연교패독산(連翹敗毒散) 복용 후 항동맥경화 효과가 나타난 백서에서 염증 지표 관찰 Observation of Inflammatory Marker Levels in Sprague-Dawley Rats with Youngyopaedoc-san-related Anti-atherogenic Effect원문보기
Objectives: Sprague-Dawley rats were fed with high fat diet, and atherogenic changes were seen in the aorta. However, when Sprague-Dawley rats were fed with a high fat diet and administered Youngyopaedoc-san together, these atherogenic changes were rarely seen. This study was aimed to find the infla...
Objectives: Sprague-Dawley rats were fed with high fat diet, and atherogenic changes were seen in the aorta. However, when Sprague-Dawley rats were fed with a high fat diet and administered Youngyopaedoc-san together, these atherogenic changes were rarely seen. This study was aimed to find the inflammatory marker level changes in Sprague-Dawley rats with Youngyopaedoc-san-related anti-atherogenic effect. Methods: The extract from Youngyopaedoc-san was made by the pharmacy department of Kyung-hee Oriental Medical Hospital. The animals were divided into five groups: normal diet, high fat diet, high fat diet with Youngyopaedoc-san, high fat diet with Vytorin, and high fat diet with Youngyopaedoc-san and Vytorin. A light microscopic image of a cross section taken from the aorta of the Sprague-Dawley rat was analyzed. We compared inflammatory marker levels among the five groups. Results: The complex of Youngyopaedoc-san and Vytorin has more anti-atherogenic effects in the aorta of Sprague-Dawley rats fed with high fat diet than Vytorin alone. Youngyopaedoc-san has inhibitory effect on the increase of IFN-${\gamma}$ and IL-2 levels. The difference on eosinophil levels of each group was statistically significant, but the eosinophil level of each group was within normal limits, so the difference on eosinophil levels was not clinically significant. Conclusions: Youngyopaedoc-san-related anti-atherogenic effect could be a result of inhibitory mechanism on IFN-${\gamma}$ and IL-2.
Objectives: Sprague-Dawley rats were fed with high fat diet, and atherogenic changes were seen in the aorta. However, when Sprague-Dawley rats were fed with a high fat diet and administered Youngyopaedoc-san together, these atherogenic changes were rarely seen. This study was aimed to find the inflammatory marker level changes in Sprague-Dawley rats with Youngyopaedoc-san-related anti-atherogenic effect. Methods: The extract from Youngyopaedoc-san was made by the pharmacy department of Kyung-hee Oriental Medical Hospital. The animals were divided into five groups: normal diet, high fat diet, high fat diet with Youngyopaedoc-san, high fat diet with Vytorin, and high fat diet with Youngyopaedoc-san and Vytorin. A light microscopic image of a cross section taken from the aorta of the Sprague-Dawley rat was analyzed. We compared inflammatory marker levels among the five groups. Results: The complex of Youngyopaedoc-san and Vytorin has more anti-atherogenic effects in the aorta of Sprague-Dawley rats fed with high fat diet than Vytorin alone. Youngyopaedoc-san has inhibitory effect on the increase of IFN-${\gamma}$ and IL-2 levels. The difference on eosinophil levels of each group was statistically significant, but the eosinophil level of each group was within normal limits, so the difference on eosinophil levels was not clinically significant. Conclusions: Youngyopaedoc-san-related anti-atherogenic effect could be a result of inhibitory mechanism on IFN-${\gamma}$ and IL-2.
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문제 정의
동맥경화는 내막손상이 원인이 되어 염증반응이 시작되며, 연교패독산은 항염증 효과가 보고되었기 때문에, 연교패독산으로 항동맥경화 효과를 살펴보고자 Sprague Dawley rat을 대상으로 본 연구를 실시하였다.
한약 양약 병용투여에 대해서는 혈부축어탕과 Aspirin14), 소풍활혈탕과 Clopidogrel15) 등 기존의 연구에서 한약, 양약 단독 투여군 및 한약 양약 병용투여 군의 효과를 비교한 자료 등에 근거하여 본 연구에서는 Sprague Dawley rat을 대상으로 3주간 고지방식이와 함께 연교패독산을 투여함과 동시에 연교패독산과 항동맥경화제인 Vytorin 병용 투여 및 Vytorin 단독 투여하여 고지방식이 섭취로 인한 대동맥의 동맥경화성 변화가 조직학적으로 확인되었으나 연교패독산 동시 복용으로 항동맥경화 효과가 나타난 Sprague Dawley rat을 대상으로 염증 지표의 변화를 관찰하고자 하였다.
제안 방법
Merck Sharp & Dohme (MSD)에서 나온 Vytorin 10/40 (ezetimibe 10mg, simvastatin 40mg)을 복용법에 따라 계산하여 8.3mg/kg/day로 oral gavage로 투여하였다.
5°C, 습도 45±5%이며, 매일 광주기 및 암주기를 각각 12시간이 되도록 조절하였다. 실험동물은 각 군의 8마리씩을 stainless steel cage에 분류하여 사육하였고 식이와 물은 자유 공급하였다.
실험동물은 사육실에서 사육하였으며 사육실 온도는 24±0.5°C, 습도 45±5%이며, 매일 광주기 및 암주기를 각각 12시간이 되도록 조절하였다.
실험에서 사용한 연교패독산은 동의보감에 수록된 처방을 기준으로 하였으며 1첩 당 각 구성 약재는 다음과 같으며(Table 1) 하루 복용량을 2첩으로 계산하였다. 각 구성 약재는 경희대학교 경희의료원 한방병원에서 구입하였다.
실험은 6주령 수컷 Sprague Dawley rat 8마리씩을 정상군(Normal group), 대조군(Control group), 연교패독산 투여군, 연교패독산과 Vytorin 병용 투여군, Vytorin 투여군으로 나누어 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 군은 3주간 60kcal% fat의 고지방식이를 투여하였다.
3mg/kg/day를 10cc/kg 증류수에 희석하여 경구 투여하였다. 약물을 투여하지 않는 정상군과 대조군에서는 증류수를 같은 량으로 10cc/kg 투여하였다.
연교패독산 1800g을 둥근 플라스크에 넣고 증류수 2000ml를 가하여 가열-추출을 2회하고 추출액을 여과지로 여과하였다. 이들을 rotary evaporator(vaccum evaporator, EYELA, Japan)로 감압 농축한 다음 deep freezer (ultra low temperature freezer, 일신바이오, 한국)로 -70.
정상군을 제외한 나머지 군은 3주간 60kcal% fat의 고지방식이를 투여하였다. 연교패독산 투여군은 매일 1회 동일한 시간에 연교패독산 분말 3g/Kg/day를 10cc/kg 증류수에 희석하여 경구 투여하였고, Vytorin 투여군은 Vytorin 8.3mg/kg/day를 10cc/kg 증류수에 희석하여 경구 투여하였고, 연교패독산과 Vytorin 병용 투여군에서는 연교패독산 분말 3g/Kg/day와 Vytorin 8.3mg/kg/day를 10cc/kg 증류수에 희석하여 경구 투여하였다. 약물을 투여하지 않는 정상군과 대조군에서는 증류수를 같은 량으로 10cc/kg 투여하였다.
이들을 rotary evaporator(vaccum evaporator, EYELA, Japan)로 감압 농축한 다음 deep freezer (ultra low temperature freezer, 일신바이오, 한국)로 -70.6°C 에서 동결 건조하여 연교패독산 건조 분말을 400g(수득률 22.22%)을 얻었다.
실험은 6주령 수컷 Sprague Dawley rat 8마리씩을 정상군(Normal group), 대조군(Control group), 연교패독산 투여군, 연교패독산과 Vytorin 병용 투여군, Vytorin 투여군으로 나누어 진행하였다. 정상군을 제외한 나머지 군은 3주간 60kcal% fat의 고지방식이를 투여하였다. 연교패독산 투여군은 매일 1회 동일한 시간에 연교패독산 분말 3g/Kg/day를 10cc/kg 증류수에 희석하여 경구 투여하였고, Vytorin 투여군은 Vytorin 8.
제작된 블록은 microtome을 이용하여 3~4μm의 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수과정을 거친 다음 hematoxyline과 eosin 일반 염색을 실시하여 광학현미경과 컴퓨터 영상분석기로 대동맥을 기준으로 축적된 지방의 면적 비율을 관찰 및 사진 촬영(200배율, 400배율)하였다.
22%)을 얻었다. 제조된 연교패독산에 대해서는 high performance liquid chromatography (HPLC) 분석으로 확인하였다.
적출된 대동맥 조직의 표본 제작을 위해 10% formalin 용액에서 12~24시간 고정시킨 후 충분히 수세하였다. 탈수는 60~100% alcohol을 순차적으로 1시간씩 침투시킨 후 xylene을 투명제로 하여 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 블록은 microtome을 이용하여 3~4μm의 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수과정을 거친 다음 hematoxyline과 eosin 일반 염색을 실시하여 광학현미경과 컴퓨터 영상분석기로 대동맥을 기준으로 축적된 지방의 면적 비율을 관찰 및 사진 촬영(200배율, 400배율)하였다.
실험에서 사용한 연교패독산은 동의보감에 수록된 처방을 기준으로 하였으며 1첩 당 각 구성 약재는 다음과 같으며(Table 1) 하루 복용량을 2첩으로 계산하였다. 각 구성 약재는 경희대학교 경희의료원 한방병원에서 구입하였다.
실험동물의 식이 및 사육, 실험에 이용된 동물은 중앙실험동물(주)에서 구입한 체중 200g 전후의 6주령 수컷 Sprague Dawley Rat으로 8마리씩 5군으로 나누어 2주간 적응 시킨 후 3주간 사육하였다. 실험동물은 사육실에서 사육하였으며 사육실 온도는 24±0.
연교패독산에 대한 양성대조약물로서 지방흡수 억제제 및 HMG-CoA reductase inhibitors 복합제인 MSD의 Vytorin 10/40 (ezetimibe 10mg, simvastatin 40mg)을 선정하였다. HMG-CoA reductase는 cholesterol 대사를 조절하는 주요 효소로서, HMG-CoA reductase 활성억제는 고콜레스테롤혈증과 동맥경화를 예방 치료하는데 유용한 것13)으로 알려져 있다.
데이터처리
D (n=8). The significant differences with the control group were statistically calculated by Mann-Whitney test. YG: The group administered Youngyopaedoc-san, VY: The group administered Vytorin, YG+VY: The group administered Youngyopaedoc-san and Vytorin.
결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 각 군간 통계학적인 차이를 보기 위해 SPSS (version:20.0k; SPSS InC. Chicago, Illinois, USA)를 이용하여 정규성 검정을 한 결과 정규성을 만족하지 않았으므로 비모수 검정인 Kruskal Wallis test를 실시하여 유의성 여부를 검증하였고 Kruskal Wallis test에서 유의성이 인정된 경우 Mann-Whitney test를 실시하여 대조군과 비교하였으며, p값이 0.05미만인 경우 유의성을 인정하였다.
Immunoturbidimetric assay로 측정하였고 CRP(Latex) HS (Roche, Germany)를 사용하였다.
배양 후 상층액을 수집하여 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 방법으로 IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-12p70, TNF-α, IL-6을 측정하였다.
성능/효과
1. 연교패독산 또는 Vytorin을 단독으로 투여하는 것보다 연교패독산과 Vytorin을 함께 투여하는 것이 고지방식이로 인해 유발되는 거품세포 변성 및 지방 침착 등 대동맥 조직의 동맥경화성 변화를 억제하는데 효과적이다.
13가지 항목 중 WBC, S-Neutrophil, Lymphocyte, Monocyte, hs-CRP, IL-1β, IL-4, IL-12p70, TNF-α, IL-6에 대해서는 정상군, 고지방식이를 투여한 대조군, 고지방식이와 함께 연교패독산, Vytorin을 단독 혹은 병용 투여한 다섯 군에 대하여 통계학적으로 유의성 있는 차이는 검증되지 않았다.
2. 고지방식이와 함께 연교패독산을 단독 투여한 경우 및 연교패독산을 Vytorin과 함께 병용 투여한 경우 IFN-γ가 통계학적으로 유의성 있게 낮았고, 고지방식이만을 투여한 대조군보다 고지방식이와 함께 연교패독산을 단독 투여한 군에서 IL-2이 통계학적으로 유의성 있게 감소하였다.
3. Eosinophil에서 통계학적으로 유의성 있는 차이가 검증되었으나 모든 군이 정상 참고치에 속해 임상적 의미는 없다.
IFN-γ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-12p70, TNF-α, IL-6의 측정값을 분석한 결과 고지방식이를 투여한 대조군에서 IFN-γ, IL-2, TNF-α가 통계학적으로 유의성 있게 상승하여 고지방식이로 인해 IFN-γ, IL-2, TNF-α이 상승한 것으로 해석된다.
특이한 것은 고지방식이와 함께 Vytorin을 투여한 실험군에서 Eosinophil이 상승하였으나 고지방식이와 함께 연교패독산과 Vytorin을 병용 투여한 실험군에서는 오히려 감소한 것이다. Vytorin 단독 투여군과 연교패독산 Vytorin 복합 투여군에서의 Eosinophil의 차이는 대조군과 비교했을 때 통계학적으로 유의성이 입증되었다. 통계학적으로 유의성 있는 차이가 관찰되기는 하나 정상군을 포함한 모든 실험군에서 Eosinophil 혈중 농도가 정상 범위로 측정되고 있기 때문에 임상적으로 시사하는 바는 크지 않다고 생각된다.
고지방식이를 투여한 대조군에서는 내피세포 아래층에 거품 양상으로 세포가 변형된 소견이 나타났으며 고지방식이와 함께 연교패독산 또는 Vytorin은 단독으로 투여한 군에서는 거품 양상으로 세포가 변성된 소견이 나타난 것에 비해 연교패독산 Vytorin을 함께 투여한 군에서는 지방 침착의 정도가 미약하여 전반적으로 정상소견임을 확인할 수 있었다(Fig1).
고지방식이와 함께 연교패독산을 단독 투여한 경우 및 연교패독산을 Vytorin과 함께 병용 투여한 모든 경우에 대해 IFN-γ의 통계학적으로 유의성 있는 감소가 확인되어 연교패독산이 IFN-γ 감소시키는 기전에 작용하는 것으로 추측된다.
고지방식이와 함께 연교패독산을 단독 투여한 경우 및 연교패독산을 Vytorin과 함께 병용 투여한 모든 경우에 대해 IFN-γ의 통계학적으로 유의성 있는 감소가 확인되어 연교패독산이 IFN-γ 감소시키는 기전에 작용하는 것으로 추측된다. 고지방식이와 함께 연교패독산을 단독투여한 군에서 고지방식이만을 투여한 대조군보다 IL-2이 통계학적으로 유의성있게 감소하여 연교패독산이 단독적으로 IL-2의 상승 억제에 영향을 주는 것으로 사료된다. 염증 지표와 관련하여 WBC, S-Neutrophil, Lymphocyte, Monocyte, hs-CRP 및 Eosinophil의 혈청학적 검사 소견에서 뚜렷한 통계학적, 임상적 의미를 찾기 어려우나 IFN-γ, IL-2 등 일부의 cytokine에 대해서 위와 같은 차이가 나타나는 것에 대해서는 동맥경화성 변화에 관여하는 염증 반응이 전신적으로 나타나는 염증 반응이 아니기 때문에 혈청학적 소견에서 뚜렷한 염증 소견이 나타나지 않은 것으로 생각된다.
광학현미경 관찰에서 정상군과 달리 고지방식이 투여군에서 지방 변성이 관찰되었으며 고지방식이와 함께 연교패독산, Vytorin 각각을 단독 투여한 군에서도 부분적인 변화가 관찰된다. 반면에 고지방식이와 함께 연교패독산과 Vytorin을 병용 투여한 군에서는 지방 침착이 미미하여 연교패독산 또는 Vytorin 단독투여군보다 연교패독산 및 Vytorin 복합 투여군에서 조직학적 소견이 양호하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
Eosinophil은 고지방식이를 투여한 대조군에 비해 Vytorin을 투여한 고지방식이군에서 통계학적으로 유의미하게 상승하였다. 연교패독산과 Vytorin을 병용 투여한 고지방식이군에서는 통계학적으로 유의미하게 감소하였으며 측정값은 모든 실험 군에서 정상범위에 속하였다.
고지방식이와 함께 Vytorin을 단독 투여한 군에서도 IL-2의 감소되는 경향이 있었으나 통계학적인 유의성은 없었다. 연교패독산과 Vytorin을 병용투여한 군에서는 Vytorin 단독투여군보다 IL-2가 더 많이 감소하는 경향성을 확인할 수 있었으나 통계학적인 유의성은 없었다[Table4].
염증 지표를 측정한 결과 WBC, S-Neutrophil, Lymphocyte, Monocyte, hs-CRP에 대하여 각 군간에 통계학적인 유의성 있는 차이는 검증되지 않았다
이상의 결과를 볼 때, 연교패독산 단독 투여 및 Vytorin과의 병용 투여군에서 조직학적으로 확인된 대동맥의 항동맥경화 효과는 IFN-γ, IL-2의 상승을 막아주는 연교패독산의 항염증 작용과 관련성이 있을 것으로 생각된다.
이상의 결과를 통해 연교패독산 복용으로 나타난 대동맥의 항동맥경화 효과는 IFN-γ, IL-2의 상승을 막아주는 연교패독산의 항염증 작용과 관련성이 있는 것으로 보인다.
후속연구
이에 비해 본 연구에서는 6주령, 200 g 전후의 Sprague Dawley rat을 대상으로 2주간의 적응 기간을 가진 후 3주간의 고지방식이를 투여하였기 때문에 고지방식이가 상대적으로 영향을 적게 미쳤다고 생각한다. 본 연구에서는 대동맥 조직의 동맥경화성 변화를 광학현미경 관찰을 통해 정성적으로 파악하였는데 향후의 추가적인 실험 연구에서 동맥경화성 변화의 정도를 보다 세밀하고 구체적으로 정량적으로 파악한다면 각 군 간에 보이는 조직학적 소견의 차이에 대하여 통계학적으로 엄격히 검증할 수 있을 뿐만 아니라 염증 지표와의 상관성에 대해서도 보다 구체적인 해석이 가능할 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
동맥경화는 무엇인가?
동맥경화는 다양한 요인에 의해 혈관의 구조에 장애가 일어나 동맥벽 안에 지질이나 세포외기질의 비정상적인 축적이 일어나는 경화성 변화를 말한다. 동맥경화의 발생은 내막의 손상으로 시작이 되는데 고지혈증과 같은 화학적 장애는 내막 손상의 원인이 된다.
동맥경화는 내막손상이 원인이 되어 염증반응이 시작되어 합병증을 일으키는 과정은 무엇인가?
동맥경화의 발생은 내막의 손상으로 시작이 되는데 고지혈증과 같은 화학적 장애는 내막 손상의 원인이 된다. 내막의 손상을 계기로 동맥벽 안으로 침투된 지질단백(low density lipoprotein, LDL)은 이물질로 간주되어 내피세포에서 cytokine이 형성되는 등 염증 반응이 시작되고 결국에는 동맥경화성 플라크를 형성하여 동맥경화로 인한 합병증을 일으킨다1). 때문에 염증반응에 주목하여 관상동맥의 동맥경화로 나타나는 심혈관 질환의 병태 생리에 대해 이해하고 심혈관질환의 예방 및 치료에 접근할 수 있다2).
동맥경화의 발생은 무엇으로부터 시작되는가?
동맥경화는 다양한 요인에 의해 혈관의 구조에 장애가 일어나 동맥벽 안에 지질이나 세포외기질의 비정상적인 축적이 일어나는 경화성 변화를 말한다. 동맥경화의 발생은 내막의 손상으로 시작이 되는데 고지혈증과 같은 화학적 장애는 내막 손상의 원인이 된다. 내막의 손상을 계기로 동맥벽 안으로 침투된 지질단백(low density lipoprotein, LDL)은 이물질로 간주되어 내피세포에서 cytokine이 형성되는 등 염증 반응이 시작되고 결국에는 동맥경화성 플라크를 형성하여 동맥경화로 인한 합병증을 일으킨다1).
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