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문제 정의
- 본 연구에서는 폐사가 자주 발생하는 여름철 고수온기에 피조개 양식장 해저 저층과 피조개 체내에 존재하는 배양이 가능한 모든 미생물을 분리한 후, 용혈활성을 보이는 균주만을 선별하여 16S rDNA 염기서열 정보를 분석함으로써 균주를 동정하고자 하였다. 그리고 동정한 미생물의 정보로써 월별, 지역별 미생물 균총의 다양성을 비교, 분석하여 피조개의 대량폐사 원인 균주를 규명하고자 하였다. 또한 속(genus) 이상의 과(family) 또는 목(order) 수준의 미생물 다양성 분석은 너무 많은 미생물을 포함하는 분류학적 집합이라서 모든 샘플에서 비슷한 결과가 나왔기 때문에 속 이하의 범위에서 미생물의 다양성을 비교하여 지역에 따른 정확한 미생물 다양성을 분석하고자 하였다(Kim et al.
- 그리고 동정한 미생물의 정보로써 월별, 지역별 미생물 균총의 다양성을 비교, 분석하여 피조개의 대량폐사 원인 균주를 규명하고자 하였다. 또한 속(genus) 이상의 과(family) 또는 목(order) 수준의 미생물 다양성 분석은 너무 많은 미생물을 포함하는 분류학적 집합이라서 모든 샘플에서 비슷한 결과가 나왔기 때문에 속 이하의 범위에서 미생물의 다양성을 비교하여 지역에 따른 정확한 미생물 다양성을 분석하고자 하였다(Kim et al., 2012). 이러한 자료를 토대로 미생물 균총의 다양성과 후보원인 균주의 미생물학적인 특징을 규명하고, 나아가 피조개 대량폐사 및 패류의 대량 폐사 원인관계를 밝히는 연구에 기초적인 자료가 되고자 하였다.
- , 1998). 또한 이러한 헤모글로빈의 파괴 또는 손상현상은 주로 알파와 베타 용혈활성이기 때문에 고수온기 폐사가 자주 발생하는 지점과 빈도가 낮은 지점에서 분리한 미생물 중에서 알파 또는 베타 용혈활성을 보이는 균주들을 선별하였으며, 용혈활성을 보이는 균주들 중 두 지역에서 차이가 나는 종을 비교함으로써 대량 폐사 원인 균주를 구명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 폐사가 자주 발생하는 여름철 고수온기에 피조개 양식장 해저 저층과 피조개 체내에 존재하는 배양이 가능한 모든 미생물을 분리한 후, 용혈활성을 보이는 균주만을 선별하여 16S rDNA 염기서열 정보를 분석함으로써 균주를 동정하고자 하였다. 그리고 동정한 미생물의 정보로써 월별, 지역별 미생물 균총의 다양성을 비교, 분석하여 피조개의 대량폐사 원인 균주를 규명하고자 하였다.
- 피조개는 몸의 일부 및 대부분을 바닥에 잠입하고, 식물성 플랑크톤을 여과 섭식하기 때문에 흙질이 부드러운 양식장 바닥에서 서식한다(Yoo, 1986). 본 연구에서는 피조개의 이러한 습성을 고려하여 피조개 체내에 존재하는 미생물과 함께 양식장 해저 퇴적물에 존재하는 병원성 후보 미생물의 균총을 비교, 분석을 함으로서 대량 폐사의 원인 균주를 규명 하고자 하였다. 또한 피조개 양식장에서 대량 폐사가 발생하는 정확한 시기는 알려져 있지 않고 여름철 고수온기 및 산란 후인 6월에서 9월 사이 주로 발생한다고 알려져 있어 고온기인 6월에서 9월 사이의 피조개 양식장 저층 및 피조개 체내의 미생물 군집을 분석하였다(Kim et al.
- 대량폐사로 인한 경제적인 손실을 해결하기 위하여 피조개의 생리에 영향을 미치는 다양한 환경 인자에 대한 연구가 집중적으로 수행되어 왔으나 미생물학적인 연구는 미진한 실정이다. 본 연구에서는 피조개의 주요 혈액 성분인 헤모글로빈이 미생물의 병원성인자에 의하여 피해를 받아 발생하는 용혈현상과 피조개의 폐사와의 연관성을 규명하기 위하여 피조개 양식장의 용혈활성 미생물을 중심으로 분석하였다. 여름철 고수온기인 6월부터 9월까지 강진만과 진해만 피조개 양식장의 해저퇴적물과 피조개 체내에서 분리한 약 4,200여점의 배양가능 용혈성 미생물의 다양성 및 지역 특이적인 미생물을 분석하였다.
- 용혈활성을 보이는 미생물의 16S rDNA 정보를 기초로 미생물 다양성을 조사하였고, 이러한 정보를 비교 및 분석하여 폐사가 빈번한 강진만 지역에서는 분리가 되었으나 폐사 빈도가 낮은 진해만 지역에서는 발견이 되지 않는 균주를 조사함으로써 피조개 대량폐사 원인 균주를 분석하고자 하였다. 그 결과 53속 140종의 미생물이 오직 강진만 지역의 퇴적물 또는 피조개 체내에서만 존재함을 알 수 있었다 (Table 3).
- , 2012). 이러한 자료를 토대로 미생물 균총의 다양성과 후보원인 균주의 미생물학적인 특징을 규명하고, 나아가 피조개 대량폐사 및 패류의 대량 폐사 원인관계를 밝히는 연구에 기초적인 자료가 되고자 하였다.
제안 방법
- 16S rDNA 염기서열 정보를 기반으로 분석한 미생물은 가장 근연종으로 판별한 뒤 각 지역별, 월별에 따른 미생물 다양성을 분석 하였으며, 종(species) 수준의 정도에서 폐사 빈도에 따른 월별, 지역별 미생물 다양성의 차이를 비교하였다.
- 수집한 해저 퇴적물은 무균 상태에서 phosphate-buffered saline(PBS)를 이용하여 marine 고체배지(Difco, USA), R2A 고체배지(Difco, USA), 1/10 marine 고체배지와 1/10 R2A 고체배지에 각각 도말 하였으며, 피조개 샘플들은 패각 내부의 조직만을 적출 후 균질화하여 도말하였다. 20℃에서 24시간 단위로 배지의 표면상의 배양된 균주를 분리하여 배양이 가능한 모든 균주를 선별하였다. 분리된 균주는 동일한 고체배지에서 배양과정을 거쳐 하나의 순수 colony를 선별하는 과정을 수행한 뒤 실험에 사용하였으며, 각각의 미생물은 액체배양 후 glycerol 보존방법을 이용하여 -80℃에서 보관하였다.
- Ethidium bromide (EtBr)이 포함된 1% agarose gel을 이용한 전기영동 분석을 통하여 PCR 과정으로 증폭된 16S rDNA 증폭된 산물들을 확인하고, QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, German)를 이용하여 정제한 뒤 순도 및 농도를 측정하였다. 정제된 16S rDNA를 주형으로 하여 3130XL Genetic analyzer (Applied Biotechnology, USA) DNA sequencing 기기로써 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다.
- , Korea)에 떨어뜨려 반응 후 환 주위의 특성을 통하여 알파, 베타 또는 감마 용혈 활성의 정도를 평가하였다. 각각의 분리 미생물 중에서 알파와 베타 용혈활성을 보이는 균주들만을 선별하고, DNA 분석을 실시하여 지역별 용혈활성 미생물 군집의 다양성을 평가하였다.
- 본 연구에서는 피조개의 이러한 습성을 고려하여 피조개 체내에 존재하는 미생물과 함께 양식장 해저 퇴적물에 존재하는 병원성 후보 미생물의 균총을 비교, 분석을 함으로서 대량 폐사의 원인 균주를 규명 하고자 하였다. 또한 피조개 양식장에서 대량 폐사가 발생하는 정확한 시기는 알려져 있지 않고 여름철 고수온기 및 산란 후인 6월에서 9월 사이 주로 발생한다고 알려져 있어 고온기인 6월에서 9월 사이의 피조개 양식장 저층 및 피조개 체내의 미생물 군집을 분석하였다(Kim et al., 2012).
- 반응조성은 chromosomal DNA 0.1 μg, 10 pM primer set, 2.5 mM dNTPs, reaction buffer, 그리고 1 U ExTaq (Takara, Japan)을 넣은 뒤 최종 부피 20 μL가 되도록 하여 증폭을 실시하였으며, 반응 조건은 초기변성단계 94℃ 2분 뒤, 변성단계 94℃ 20초, 결합반응 55℃ 20초, 증폭반응 72℃ 1분을 총 25회 반응한 뒤 72℃에서 5분간 반응하였다.
- 분리균주 배양액 50µl를 미리 구멍을 낸 혈액한천평판배지(Micro media Co. Ltd., Korea)에 떨어뜨려 반응 후 환 주위의 특성을 통하여 알파, 베타 또는 감마 용혈 활성의 정도를 평가하였다.
- 20℃에서 24시간 단위로 배지의 표면상의 배양된 균주를 분리하여 배양이 가능한 모든 균주를 선별하였다. 분리된 균주는 동일한 고체배지에서 배양과정을 거쳐 하나의 순수 colony를 선별하는 과정을 수행한 뒤 실험에 사용하였으며, 각각의 미생물은 액체배양 후 glycerol 보존방법을 이용하여 -80℃에서 보관하였다.
- 다양한 배지 가운데서 marine 배지(Difco, USA)와 R2A 배지(Difco, USA)의 경우 수해양 미생물을 분석에 최적 배지라고 알려져 있어 두 배지를 이용하여 퇴적물과 조개 체내에 존재하는 미생물을 분리 하였다(Difco, 1998). 수집한 해저 퇴적물은 무균 상태에서 phosphate-buffered saline(PBS)를 이용하여 marine 고체배지(Difco, USA), R2A 고체배지(Difco, USA), 1/10 marine 고체배지와 1/10 R2A 고체배지에 각각 도말 하였으며, 피조개 샘플들은 패각 내부의 조직만을 적출 후 균질화하여 도말하였다. 20℃에서 24시간 단위로 배지의 표면상의 배양된 균주를 분리하여 배양이 가능한 모든 균주를 선별하였다.
- 순수하게 분리한 배양가능 미생물은 각각 분리된 marine 또는 R2A 액체배지에 20℃에서 100rpm으로 배양한 뒤 배양액을 Manns (1994) 등의 수정된 방법을 통하여 용혈활성을 확인하였다. 분리균주 배양액 50µl를 미리 구멍을 낸 혈액한천평판배지(Micro media Co.
- 집균한 후보 균주들의 균체는 protease K를 첨가한 magnetic isolation kit (TNT, Japan)의 lysis 용액을 이용하여 현탁 한 뒤 37℃에서 16-20시간 반응하여 lysis 시킨 후 핵산 추출 자동화기기(MFX-6100, TOYOBO, Japan)를 이용하여 total chromosomal DNA를 순수하게 분리하였다. 순수하게 정제한 DNA를 분광광도계로 순도 및 농도를 측정한 후, Weisburg (1991) 등의 방법을 응용하여 목적한 16S rDNA를 증폭하였다. 이 때, 분리한 chromosomal DNA를 주형으로 forward primer (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 reverse primer (5‘-ACG GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)를 이용하여 약 1.
- 알파 또는 베타 용혈활성을 보이는 균주만을 선별한 뒤, 후보 균주들은 각각 분리된 marine 또는 R2A 액체배지에서 1-4일 배양 후 원심분리를 통하여 충분한 양의 균체만을 순수하게 집균하였다. 집균한 후보 균주들의 균체는 protease K를 첨가한 magnetic isolation kit (TNT, Japan)의 lysis 용액을 이용하여 현탁 한 뒤 37℃에서 16-20시간 반응하여 lysis 시킨 후 핵산 추출 자동화기기(MFX-6100, TOYOBO, Japan)를 이용하여 total chromosomal DNA를 순수하게 분리하였다.
- 본 연구에서는 피조개의 주요 혈액 성분인 헤모글로빈이 미생물의 병원성인자에 의하여 피해를 받아 발생하는 용혈현상과 피조개의 폐사와의 연관성을 규명하기 위하여 피조개 양식장의 용혈활성 미생물을 중심으로 분석하였다. 여름철 고수온기인 6월부터 9월까지 강진만과 진해만 피조개 양식장의 해저퇴적물과 피조개 체내에서 분리한 약 4,200여점의 배양가능 용혈성 미생물의 다양성 및 지역 특이적인 미생물을 분석하였다. 6월에 25속 118종, 7월에 24 속 89종, 8월에 30속 109종, 그리고 39속 141종의 미생물을 분리하였으며, 16S rDNA 정보를 통하여 지역별 미생물 다양성을 분석한 결과 폐사빈발 지역에서만 특이적으로 존재하는 140종의 미생물을 분리하였다.
- Ethidium bromide (EtBr)이 포함된 1% agarose gel을 이용한 전기영동 분석을 통하여 PCR 과정으로 증폭된 16S rDNA 증폭된 산물들을 확인하고, QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, German)를 이용하여 정제한 뒤 순도 및 농도를 측정하였다. 정제된 16S rDNA를 주형으로 하여 3130XL Genetic analyzer (Applied Biotechnology, USA) DNA sequencing 기기로써 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 획득한 염기 서열은 BioEdit (7.
- 알파 또는 베타 용혈활성을 보이는 균주만을 선별한 뒤, 후보 균주들은 각각 분리된 marine 또는 R2A 액체배지에서 1-4일 배양 후 원심분리를 통하여 충분한 양의 균체만을 순수하게 집균하였다. 집균한 후보 균주들의 균체는 protease K를 첨가한 magnetic isolation kit (TNT, Japan)의 lysis 용액을 이용하여 현탁 한 뒤 37℃에서 16-20시간 반응하여 lysis 시킨 후 핵산 추출 자동화기기(MFX-6100, TOYOBO, Japan)를 이용하여 total chromosomal DNA를 순수하게 분리하였다. 순수하게 정제한 DNA를 분광광도계로 순도 및 농도를 측정한 후, Weisburg (1991) 등의 방법을 응용하여 목적한 16S rDNA를 증폭하였다.
대상 데이터
- Marine 또는 R2A 배지를 이용하여 4개월 동안 강진만과 진해만 피조개 양식장에서 채집한 샘플로 부터 약 10,000점의 배양 가능한 미생물을 분리하였다. 6월에는 25속 118종 1,052점, 7월에는 24속 89종 700점, 8월에는 30속 109종 1,116점 그리고 9월에는 39속 141종 1,252점인 약 4,120점의 분리 미생물이 알파 또는 베타 용혈활성을 나타내었다(Table 1).
- 월별 양식장 퇴적물 환경 및 피조개 체내 미생물 다양성을 분석하기 위하여 피조개 양식장에서 각각 해저 퇴적물과 피조개를 채취하였다. 폐사 발생 빈도가 잦은 강진만 연안의 양식장내 3지점과(동경 127.
- 월별 양식장 퇴적물 환경 및 피조개 체내 미생물 다양성을 분석하기 위하여 피조개 양식장에서 각각 해저 퇴적물과 피조개를 채취하였다. 폐사 발생 빈도가 잦은 강진만 연안의 양식장내 3지점과(동경 127.9-128도, 북위 34.8-34.9도) 폐사 발생 빈도가 낮은 진해만 연안 양식장(동경 128.6-128.7도, 북위 35-35.1도)의 3지점에서 해저 퇴적물과 피조개 샘플을 6월에서 9월까지 매월 각각 채집하여 실험에 사용하였다(Kim et al., 2008a). 다양한 배지 가운데서 marine 배지(Difco, USA)와 R2A 배지(Difco, USA)의 경우 수해양 미생물을 분석에 최적 배지라고 알려져 있어 두 배지를 이용하여 퇴적물과 조개 체내에 존재하는 미생물을 분리 하였다(Difco, 1998).
- 정제된 16S rDNA를 주형으로 하여 3130XL Genetic analyzer (Applied Biotechnology, USA) DNA sequencing 기기로써 16S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 획득한 염기 서열은 BioEdit (7.0.0 version) 프로그램을 이용하여 비교, 분석 및 정리를 하였으며 그 결과를 EzTaxon (server 2.1) program (http://www.eztaxon.org/) 과 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search 를 이용한 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GeneBank database를 이용하여 서열정보가 가장 유사한 미생물들을 선정하였다(Chun et al., 2007).
성능/효과
- 1D). 21속 89종, 15속 33종의 미생물이 각각 9월 강진만 퇴적물과 피조개 샘플에서 분리되었으며, 20속 80종, 4속 15종의 미생물을 각각 진해만 양식장 해저 퇴적물과 피조개에서 확인 하였다(Table 2). 강진만 피조개 체내 미생물 균총은 8월보다 감소하였지만 6월과 7월에 비하여 높은 수준임을 알 수 있었으며, 강진만 퇴적물은 속과 종 수준에서 가장 높은 월별 미생물 다양성을 기록하였다(Table 2).
- 여름철 고수온기인 6월부터 9월까지 강진만과 진해만 피조개 양식장의 해저퇴적물과 피조개 체내에서 분리한 약 4,200여점의 배양가능 용혈성 미생물의 다양성 및 지역 특이적인 미생물을 분석하였다. 6월에 25속 118종, 7월에 24 속 89종, 8월에 30속 109종, 그리고 39속 141종의 미생물을 분리하였으며, 16S rDNA 정보를 통하여 지역별 미생물 다양성을 분석한 결과 폐사빈발 지역에서만 특이적으로 존재하는 140종의 미생물을 분리하였다. 이러한 지역 특이적 미생물 균총 연구는 피조개 대량폐사 원인 규명의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료되며 나아가 다양한 패류의 폐사연구에도 기여할 것으로 기대된다.
- 6월에는 25속 118종 1,052점, 7월에는 24속 89종 700점, 8월에는 30속 109종 1,116점 그리고 9월에는 39속 141종 1,252점인 약 4,120점의 분리 미생물이 알파 또는 베타 용혈활성을 나타내었다(Table 1). Marine 배지와 R2A 배지 모두 해양환경에 존재하는 미생물을 분석하는데 적합한 배지라고 알려져 있으나, 본 실험 결과 marine 배지에서는 균체의 생장속도가 높으나 R2A 배지에서 좀 더 많은 수의 배양이 가능한 분리균주를 얻을 수 있었으며, 용혈활성의 세기 또는 종류를 관찰한 결과 좀 더 다양한 미생물이 R2A 배지에서 획득할 수 있었다(Table 1).
- 강진만 에서만 분리되는 균주들은 Actinobacteria 강 4속 7종, Alphaproteobacteria 강 8속 8종, bacilli 강 13속 48종, Bacterioidia 강 1속 1종, Betaproteobacteria 강 5속 9종, Cytophagia 강 1속 1종, Flavobacteria 강 1속 2종 그리고 Gammaproteobacteria 강 20속 64종이이었으며, 특이하게도 강진만 에서만 분리되는 균주들 중 가장 다양한 종을 보이는 미생물은Gammparoteobacteria 와 Bacilli 문의 균주였다(Table 3). 다양한 강(phylum) 의 미생물 중에서 Bacilli 문(class)과 Gammaproteobacteria 문이 속하는 Firmicutes 강과 Proteobacteria 강이 가장 많은 종의 미생물을 포함하기 때문에 이러한 결과가 나오는 것으로 해석 되지만, 다양한 연구에서 Bacilli 문과 Gammaproteobacteria 문이 토양, 해수 또는 병원성 샘플에서 많이 존재하는 환경 미생물로 자주 보고 되고 있다(WoRMS, 2013; Conenye et al.
- 진해만 샘플을 분석한 결과 7속 16종과 2속 3종이 각각 퇴적물과 피조개의 미생물 총을 이루고 있었다(Table 2). 강진만 지역의 미생물 다양성은 6월과 비슷한 결과를 알 수 있었으나 진해만의 경우 퇴적물뿐만 아니라 피조개 체내 미생물의 다양성도 매우 낮음을 알 수 있었으며, 조사가 진행된 시기의 강진만 샘플에서 가장 낮은 다양성을 보였다(Table 2).
- 1C). 강진만 퇴적물에서는 12속 42종이, 피조개 체내에서는 16속 37종의 미생물이 존재하였으며, 진해만 양식장에서는 퇴적물 내에 17속 59종, 피조개 내에는 8속 18종을 확인하였다(Table 2). 특이하게도 8월 강진만 퇴적물 내에는 속과 종 수준에서 4개월 중 가장 낮은 수의 미생물 종이 분리되었으며, 강진만과 진해만의 피조개 체내에서 분리한 미생물의 다양성은 연구가 이루어진 월 중에서 가장 높은 다양성을 기록하였다(Table 2).
- 21속 89종, 15속 33종의 미생물이 각각 9월 강진만 퇴적물과 피조개 샘플에서 분리되었으며, 20속 80종, 4속 15종의 미생물을 각각 진해만 양식장 해저 퇴적물과 피조개에서 확인 하였다(Table 2). 강진만 피조개 체내 미생물 균총은 8월보다 감소하였지만 6월과 7월에 비하여 높은 수준임을 알 수 있었으며, 강진만 퇴적물은 속과 종 수준에서 가장 높은 월별 미생물 다양성을 기록하였다(Table 2). 이러한 현상은 진해만 지역의 샘플에서도 비슷하게 확인되어 9월이 두 지역의 미생물 다양성이 가장 풍부한 시기임을 알 수 있었다(Table 2).
- 용혈활성을 보이는 미생물의 16S rDNA 정보를 기초로 미생물 다양성을 조사하였고, 이러한 정보를 비교 및 분석하여 폐사가 빈번한 강진만 지역에서는 분리가 되었으나 폐사 빈도가 낮은 진해만 지역에서는 발견이 되지 않는 균주를 조사함으로써 피조개 대량폐사 원인 균주를 분석하고자 하였다. 그 결과 53속 140종의 미생물이 오직 강진만 지역의 퇴적물 또는 피조개 체내에서만 존재함을 알 수 있었다 (Table 3). 일부 미생물의 경우 강진만 에서만 발견되는 속의 미생물들이지만, 특이하게도 두 지역에서 공통적으로 가장 많이 발견되었던 Bacillus 속 21종, Vibrio 속 12종 그리고 Paenibacillus 속 12종에 포함되는 균주들이 강진만 에서만 존재함이 발견되었다 (Table 3).
- 1A). 두 지역 공통적으로 Bacillus 속이 42종으로 가장 많이 분리되었으며, Massilia 속(6 종), Paenibacillus 속 30 종, Photobacterium 속 6종, Vibrio 속 6종이 다수 발견 되었다(Fig. 1A). 또한 강진만 연안 피조개 양식장의 해저 퇴적물에서는 15속 83종이, 그리고 7속 20종의 미생물이 피조개 체내에서 분리되었다(Table 2).
- 8월 강진만 지역의 미생물 다양성은 조사가 이루어진 4개월 중 종 수준에서 가장 낮았으며, 진해만 미생물 다양성의 경우는 7월에 비하여 매우 증가하였다(Table 2). 두 지역 모두 Bacillus 속이 28종으로 가장 다양한 종을 기록하였으며, Paenibacillus 속 21 종, Vibrio 속 14 종, Aeromonas 속 5 종 그리고 Shewanella 속 5 종이 분리 되었다(Fig. 1C). 강진만 퇴적물에서는 12속 42종이, 피조개 체내에서는 16속 37종의 미생물이 존재하였으며, 진해만 양식장에서는 퇴적물 내에 17속 59종, 피조개 내에는 8속 18종을 확인하였다(Table 2).
- 1B). 두 지역에서 배양된 미생물들은 Bacillus 속이 27종으로 가장 다양한 종류의 미생물이 발견되었고, Paenibacillus 속 11종, Pseudomonas 속 6종 그리고 Vibrio 속 15종의 미생물 다양성을 관찰 할 수 있었다(Fig. 1B). 강진만 샘플에서는 21속 74종의 미생물이, 8속 18종의 미생물이 각각 해저 퇴적물과 피조개에서 분리 되었다(Table 2).
- 두 지역에서 분리한 미생물의 다양성을 분석한 결과, 피조개 체내에 존재하는 미생물은 매우 단순한 균총을 이루고 있으며, 양식장 해저 퇴적물에 존재하는 미생물의 군집이 훨씬 다양함을 알 수 있었다(Table 2). 조사가 진행된 4개월 동안의 모든 샘플에서 폐사가 빈번히 발생하는 강진만 지역이 훨씬 다양한 종의 미생물 군집을 형성함을 알 수 있었으며, 높은 미생물 다양성 현상과 대량폐사와의 관계는 더욱 연구가 필요하지만 높은 상관관계가 있을 것으로 사료된다.
- 두 지역의 미생물 분포 및 다양성을 16S rDNA 서열의 정보를 기반으로 분석한 결과 Bacillus 종, Paenibacillus 종 그리고 Vibrio 종은 두지역의 모든 샘플에서 매우 다양한 종이 분리되었으며, 특히 Bacillus 종은 본 연구에서 수집한 모든 샘플에서 배양 가능한 균주 중 가장 다양하고 고르게 분포하였다(Fig. 1). Bacillus 균주의 경우 많은 연구에서 토양, 해수, 해저 퇴적물, 공기 및 생물의 체내 등에 가장 다양하고 광범위하게 존재하는 미생물로 잘 알려져 있어 본 연구 결과도 이러한 보고와 같은 결과를 나타내는 것이라고 생각된다(Kim et al.
- 진해만 양식어장의 해저 퇴적물에서는 15속 62종의 미생물이 있었으며, 피조개 내에는 2속 14종의 미생물이 발견되었다(Table 2). 두 지역의 용혈활성을 보이는 미생물은 피조개 체내보다는 퇴적물에서, 그리고 진해만 보다는 폐사 빈도가 높은 강진만 지역의 샘플이 좀 더 높은 다양성을 보이는 것을 알 수 있었으며, 속(genus)의 수준에서는 비슷한 다양성을 보이더라도, 종(species)의 수준에서는그 다양성이 더욱 차이가 남을 알 수 있었다(Table 2).
- 1A). 또한 강진만 연안 피조개 양식장의 해저 퇴적물에서는 15속 83종이, 그리고 7속 20종의 미생물이 피조개 체내에서 분리되었다(Table 2). 진해만 양식어장의 해저 퇴적물에서는 15속 62종의 미생물이 있었으며, 피조개 내에는 2속 14종의 미생물이 발견되었다(Table 2).
- 특이하게도 8월 강진만 퇴적물 내에는 속과 종 수준에서 4개월 중 가장 낮은 수의 미생물 종이 분리되었으며, 강진만과 진해만의 피조개 체내에서 분리한 미생물의 다양성은 연구가 이루어진 월 중에서 가장 높은 다양성을 기록하였다(Table 2). 또한 진해만 지역의 퇴적물과 피조개체내 미생물의 다양성이 6월 수준으로 회복되었음을 알 수 있었다(Table 2).
- , 2012). 또한, 두 지역의 퇴적물과 피조개 체내에 존재하는 미생물 중 용혈 활성을 보이는 균주의 경우 주로 베타용혈 활성을 보이며, 알파용혈 활성을 보이는 균주는 매우 드물게 있었다(Table1).
- 7월에 수집한 강진만과 진해만 샘플의 경우 분석기간인 4개월 동안 샘플들 중에서 속과 종 수준에서 지역별 미생물 다양성의 차이가 가장 많이 발생한 달이였다(Table 2). 월별 미생물 다양성의 명확한 유의적 관계를 찾을 수는 없었으나, 강진만의 경우 8월 미생물 다양성이 약간 감소하지만 전체적인 다양성은 증가하는 추세이고, 진해만의 경우 7월에 감소하다가 8월과 9월동안 다양한 미생물이 나타남을알 수 있었다(Table 2). 또한 6월에서 9월사이의 두 연안지역의 미생물 균총은 9월에 가장 높은 다양성을 보였다(Table 2).
- 그 결과 53속 140종의 미생물이 오직 강진만 지역의 퇴적물 또는 피조개 체내에서만 존재함을 알 수 있었다 (Table 3). 일부 미생물의 경우 강진만 에서만 발견되는 속의 미생물들이지만, 특이하게도 두 지역에서 공통적으로 가장 많이 발견되었던 Bacillus 속 21종, Vibrio 속 12종 그리고 Paenibacillus 속 12종에 포함되는 균주들이 강진만 에서만 존재함이 발견되었다 (Table 3). 하지만 이러한 현상은 위에서 언급한 것과 같이 세 미생물이 수해양 환경에서 가장 쉽게 분리 및 배양이 가능한 미생물이기 때문에 분리된 지역 특이적인 균주가 세 가지 속(genus)에 포함됨을 뒷받침하는 결과로 사료된다(McSpadden, 2004; Lal and Tabacchioni, 2009).
- 강진만 샘플에서는 21속 74종의 미생물이, 8속 18종의 미생물이 각각 해저 퇴적물과 피조개에서 분리 되었다(Table 2). 진해만 샘플을 분석한 결과 7속 16종과 2속 3종이 각각 퇴적물과 피조개의 미생물 총을 이루고 있었다(Table 2). 강진만 지역의 미생물 다양성은 6월과 비슷한 결과를 알 수 있었으나 진해만의 경우 퇴적물뿐만 아니라 피조개 체내 미생물의 다양성도 매우 낮음을 알 수 있었으며, 조사가 진행된 시기의 강진만 샘플에서 가장 낮은 다양성을 보였다(Table 2).
- 또한 강진만 연안 피조개 양식장의 해저 퇴적물에서는 15속 83종이, 그리고 7속 20종의 미생물이 피조개 체내에서 분리되었다(Table 2). 진해만 양식어장의 해저 퇴적물에서는 15속 62종의 미생물이 있었으며, 피조개 내에는 2속 14종의 미생물이 발견되었다(Table 2). 두 지역의 용혈활성을 보이는 미생물은 피조개 체내보다는 퇴적물에서, 그리고 진해만 보다는 폐사 빈도가 높은 강진만 지역의 샘플이 좀 더 높은 다양성을 보이는 것을 알 수 있었으며, 속(genus)의 수준에서는 비슷한 다양성을 보이더라도, 종(species)의 수준에서는그 다양성이 더욱 차이가 남을 알 수 있었다(Table 2).
- 강진만 퇴적물에서는 12속 42종이, 피조개 체내에서는 16속 37종의 미생물이 존재하였으며, 진해만 양식장에서는 퇴적물 내에 17속 59종, 피조개 내에는 8속 18종을 확인하였다(Table 2). 특이하게도 8월 강진만 퇴적물 내에는 속과 종 수준에서 4개월 중 가장 낮은 수의 미생물 종이 분리되었으며, 강진만과 진해만의 피조개 체내에서 분리한 미생물의 다양성은 연구가 이루어진 월 중에서 가장 높은 다양성을 기록하였다(Table 2). 또한 진해만 지역의 퇴적물과 피조개체내 미생물의 다양성이 6월 수준으로 회복되었음을 알 수 있었다(Table 2).
후속연구
- , 2013). 그러나 4 속의 미생물 이외의 지역 특이적인 종의 균주 또한 폐사 원인균주의 후보이기 때문에 분리된 모든 지역 특이적인 균주를 이용한 병원성의 검증 및 특성 분석이 절대 필요하다.
- 최근 미생물 다양성 연구의 결과는 미생물의 16S rDNA의 정보만을 가지고서 특정 지역 미생물 군집의 다양성을 설명하기 때문에 대부분 염기서열 자료를 이용한 계통발생학상의 분류표를 이용한 균주의 분포를 설명하는 정도였다. 그러나 본 연구에서는 균주의 16S rDNA 정보와 함께 배양이 가능한 균주를 보관하고 있기 때문에 미생물의 동정, 분류 및 분석 후 미생물학적 그리고 생화학적인 분석이 가능하다. 따라서 이러한 지역적인 특이 균주를 이용한 미생물학적, 생화학적인 연구 및 감염실험과 병리학적 연구를 통하여 피조개 대량 폐사원인 균주 및 후보균주를 규명 할 수 있을 것으로 생각된다.
- 따라서 이러한 지역적인 특이 균주를 이용한 미생물학적, 생화학적인 연구 및 감염실험과 병리학적 연구를 통하여 피조개 대량 폐사원인 균주 및 후보균주를 규명 할 수 있을 것으로 생각된다. 그리고 나아가 본 연구의 미생물 정보를 이용한 패류의 대량폐사 및 질병발생과 관련한 매우 유용한 연구 자료가 될것으로 기대한다.
- , 2012). 따라서 본 연구에서 분리된 Bacillus, Paenibacillus 그리고 Vibrio 균주가 매우 다양하게 분포하는 것은 빠른 생장 속도 및 배양방법에 따른 배양 가능 균주 중에서 많은 종류의 종이 분리 되었을 뿐이며, 이러한 결과로써 두 지역의 해저 퇴적물 및 피조개 체내에서 차지하는 균총의 우점종 또는 전체적인 평가 등을 보고하기에는 좀 더 연구가 필요하다.
- 그러나 본 연구에서는 균주의 16S rDNA 정보와 함께 배양이 가능한 균주를 보관하고 있기 때문에 미생물의 동정, 분류 및 분석 후 미생물학적 그리고 생화학적인 분석이 가능하다. 따라서 이러한 지역적인 특이 균주를 이용한 미생물학적, 생화학적인 연구 및 감염실험과 병리학적 연구를 통하여 피조개 대량 폐사원인 균주 및 후보균주를 규명 할 수 있을 것으로 생각된다. 그리고 나아가 본 연구의 미생물 정보를 이용한 패류의 대량폐사 및 질병발생과 관련한 매우 유용한 연구 자료가 될것으로 기대한다.
- , 2012). 또한, 본 연구팀은 미생물 균총의 다양성조사와 함께 폐사가 자주 발생하는 강진만 연안 양식장과 폐사 빈도가 낮은 진해만 연안 양식장의 환경인자들 중 피조개의 폐사에 영향을 미칠 수 있는 해수 및 해저저층의 온도, 해수의 산소포화도, 영양염류와 염도 등을 함께 모니터링 하였으나 대량폐사 빈도에 영향을 미칠 만큼의 큰 차이를 보이는 지역 특이적인 환경요인을 찾지는 못하였다(Data not shown). 따라서 여름철 남해안 피조개 양식장에서 자주 발생하는 대량폐사 연구를 위하여 이전에 연구되지 않은 미생물학적인 관점에서 원인규명 또는 분석이 필요한 실정이다.
- 6월에 25속 118종, 7월에 24 속 89종, 8월에 30속 109종, 그리고 39속 141종의 미생물을 분리하였으며, 16S rDNA 정보를 통하여 지역별 미생물 다양성을 분석한 결과 폐사빈발 지역에서만 특이적으로 존재하는 140종의 미생물을 분리하였다. 이러한 지역 특이적 미생물 균총 연구는 피조개 대량폐사 원인 규명의 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료되며 나아가 다양한 패류의 폐사연구에도 기여할 것으로 기대된다.
- 두 지역에서 분리한 미생물의 다양성을 분석한 결과, 피조개 체내에 존재하는 미생물은 매우 단순한 균총을 이루고 있으며, 양식장 해저 퇴적물에 존재하는 미생물의 군집이 훨씬 다양함을 알 수 있었다(Table 2). 조사가 진행된 4개월 동안의 모든 샘플에서 폐사가 빈번히 발생하는 강진만 지역이 훨씬 다양한 종의 미생물 군집을 형성함을 알 수 있었으며, 높은 미생물 다양성 현상과 대량폐사와의 관계는 더욱 연구가 필요하지만 높은 상관관계가 있을 것으로 사료된다. 7월에 수집한 강진만과 진해만 샘플의 경우 분석기간인 4개월 동안 샘플들 중에서 속과 종 수준에서 지역별 미생물 다양성의 차이가 가장 많이 발생한 달이였다(Table 2).
- 세 균주의 경우는 수해양 환경에서 가장 쉽게 분리 및 배양이 가능하다고 알려져 있으며, 특히 Bacillus 속과 Paenibacillus 속의 미생물은 생장 속도가 매우 빠르기 때문에 실험균주들 사이에서 가장 우점균을 이루는 것과 같은 결과를 나타내고 있으며, 이러한 결과로 인하여 다른 난배양성 미생물에 비하여 훨씬 다양한 종이 분리가 가능했을 것으로 사료된다 (McSpadden, 2004; Lal and Tabacchioni, 2009). 최근 일부 분리균주의 정보로써 특정지역의 균총을 해석 하는 연구가 자주 보고되고 있으나 이러한 결과는 특정 지역에서 분리와 배양이 가능한 미생물의 정보 또는 다양성을 설명하는 것일 뿐 우점종을 이루는 균주 또는 총균총을 평가하고 결론을 내리기에는 좀 더 다양한 분자생물학적인 연구가 필요하다(Kim et al., 2012). 따라서 본 연구에서 분리된 Bacillus, Paenibacillus 그리고 Vibrio 균주가 매우 다양하게 분포하는 것은 빠른 생장 속도 및 배양방법에 따른 배양 가능 균주 중에서 많은 종류의 종이 분리 되었을 뿐이며, 이러한 결과로써 두 지역의 해저 퇴적물 및 피조개 체내에서 차지하는 균총의 우점종 또는 전체적인 평가 등을 보고하기에는 좀 더 연구가 필요하다.
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