the fourth Korea national health and nutrition examination survey. Anesth Pain Med 2010;5:201-206.
Walter R.Frontera. Muscular skeletal disease. Seoul:Koonja publisher. 2003:401.
Liu CC. Anti-Oxidants and Anti-inflammation Effects of Geongangbuja-tang. Daejoen: Graduate school, Daejoen Univ; 2011.
Choi WJ. The antioxidative and anti-inflammatory effects of lophatheri extracts for herbal-acupuncture via reducing iNOS synthesis induced by LPS in RAW 264.7 Cell. Iksan: Graduated school, Wonkwong Univ.; 2010.
Park SD. Effect of Cervi Pantotrichum Cornu herbal acupuncture on protease activities antioxidant in rheumatoid arthritis rats. The Journal of Korean Acupuncture and Moxibustion Society. 2002;19(2):51-64.

원문보기 상세보기
Sung YS, Choi HJ, Oh JM, Ji JG, Bak JW, Kim DH. The effect of KKBT in papain-induced osteoarthritis mice models. The Journal of Daejeon Oriental Medicine. 2012;21(1):33-52.

원문보기 상세보기
Textbook Compilation Committee, College of Oriental Medicine, the National sanghanron. Determined sanghanron. Seoul:Ilzungsa. 2003: 342-3.
Gil Ik-dong-dong . Yakjing. Seoul:Cheonghong Publisher. 2006:105,116, 129,203,216.
Yoo YC. Role of nitric oxide in the nickel and cobalt induced cytotoxicity in RAW 264.7 cell. The Korean Journal of Occupational and Environmental Medicine. 2001;13(3):274-7.
Matsukawa A, Ohkawara S, Maeda T, Takagi K, Yoshinaga M. Production of IL-1 and IL-1 receptor antagonist and the pathological significance in lipolysis-accharideinduced arthritis. Clin Exp Immunol. 1993;93(2):206-11.

상세보기
Cho HJ, Jang JB, Jung JU, Sung SC, Kim TK. Prevalence of radiographic knee osteoarthritis in elderly koreans. Knee surgery & related research. 2009;21:223-31.
Bove S.E., Calcaterra S.L., Brooker R.M., Huber C.M., Guzman R.E., Juneau P.L., et al. Weight bearing as a measure of disease progression and efficacy of anti-inflammatory compounds in a model of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2003;11 (11):821-30.

상세보기
Kim WY, Choi JB. Effects of Bee venom and Cervi Cornu Parvum pharmacoacupuncture in monosodium iodoacerare(MIA)-induced osteoarthritis rat. Journal of Oriental Rehabilitation Medicine. 2010;20(1):61-77.

상세보기
Janusz MJ, Hookfin EB, Heitmeyer SA, Woessner JF, Freemont AJ, Hoyland JA, et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9: 751-60.

상세보기
Guzman RE, Evans MG, Bove S, Morenko B, Kilgore K. Mono-iodoacetate-induced histologic changes in subchondralbone and articular cartilage of rat femorotibial joints: an animal model of osteoarthritis. Toxicol Pathol. 2003;31(6): 619-24.

상세보기
Kim NJ, Park JY, Han HC, Chang SH. Analgesic and anti-inflammatory effects of Ibuprofen, Indomethacin and NS-398 on an acute model of arthritis in rats. Korean Journal of Anesthesiology. 2001;40:802-13.
Ahn SI, Heuing BJ, Son JY. Antioxidative activity and nitrite scavenging abilities of some phenolic compounds. Korean J. Food Cookery Sci. 2007;23:19-24.
Kim SJ. DPPH radical scavenging and ACE inhibitory effects of the aerial parts of Fagopyrum esculentum, and isolation of flavonoids. MS thesis. Sunchon: Sunchon National Univ.; 2004.
Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric Oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev. 1991;43:109-42.

상세보기
Wink DA, Mitchell JB. Chemical biology of nitric oxide: Insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radic Biol Med. 1998;25(4-5):434-56.

상세보기
Miyasaka N, Hirata Y. Nitric oxide and inflammatory arthritides. Life Sci. 1997;61(21): 2073-81.

상세보기
Brune B, Zhou J, von Knethen A. Nitric oxide, oxidative stress and apoptosis. Kidney Int Suppl. 2003;84:4-22.
Delanty N, Dichter MA. Oxidative injury in the nervous system. Acta Neurol Scand. 1998;98: 53-145.
Iwanami K, Matsumoto I, Tanaka-Watanabe Y, Inoue A, Mihara M, Ohsuqi Y, et al. Crucial role of IL-6/IL-17 cytokine axis in the induction of arthritis by glucose 6 phosphate isomerase. Arthritis Rheum. 2008;58:754-63.

상세보기
Ji H, Pettit A, Ohmura K, Ortiz-Lopez A, Duchatelle V, Deqott C, et al. Critical roles for interleukin 1 and tumor necrosis factor alpha in antibody induced arthritis. J Exp Med. 2002;196: 77-85.

상세보기
Smolen JS, Aletaha D, Koeller M, Weisman MH, Emery P. New therapies for treatment on rheumatoid arthritis. Lancet. 2007;370(9602):1861-74.

상세보기
Lim CK, Yun YG. Anti-rheumatiod arthritis effects of I-Myo-San water extract. The Korean Journal of Oriental Medical Prescription. 2009; 17(1):99-111.

원문보기 상세보기
Martel-Pelletier J, Pelletier JP, Fahmi H. Cyclooxygenase-2 and prostaglandins in articular tissues. Semin Arthritis Rheum. 2003;33(3):155-67.

상세보기
Bang SJ, Kim IS, Kim OS, Kim YJ, Jung HJ. IL-6 gene promoter polymorphisms in Korean generalized aggressice periodontitis patients. The Journal of the Korean Academy of Periodontology. 2008;38:579-88.
Mary KC, Shawn OF. Kwok HS, Kim JW, Kim HG, Jung HS, Tae GS translation. Biochemistry, Fifth Edition. Seoul:Life Science Publisher 2007:451.
Harizi H, Corcuff JB, Gualde N. Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends in Molecular Medicine. 2008;14(10):461-9.

상세보기
Horton JK, Williams AS, Smith-Phillips Z, Martin RC, O'Beirne G. Intracellular measurement of prostaglandin E2: effect of anti-inflammatory drugs on cyclooxygenase activity and prostanoid expression. Anal Biochem. 1999; 271(1):18-28.

상세보기
Dubois RN, Abramson SB, Crofford L, Gupta RA, Simon LS, Van De Putte LB, et al. Cyclooxygenase in biology and disease. FASEB J. 1998;12:1063-73.

상세보기
Anguita J, Samanta S, Ananthanarayanan SK, Revilla B, Geba GP, Barthold SW, et al. Cyclooxygenase 2 activity modulates the severity of murine Lyme arthritis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002;34(3):187-91.

상세보기
Harizi H, Corcuff JB, Gualde N. Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends in Molecular Medicine. 2008;14(10):461-9.

상세보기
Laufer S. Role of eicosanoids in structural degradation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2003;15(5):623-724.

상세보기
Griffiths RJ, Smith M, Roach ML, Stock JL, Stam EJ, Milici AJ, et al. Collagen-induced arthritis is reduced in 5-lipoxygenase-activating protein-deficient mice. J Exp Med. 1997;185: 1123-9.

상세보기
Bresnihan B. Pathogenesis of joint damage in rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 1999;26:717-9.

상세보기
Nagase H, Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem. 1999;274: 21491-4.

상세보기
Halliwell B. Oral inflammation and reactive spe cies: a missed opportunity. Oral Dis. 2000;6:137.
Lambert E, Dasse E, Haye B, Petitfrere E. TIMPs as multifacial proteins. Crit Rev Oncol Hematol. 2004;49(3):187-98.

상세보기
Garnero P, Piperno M, Gineyts E, Christigau S, Delmas PD, Vignon E. Cross sectional evaluation of biochemical markers of bone, cartilage and synovial tissue metabolism in patients with knee osteoarthritis: relations with disease activity and joint damage. Ann Rheum Dis. 2001;60: 619-26.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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