환경스트레스 저항성 오이 형질전환체 생산을 위해서 오이 "Eunsung" 품종의 자엽절 절편을 Nit유전자를 포함하는 pPZP211와 pCAMBIA2300 발현벡터로 각각 형질전환된 Agrobacterium과 공동 배양하였다. 공동배양 후 형질전환체 선발, 형질전환체 유도, 신장, 유식물체 생산 등은 자엽절 절편을 이용하는 CTM방법(Jang et al. 2011)에 따라 수행하였다. 발현벡터에 따라 선발배지에 100 mg/L paromomycin을 첨가하여 선발과정을 거쳤으며, 선발배지에서 3 cm크기의 shoot를 유도한 후 PCR, Southern, RT-PCR 및 Northern분석을 통해 형질전환 여부를 확인하였다. 공동배양 한 2,547개의 자엽절 절편으로부터 105개체(4.12%)가 선발배지로부터 얻어졌으며, 그들 중 45개체(1.77%)만이 Nit유전자의 PCR product를 얻을 수 있었다. 오이 genome에 Nit유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 45개체에 대한 Southern분석을 수행한 결과 각각 39개체(1.53%)서 확인할 수 있었으며, 이중 오직 6개체(0.24%)에서만 Nit유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 RT-PCR과 Northern분석을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 Nit유전자가 오이 genome에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 보여 주고 있음을 알 수 있었다.
환경스트레스 저항성 오이 형질전환체 생산을 위해서 오이 "Eunsung" 품종의 자엽절 절편을 Nit유전자를 포함하는 pPZP211와 pCAMBIA2300 발현벡터로 각각 형질전환된 Agrobacterium과 공동 배양하였다. 공동배양 후 형질전환체 선발, 형질전환체 유도, 신장, 유식물체 생산 등은 자엽절 절편을 이용하는 CTM방법(Jang et al. 2011)에 따라 수행하였다. 발현벡터에 따라 선발배지에 100 mg/L paromomycin을 첨가하여 선발과정을 거쳤으며, 선발배지에서 3 cm크기의 shoot를 유도한 후 PCR, Southern, RT-PCR 및 Northern분석을 통해 형질전환 여부를 확인하였다. 공동배양 한 2,547개의 자엽절 절편으로부터 105개체(4.12%)가 선발배지로부터 얻어졌으며, 그들 중 45개체(1.77%)만이 Nit유전자의 PCR product를 얻을 수 있었다. 오이 genome에 Nit유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 45개체에 대한 Southern분석을 수행한 결과 각각 39개체(1.53%)서 확인할 수 있었으며, 이중 오직 6개체(0.24%)에서만 Nit유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 RT-PCR과 Northern분석을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 Nit유전자가 오이 genome에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 보여 주고 있음을 알 수 있었다.
To produce transgenic cucumber expressing Nit gene coffering abiotic resistance, the cotyledonary-node explants of cucumber (cv. Eunsung) were inoculated with A. tumefaciens transformed with pPZP211 or pCAMBIA2300 carrying Nit gene, that has cis-acting element involved in resistance to various abiot...
To produce transgenic cucumber expressing Nit gene coffering abiotic resistance, the cotyledonary-node explants of cucumber (cv. Eunsung) were inoculated with A. tumefaciens transformed with pPZP211 or pCAMBIA2300 carrying Nit gene, that has cis-acting element involved in resistance to various abiotic environmental stresses. After co-cultivation, the procedures of selection, shoot initiation, shoot elongation, and plant regeneration were followed by cotyledonary-node transformation method (CTM, Jang et al. 2011). The putative transgenic plants were selected when shoots were grown to a length greater than 3 cm from the cotyledonary-node explants on selection medium supplemented with 100 mg/L paromomycin as a selectable agent. The confirmation of transgenic cucumber was based on the genomic PCR, Southern blot analysis, RT-PCR, and Northern blot analysis. A 105 shoots (4.12%) selected from the selection mediums were obtained from 2,547 explants inoculated. Of them, putative transgenic plants were only confirmed with 45 plants (1.77%) by genomic PCR analysis. Transgenic plants showed that the Nit genes integrated into each genome of 39 plants (1.53%) by Southern blot analysis, and the expression of gene integrated into cucumber genome was only confirmed at 6 plants (0.24%) by RT-PCR and Northern blot analysis. These results lead us to speculate that the genes were successfully integrated and expressed in each genome of transgenic cucumber.
To produce transgenic cucumber expressing Nit gene coffering abiotic resistance, the cotyledonary-node explants of cucumber (cv. Eunsung) were inoculated with A. tumefaciens transformed with pPZP211 or pCAMBIA2300 carrying Nit gene, that has cis-acting element involved in resistance to various abiotic environmental stresses. After co-cultivation, the procedures of selection, shoot initiation, shoot elongation, and plant regeneration were followed by cotyledonary-node transformation method (CTM, Jang et al. 2011). The putative transgenic plants were selected when shoots were grown to a length greater than 3 cm from the cotyledonary-node explants on selection medium supplemented with 100 mg/L paromomycin as a selectable agent. The confirmation of transgenic cucumber was based on the genomic PCR, Southern blot analysis, RT-PCR, and Northern blot analysis. A 105 shoots (4.12%) selected from the selection mediums were obtained from 2,547 explants inoculated. Of them, putative transgenic plants were only confirmed with 45 plants (1.77%) by genomic PCR analysis. Transgenic plants showed that the Nit genes integrated into each genome of 39 plants (1.53%) by Southern blot analysis, and the expression of gene integrated into cucumber genome was only confirmed at 6 plants (0.24%) by RT-PCR and Northern blot analysis. These results lead us to speculate that the genes were successfully integrated and expressed in each genome of transgenic cucumber.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 애기장대로부터 유래한 저온 및 건조 스트레스에 내성을 갖는 Nit유전자를 안정적 오이형질전환방법, 즉 자엽절 절편을 이용한 형질전환 방법(CTM, Jang et al. 2011)으로 오이 형질전환체를 개발 하였기에 보고 하고자 한다.
이론/모형
PCR분석을 위하여 Nit (Forward: 5’-CTACAAGGACCCATCACC-3’, Reverse: 5’-GGTGAGAGGGAAGAGGAT-3’(305 bp)의 특정 염기서열을 primer로 사용하였다. PCR분석에서 확인된 오이식물체를 대상으로 Nit유전자의 도입 여부를 확인하기 위하여 Southern분석을 실시하였으며, 또한 RT-PCR과 Northern분석을 통해 도입 유전자의 발현을 확인하였다. Southern분석을 수행하기 위해서 온실에서 50 cm이상 자란 성숙한 식물체로부터 어린 잎 조직을 취하여 genomic DNA를 추출하였다(Dellaporta et al.
2011)에 6개씩 치상 하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 자엽절 절편으로부터 초기 2주 동안에 유도된 부정아의 제거, 항생제 저항성 부정아 유도, 부정아로부터 부정근 유도 및 유식물체 순화 등 모든 실험방법 및 배지 조성은 Jang 등(2011)의 방법에 따라 수행하였다. 형질전환체를 선발하기 위하여 배지에 100 mg/L paromomycin을 첨가하여 선발배지로 사용하였으며, 모든 배지는 8 g/L Phyto-agar를 첨가하기 전 pH를 조정하여 121℃, 1.
성능/효과
pCAMBIA2300-Nit 발현벡터의 경우 공동 배양한 자엽절절편(1,312개)으로부터 27개(2.06%)의 paromomycin 저항성 유식물체를 얻을 수 있었으며, 이중 11개체(0.84%)에서 genomic PCR분석으로 통해 Nit PCR product (305 bp)를 검출할 수 있었다(Fig. 3A).
3A). 또한 PCR product를 검출한 paromomycin 저항성 식물체를 대상으로 Southern분석을 수행한 결과 9개체(0.68%) genome에서 Nit유전자가 안정적으로 도입되어 있음을 확인하였고, 이중 6개체(0.46%)에서 Nit유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 RT-PCR과 Northern blot 분석을 통해 확인하였다. 반면 pPZP211-Nit 발현벡터의 경우 접종된 자엽절 절편 1,235개로부터 78개체(6.
2005)를 이용하기도 한다. 본 연구에서는 가장 최근 보고된 자엽절 절편으로부터 기관발생과 선발마커로서 nptII유전자를 이용하여 형질전환체를 생산하기 위하여 국내 오이품종인 “Eunsung” 유식물체의 자엽절 부위를 공동배양 한 후 선발배지에서 2주 간격으로 6주 동안 계대배양하였고, 그 기간 동안에 자엽절 절편으로부터 발생하는 모든 부정아를 제거 함으로서 chimeric가능성을 줄였다. 배양 8주째부터는 완전히 새롭고 빠르게 생장하는 2 ~ 3 mm 크기의 진한 녹색을 띄는 부정아 원기를 선발하여 신장배지에 옮겨 putative shoots를 유도하였다.
이와 같이 Nit유전자의 경우 발현벡터에 따라 오이 genome으로의 안정적 도입 빈도는 발현벡터에 따라 0.68 ~ 2.42%(Southern분석 기준)로 큰 차이를 보였고, Nit유전자가 안정적으로 도입되었다 할 지라도 발현은 다른 양상을 보였다. 특히 pCAMBIA2300 발현벡터로 형질전환된 9개체 중에서 오직 6개체에서만 발현되는 것으로 나타나 육종 소재로 이용할 형질전환개체로 선정하기 위해서는 도입 유전자의 안정적 발현 여부를 확인하는 것이 필수적임을 보여 주었다(Fig.
42%(Southern분석 기준)로 큰 차이를 보였고, Nit유전자가 안정적으로 도입되었다 할 지라도 발현은 다른 양상을 보였다. 특히 pCAMBIA2300 발현벡터로 형질전환된 9개체 중에서 오직 6개체에서만 발현되는 것으로 나타나 육종 소재로 이용할 형질전환개체로 선정하기 위해서는 도입 유전자의 안정적 발현 여부를 확인하는 것이 필수적임을 보여 주었다(Fig. 3B).
후속연구
31%)에 비해 훨씬 낮은 것으로 나타났으나 도입유전자의 발현은 오히려 EHA105/ pCAMBIA2300-Nit 발현벡터에 의해 생산된 개체에서만 확인 됨으로써 벡터와 유전자의 도입빈도와 안정적 발현이 달라질 수 있음을 보여주었다. 이와 같이 본 연구를 통해서 개발된 Nit유전자 도입 및 발현 개체(6개체)는 향후 수정을 통해 T1종자를 확보한 후 후대에서도 발현여부를 조사할 필요가 있으며, 이중 안정적으로 발현되는 개체를 대상으로 저온 및 건조 조건에서 내성 정도를 확인하여 오이 새로운 품종 육성을 위한 소재로 이용하는데 사용할 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
애기장대 Nit 유전자 발현 오이 형질전환체 개발 연구재료의 처리 과정은?
국내 오이 품종 중 재분화 능이 높은 오이(cv. Eunsung) 종자(Cho et al. 2005)를 70% 알코올에 1분간, 2% sodium hypochlorite용액에 15분간 표면 살균 하였다. 2% sucrose가 첨가된 MS기본 고체배지(Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상 하고 25℃ 암 상태에서 7 ~ 8일 동안 발아시켰다. 발아된 오이 유식물체로부터 자엽과 자엽 사이를 종단으로 절단한 후 해부현미경하에서 자엽 사이에 있는 유경 조직을 제거하여 Agrobacterium과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다(Jang et al. 2011).
식물의 발아, 생장, 발달, 생산성에 크게 영향을 미치는 원인은?
식물은 비생물학적(Abiotic) 환경스트레스에 지속적으로 노출되어 있어 식물의 발아, 생장, 발달, 생산성에 크게 영향을 미치고(Boyer, 1982), 특히 저온 스트레스를 받을 경우 잎의 신장 감소, 시듦, 황백화 현상을 동반하여 조직의 괴사 원인이 되기도 한다(Guy 1990). 이는 저온 스트레스에 의한 세포의 신호 전달 수용체를 통하여 세포 내로 전달되는 phospholipase C (PLC)를 활성화시켜 전사인자 유전자(CBF, DRE)가 발현됨으로서 다양한 스트레스에 대한 내성을 갖게 한다(Ma et al.
오이의 특징은?
오이는 미국, 아시아 및 유럽을 중심으로 열대와 아열대 지방에서 재배되는 주요 박과 작물로 식용과 피부 미용에 이용되는 중요한 경제 작물이며, 생육온도에 매우 민감하여 주간에는 25 ~ 28℃, 야간에는 14 ~ 15℃정도를 유지해야 해야 하므로 동절기에는 주로 온실재배와 함께 난방시스템이 필요하다. 최근 Agrobacterium 공동배양법을 이용한 유용 유전자 도입 기술은 오이 신품종 개발에 대한 가능성을 제시 하였고(Gaba et al.
참고문헌 (20)
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