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문제 정의
- 연 추출물이 당뇨 유발 동물 모델에서 공복혈당, 총콜레스테롤, 중성지방을 감소시켜 항 혈당 및 항지질 효과를 발휘한다는 연구보고가 있었고9) 연근이 비알콜성지방간과 항비만작용에 효과적이라는 결과10) 및 연잎이 고지방식이로 유발된 비만 동물에 대하여 비만 증상과 고지혈증을 개선시킨다는 점과11) 혈당강하효과12), 항산화 및 뉴런세포 보호효과13) 등에 대해서도 각각 밝혀져 있다. 발효 한약의 항염14) 및 항비만15), 항당뇨16) 작용에 대한 효과가 지속적으로 보고됨으로써 최대의 치료 효과를 얻기 위해 발효 기술이 한약에 구현되고 있는데17) 본 연구에서 또한 연근 및 연잎에 이를 적용하여 기존에 보고된 효과를 배가시키고 한약이 가지고 있는 중금속 문제, 소화 불내성의 문제, 흡수 저하에 따른 약효 저감의 문제18)에 대한 해소의 가능성을 보고자 하였다.
- . 본 실험에서 연잎-연근 혼합 발효물이 비만 억제 활성에 관여하는 biomarker 변화에 어떠한 영향을 줄 수 있는지 살펴보기 위해 중성지방을 형성하는 효소들을 조절하는 전사 인자의 변화를 관찰하였다.
- 본 연구에서는 연잎 및 연근 성분이 발효된 상태에서 지방 분화 억제 효과를 나타낼 것인지에 대한 여부를 in vitro 실험을 통해 규명하고자 하였다. 본 실험의 발효 과정에서 사용된 유산균은 Lactobacillus와 Bifidobacterium균이다.
- 본 연구에서는 연잎-연근 혼합 발효물이 지방세포 분화 억제에 미치는 영향에 대해 연구하기 위해서 연잎-연근 혼합 추출물을 4가지 주요 유산균으로 각각 발효시킨 후 3T3-L1 전지방세포의 분화 억제 활성과 CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα)와 peroxisome proliferators-activated receptor γ (PPARγ)의 유전자 발현 억제 작용을 관찰하였다.
- 이들 유산균은 당류를 발효하여 유산을 생성하며 체내 유익균을 생성하는 것이 특징이다25). 이들 자체만으로 체내 유익균의 성장을 촉진하고 체내 콜레스테롤 흡수를 저해하는 효과 등의 다양한 생리조절 작용이 우수하다고 알려져 있는데 이들이 연잎 및 연근과 발효되었을 때 어떠한 부가적인 효과를 나타내는지 관찰해 보고자 하였다.
제안 방법
- 2~3일에 한 번씩 신선한 배지로 보충하면서 세포분화가 최대에 도달했을 때 세포를 DMEM 배지에서 분리하여 다른 DMEM 배지로 이동시켜서 약물처치 없이 그대로 두거나 (DMEM군), DM 배지(differential medium, DMEM에 0.5 mM 3-isobutyle-1-methylxanthine [IBMX], 0.25 mM dexamethasone, 10 μg/ml insulin, 10% FBS, 100 unit/ml penicillin와 100 μg/ml streptomycin이 첨가된 분화배지)로 이동시켜서 여기에 발효된 연잎-연근 추출물과 발효하지 않은 연잎-연근 추출물을 Oil red O 실험에 사용하였다.
- 4 phosphate buffer saline (PBS)로 세척하고 10% formalin 용액으로 2시간 동안 고정한 후 60% isopropanol로 세척하였다. Microscope (Olympus BX61; Olympus, Tokyo, Japan)로 관찰한 후, Olympus DP70 digital camera (Olympus)로 캡처하였다.
- Resultant protein band의 강도는 densitometry로 측정하였고, 단백질의 정량은 β-actin을 참고로 하여 분석하였다.
- Reverse transcription PCR (RT-PCR) 샘플은 Light Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Applied Science, Indianapolis, ID, USA)을 이용하여 최종 반응 용량을 20 μl로 하여 LightCycler instrument (Roche Applied Science)에서 진행하였다.
- 데이터는 LightCycler Software (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)로 분석하였다. 각각의 분석에서 cDNA 대신 물을 음성 대조군으로 사용하여 발생 가능한 primer-dimer 형성을 체크하였다. 유전자의 전사레벨은 GAPDH를 기준으로 삼아 2-ΔCt (목표한 유전자의 threshold 값－GAPDH의 threshold 값)를 구하는 방식으로 계산되었고, 유전자의 발현량은 differentiation media만 처리한 대조군을 1.
- 각각의 실험 약물군에서 얻어진 2 μg의 RNA는 cDNA synthesis kit (Sprint RT Complete Oligo-(dT)18; Clontech, Mountain View, CA, USA)를 이용해 역전사하여 first strand cDNA를 얻었다.
- 세척 후, horseradish peroxidase-conjugated goat anti-Rabbit IgG (Thermo Scientific)을 2차 항체로 하여 배양하였다. 그 후 electrochemiluminescence (ECL)으로 처리하여 image reader (LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 분석하였다. Resultant protein band의 강도는 densitometry로 측정하였고, 단백질의 정량은 β-actin을 참고로 하여 분석하였다.
- 연근 2%와 연잎 2% 분말에 5.5% (w/v) 농도의 MRS powder를 첨가하였고 배지에 0.05% (w/v)의 L-cystein이 공급되어 발효에 필요한 균주가 선택적으로 잘 배양될 수 있도록 하였다. 혼합 용액은 초음파 처리하여 입자들을 고루 분산시킨 후 지속적인 흔들림을 주면서 항온수조에서 70℃ 조건하에 3시간 동안 처리하였다.
- 연잎-연근 혼합 발효물을 처리한 후 Real time PCR을 이용하여 분화된 지방전구세포에서 PPARγ의 단백질 발현 정도를 분석하였다.
- 연잎-연근 혼합 발효물의 지방세포 분화 억제 효과를 조사하기 위하여 Oil red O 염색을 시행하였고 광학현미경 하에서 세포의 분화 양상을 관찰하였다. 발효를 거친 연잎-연근 추출물은 약물처치를 하지 않은 DM군과 발효하지 않은 혼합물군에 비하여 염색된 지방구(lipid droplet) 수가 감소한 것으로 보아 지방량이 축적되는 정도가 감소되었다는 것을 알 수 있었다.
- 연잎-연근 혼합 발효물의 지방축적 감소 및 혈중지질대사의 분자생물학적 기전을 규명하기 위해서 연잎-연근 혼합 발효물을 처리한 후 real time PCR을 이용하여 분화된 지방전구세포에서 C/EBPα의 mRNA의 단백질 발현 정도를 분석하였다.
- 연잎-연근 혼합 발효물이 3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정에 어떻게 작용하는지 확인하기 위하여 Oil red O 염색액을 이용하여 3T3-L1 세포 내에 생성된 지방구를 염색한 후 그 변화를 현미경으로 관찰하였다.
- 유전자의 전사레벨은 GAPDH를 기준으로 삼아 2-ΔCt (목표한 유전자의 threshold 값－GAPDH의 threshold 값)를 구하는 방식으로 계산되었고, 유전자의 발현량은 differentiation media만 처리한 대조군을 1.0으로 간주하여 상대적인 값을 측정하였다.
- 이 상태로 4일간 배양 후 배지를 제거하고 동일한 처치를 반복하였다. 추가로 3일을 더 배양한 후 Oil red O 염색 혹은 real time PCR, Western blotting을 시행하였다.
대상 데이터
- PCR amplification은 C/EBPα에서 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 50 cycle의 amplification (95℃에서 10초간 denaturation, 52℃에서 10초간 annealing, 72℃에서 15초간 extension)하였고 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)에서는 95℃에서 10분 동안 prior incubation 후, 35 cycle의 amplification (95℃에서 10초간 denaturation, 52℃에서 10초간 annealing, 72℃에서 15초간 extension)하였다. 데이터는 LightCycler Software (Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)로 분석하였다. 각각의 분석에서 cDNA 대신 물을 음성 대조군으로 사용하여 발생 가능한 primer-dimer 형성을 체크하였다.
- 마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였고, 세포배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen, Grand Island, NY, USA)과 100 unit/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA)이 함유된 DMEM (Invitrogen) 배지를 사용하였다.
- 마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였고, 세포배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen, Grand Island, NY, USA)과 100 unit/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA)이 함유된 DMEM (Invitrogen) 배지를 사용하였다. 발효에 사용된 4종류의 유산균(Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum)은 Cellbiotech (Gimpo, Korea)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용한 약재는 인천광역시 강화군 선원면에 위치한 선원사 좋은 연 식품에서 선별된 하엽(연잎)과 우절(연근)을 정선하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 연잎 및 연근 성분이 발효된 상태에서 지방 분화 억제 효과를 나타낼 것인지에 대한 여부를 in vitro 실험을 통해 규명하고자 하였다. 본 실험의 발효 과정에서 사용된 유산균은 Lactobacillus와 Bifidobacterium균이다. 이들 유산균은 당류를 발효하여 유산을 생성하며 체내 유익균을 생성하는 것이 특징이다25).
데이터처리
- 실험결과는 평균값±표준오차(mean±standard error)로 표시하였고 SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용한 one-way ANOVA로 각 실험군 간의 통계적 분석을 시행하였으며 Bonferroni 사후검정을 실시하였다.
이론/모형
- 3. 지방세포의 분화에 관여하고 인슐린 저항성을 조절하는 또 다른 전사인자인 PPARγ의 유전자 발현 정도는 Western blot 방법으로 관찰하였는데 대조군에 비해 Bifidobacterium breve와 Bifidobacterium longum의 PPARγ 발현 억제 효과가 통계적으로 유의하게 나타났다. 군간 비교에서 Bifidobacterium breve가 다른 군과 비교했을 때 가장 높은 억제율을 나타냈다.
- PPARγ의 유전자 발현 정도는 Western blot방법으로 관찰하였고 이에 대한 결과는 Fig. 3에 나타내었다.
성능/효과
- 1. 연잎-연근 추출물을 4가지 유산균으로 발효시킨 후 Oil red O 염색법으로 지방세포 분화 억제 여부를 관찰한 결과, 발효 전 연잎-연근 추출물보다 염색된 지방구의 수가 감소하고 지질 세포의 이중층막의 형태가 분해된 것으로 미루어 볼 때, 발효된 연의 지방세포 분화 억제 효과를 짐작할수 있다.
- 2. 지방세포의 분화에 관여하는 전사인자의 변화를 관찰하기 위해 C/EBPα 유전자의 발현 정도를 real time PCR법을 이용해서 관찰하였는데 연잎-연근 혼합 발효물은 대조군 및 발효하지 않은 연 추출물 군과 비교했을 때 각각의 유산균 별로 지방세포 분화 억제 효과가 유의성있게 나타났으며 군간비교를 통해 그 중 Bifidobacterium breve로 발효된 연 추출물의 C/EBPα 발현 억제 효과의 유의성이 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.
- 3. 지방세포의 분화에 관여하고 인슐린 저항성을 조절하는 또 다른 전사인자인 PPARγ의 유전자 발현 정도는 Western blot 방법으로 관찰하였는데 대조군에 비해 Bifidobacterium breve와 Bifidobacterium longum의 PPARγ 발현 억제 효과가 통계적으로 유의하게 나타났다. 군간 비교에서 Bifidobacterium breve가 다른 군과 비교했을 때 가장 높은 억제율을 나타냈다.
- 3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정에서 어떠한 변화가 나타났는지 Oil red O 염색을 확인한 결과, 발효하지 않은 연잎-연근 추출물에 비해서 전체적으로 발효된 혼합물의 지방구 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서는 Bifidobacterium longum과 Lactobacillus plantarum에서 가장 뚜렷한 감소를 확인할 수 있었다(Fig.
- C/EBPα의 유전자 발현 정도는 real time PCR 방법으로 관찰하였는데 4종류의 유산균으로 발효한 군 모두 대조군과 발효하지 않은 연 추출물 군과 비교했을 때 유의성 있는 억제 효과가 나타났다. 4개의 발효군은 발효하지 않은 군에 비하여 각각 Lactobacillus plantarum 24%, Lactobacillus rhamnosus 26%, Bifidobacterium breve 33%, Bifidobacterium longum 30%의 감소 차이를 보였으며 그 중 Bifidobacterium breve가 실험군 간의 비교에서 가장 높은 통계적 유의성(P＜0.05)을 나타내었기에 가장 많은 활성 억제를 야기한 것으로 확인되었다.
- C/EBPα의 유전자 발현 정도는 real time PCR 방법으로 관찰하였는데 4종류의 유산균으로 발효한 군 모두 대조군과 발효하지 않은 연 추출물 군과 비교했을 때 유의성 있는 억제 효과가 나타났다.
- 각 군에서 나타나는 단백질 발현량을 정량화하여 분석한 결과, 발효되지 않은 연 추출물 군에 비해 발효된 상태의 혼합물 중 Bifidobacterium breve와 Bifidobacterium longum으로 발효된 군의 억제 효과가 각각 22%, 13%로 나타났으며 군간 비교에서 다른 균들에 비해 높은 유의성(P＜0.05)을 나타내었기에 PPARγ의 발현을 억제하는 데 있어 이 두 가지 균의 효과가 가장 좋은 것으로 관찰되었다.
- 군간비교를 통해 Bifidobacterium breve로 발효된 연 추출물의 C/EBPα 발현 억제 효과가 가장 높은 유의성을 나타냈다.
- 발효하지 않은 연잎-연근 혼합 발효물은 지방구가 비교적 규칙적으로 분포되어 있고 지방량이 많은 반면, 유산균으로 발효된 각각의 혼합물은 지방구가 부서진 상태로 형태가 불규칙적이고 세포 분화량이 적게 나타났다. 그 중 특히 Lactobacillus plantarum으로 발효된 군에서 지방세포의 지질층 형태가 가장 많이 변화하였고 불규칙적인 분화상태를 보이고 있다는 것이 관찰되었다. 즉, Lactobacillus plantarum이 고지방식이로 유발된 비만 동물 모델에서 지방세포의 크기를 유의하게 감소시키는 효과가 있다는 연구 결과26)를 바탕으로 지방세포 분화 억제 효과가 우수할 것이라고 예측해 볼 수 있다.
- 3T3-L1 세포가 전지방세포에서 지방세포로 분화되는 과정에서 어떠한 변화가 나타났는지 Oil red O 염색을 확인한 결과, 발효하지 않은 연잎-연근 추출물에 비해서 전체적으로 발효된 혼합물의 지방구 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서는 Bifidobacterium longum과 Lactobacillus plantarum에서 가장 뚜렷한 감소를 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 2에 나타내었다. 대조군(0.00651)에 비해 발효 전 연잎-연근 혼합 추출물군(0.00733)은 발현 억제 효과가 없는 것으로 나타나는데 반해 발효된 연잎-연근 추출물은 대조군에 비해서 각각의 유산균 별로 억제 효과가 유의성 있게 나타났다(Lactobacillus plantarum 0.00559, Lactobacillus rhamnosus: 0.00540, Bifidobacterium breve 0.00490, Bifidobacterium longum 0.00516). 군간비교를 통해 Bifidobacterium breve로 발효된 연 추출물의 C/EBPα 발현 억제 효과가 가장 높은 유의성을 나타냈다.
- 연잎-연근 혼합 발효물의 지방세포 분화 억제 효과를 조사하기 위하여 Oil red O 염색을 시행하였고 광학현미경 하에서 세포의 분화 양상을 관찰하였다. 발효를 거친 연잎-연근 추출물은 약물처치를 하지 않은 DM군과 발효하지 않은 혼합물군에 비하여 염색된 지방구(lipid droplet) 수가 감소한 것으로 보아 지방량이 축적되는 정도가 감소되었다는 것을 알 수 있었다. 발효하지 않은 연잎-연근 혼합 발효물은 지방구가 비교적 규칙적으로 분포되어 있고 지방량이 많은 반면, 유산균으로 발효된 각각의 혼합물은 지방구가 부서진 상태로 형태가 불규칙적이고 세포 분화량이 적게 나타났다.
- 발효를 거친 연잎-연근 추출물은 약물처치를 하지 않은 DM군과 발효하지 않은 혼합물군에 비하여 염색된 지방구(lipid droplet) 수가 감소한 것으로 보아 지방량이 축적되는 정도가 감소되었다는 것을 알 수 있었다. 발효하지 않은 연잎-연근 혼합 발효물은 지방구가 비교적 규칙적으로 분포되어 있고 지방량이 많은 반면, 유산균으로 발효된 각각의 혼합물은 지방구가 부서진 상태로 형태가 불규칙적이고 세포 분화량이 적게 나타났다. 그 중 특히 Lactobacillus plantarum으로 발효된 군에서 지방세포의 지질층 형태가 가장 많이 변화하였고 불규칙적인 분화상태를 보이고 있다는 것이 관찰되었다.
- 본 연구에서는 연잎-연근 혼합 발효물이 3T3-L1 전지방세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제하고 지방세포 분화와 관련된 전사인자의 활성을 억제함으로서 전당뇨 및 고지혈증 치료에 대한 활용 가능성을 확인할 수 있었다. 추후에는 지방세포의 활성을 억제시키는 경로뿐만 아니라 인슐린과 혈중 지질 조절의 작용에 관여하는 다양한 반응 경로에 대한 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 보인다.
- 정량적으로 분석했을 때 대조군(0.01758)에 비해 Bifidobacterium breve (0.01371)와 Bifidobacterium longum (0.01531)이 PPARγ의 억제 효과가 통계적으로 유의하게 나타났으며 그중 Bifidobacterium breve의 억제효과가 군간비교를 통해 가장 높은 유의성을 나타냈다.
후속연구
- PPARγ가 인슐린 촉진 포도당 흡수를 증가시키는 동시에 지방 분화를 촉진하는 역할을 하기 때문에38) 연과 유산균을 이용한 발효제재가 혈당 증감제의 역할을 하여 상승된 인슐린 농도를 저하시켜서 당대사를 개선하는 효과뿐만 아니라 혈중 지질대사를 정상화하여 전반적인 대사기능을 원활하게 하는 약재로 활용될 수 있을 것으로 보인다.
- PPARγ가 인슐린 촉진 포도당 흡수를 증가시키는 동시에 지방 분화를 촉진하는 역할을 하기 때문에38) 연과 유산균을 이용한 발효제재가 혈당 증감제의 역할을 하여 상승된 인슐린 농도를 저하시켜서 당대사를 개선하는 효과뿐만 아니라 혈중 지질대사를 정상화하여 전반적인 대사기능을 원활하게 하는 약재로 활용될 수 있을 것으로 보인다. 그러므로 비만으로부터 비롯된 전당뇨, 고지혈증 등의 대사증후군 치료를 위한 발효 연 추출물의 향후 개발 가능성은 높을것으로 사료된다.
- 추후에는 지방세포의 활성을 억제시키는 경로뿐만 아니라 인슐린과 혈중 지질 조절의 작용에 관여하는 다양한 반응 경로에 대한 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 보인다. 본 연구에서 이용된 발효물질의 보급 및 상품화를 추진하기 위해서는 유산균과 연 사이에 발생되는 발효 효과의 안전성 및 추가적인 약성을 더욱 구체적으로 규명할 수 있는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 연잎-연근 혼합 발효물이 3T3-L1 전지방세포가 지방세포로 분화되는 것을 억제하고 지방세포 분화와 관련된 전사인자의 활성을 억제함으로서 전당뇨 및 고지혈증 치료에 대한 활용 가능성을 확인할 수 있었다. 추후에는 지방세포의 활성을 억제시키는 경로뿐만 아니라 인슐린과 혈중 지질 조절의 작용에 관여하는 다양한 반응 경로에 대한 연구가 추가적으로 진행되어야 할 것으로 보인다. 본 연구에서 이용된 발효물질의 보급 및 상품화를 추진하기 위해서는 유산균과 연 사이에 발생되는 발효 효과의 안전성 및 추가적인 약성을 더욱 구체적으로 규명할 수 있는 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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