[논문]Agrobacterium에 의한 오이 형질전환에서 자엽절 절편의 이용

장현아; 김현아; 권석윤; 최동욱; 최필선

doi:10.5010/jpb.2011.38.3.198

Agrobacterium에 의한 오이 형질전환에서 자엽절 절편의 이용
The use of cotyledonary-node explants in Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of cucumber (Cucumis sativus L.) 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.38 no.3, 2011년, pp.198 - 202

장현아 (남부대학교 약용식물형질전환연구소) , 김현아 (한국생명공학연구원) , 권석윤 (한국생명공학연구원) , 최동욱 (전남대학교 생물교육과) , 최필선 (남부대학교 약용식물형질전환연구소)

초록
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Agrobacterium과 자엽절 절편 공동배양으로 오이 형질전환체를 생산하였다. 오이 자엽절 절편 (c.v. Eunsung)은 선발 마커로서 nptII유전자와 유용유전자로서 DQ유전자가 포함된 pPZP211를 EHA101에 형질전환하여 공동 배양하였다. 3회 반복실험으로부터 평균 형질전환 빈도는 4.01%를, 최대 빈도는 5.97%를 보여 주었다. Paromomycin항생제 저항성을 갖는 9개의 식물체를 선발과정을 통해 얻었으며, Southern blot 분석에 의해 6개 식물체의 genome에 nptII유전자자 안정적으로 도입되어 있음을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Agrobacterium tumefaciens-mediated cotyledonary-node explants transformation was used to produce transgenic cucumber. Cotyledonary-node explants of cucumber (Cucumis sativus L. cv., Eunsung) were co-cultivated with Agrobacterium strains (EHA101) containing the binary vector (pPZP211) carrying with CaMV 35S promoter-nptII gene as selectable marker gene and 35S promoter-DQ gene (unpublished data) as target gene. The average of transformation efficiency (4.01%) was obtained from three times experiments and the maximum efficiency was shown at 5.97%. A total of 9 putative transgenic plants resistant to paromomycin were produced from the cultures of cotyledonary-node explants on selection medium. Among them, 6 transgenic plants showed that the nptII gene integrated into each genome of cucumber by Southern blot analysis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 연구팀이 이미 확보하고 있는 대두와 멜론의 자엽절 절편 공동배양법 (Cho et al. 2005b) 을 국내 재배 품종인 “Eunsung” 오이 품종에 적용하여 오이의 자엽절 절편공동배양법에 의한 형질전환방법을 확립하고자 수행하였다.

가설 설정

B,C: The explants on selection medium supplemented with 100mg/L paromomycin for first 2 weeks. D: The explants with only node region on selection medium after removing axillary bud. E: Shoots induced from the node explants.
F: Elongated shoots on elonga-tion medium. G: Putative transgenic shoots on root induction medium. H: Plants in greenhouse.
G: Putative transgenic shoots on root induction medium. H: Plants in greenhouse. I: Plants growing until maturity.
H: Plants in greenhouse. I: Plants growing until maturity. J: Harvested fruit (T₁)

제안 방법

, Eunsung) 종자를 70% 알코올에 1분간, 2% sodium hypochlorite용액에 15분간 표면 살균 하였다. 2% sucrose가 첨가된 MS기본 고체배지 (Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상 하고 25℃ 암 상태에서 7 - 8일 동안 발아시켰다. 발아된 오이 유식물체로부터 자엽과 자엽 사이를 종단으로 절단한 후 해부현미경하에서 자엽 사이에 있는 유경 조직을 제거하여 Agro-bacterium과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.
8% agarose 겔에 전기영동 하였다. Agarose 겔 상의 DNA 밴드를 Zeta^R Probe nylon membrane (Bio-Rad,catalog #162-0196)에 옮겨 ³²P-dCTP (Stratagene, catalog#300385)로 labelling한 약700 bp nptII probe로 65℃에서 hybridization하여 Southern분석을 실시하였다 (Southern 1975).
Agrobacterium과 자엽절 절편 공동배양으로 오이 형질전환체를 생산하였다. 오이 자엽절 절편 (c.
국내 오이 품종 중 재분화 능이 높은 (Cho et al. 2005a) 오이 (cv., Eunsung) 종자를 70% 알코올에 1분간, 2% sodium hypochlorite용액에 15분간 표면 살균 하였다. 2% sucrose가 첨가된 MS기본 고체배지 (Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상 하고 25℃ 암 상태에서 7 - 8일 동안 발아시켰다.
공동배양 후 자엽절 절편으로부터 초기 2주 동안에 유도된 부정아의 제거, 항생제 저항성 부정아 유도, 부정아로 부터 부정근 유도 및 유식물체 순화 등의 실험방법과 모든 배지 조성은 Cho 등 (2005a,b)의 방법에 따라 수행하였다. 선발배지에 100 mg/L paromomycin 항생제를 첨가하였으며, 모든 배지는 8 g/L Phyto-agar를 첨가하기 전 pH를 조정하여 121℃, 1.2기압에서 15분간 고압 멸균 하였다. 배지는 90 × 15 mm 플라스틱 페트리디쉬에 25 ml씩 분주하여 사용하였다.
배양은 24℃로 조절되는 배양실에서 광도 46 μ mol m^-2s^-1의 16시간 광주기에서 배양 하였다. 선발배지에서 얻은 유식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 순화 하였으며, 크기가 50 cm이상 자란 유식물체를 대상으로 분자수준의 분석을 실시하였다.
2G). 신장된 부정아를 부정근 유도배지에서 뿌리를 유도한 후 토양에 옮겨 순화시켰으며 (Fig. 2H), 온실에서 건강하게 자라는 오이의 암술과 수술을 이용하여 인공 수정 후 후대 종자를 수확하였다 (Fig. 2I, J).
약 10 μg의 DNA를 BamHI 제한효소로 37℃에서 16시간 동안 반응시켜 절단한 후 0.8% agarose 겔에 전기영동 하였다.
온실에서 건강하게 자란 7개의 식물체 (I-1, II-1, II-2, II-3, II-4, III-1, III-2) 잎 절편으로부터 genomic DNA를 추출하여 Southern분석을 수행하였다. III-1을 제외한 나머지 형질전환체의 genome에 nptII유전가 안정적으로 도입되어 있음을 확인 할 수 있었고, 또한 모든 형질전환체의 게놈에는 1 copy가 도입되어 있었다 (Fig.
국내 재배품종인 “Eunsung” 종자를 7 - 8일 동안 무균 발아시켜 유식물체를 얻었다. 자엽과 자엽사이에 있는 유경 조직과 액아를 메스 (No. 11)로 조심스럽게 제거한 후 자엽절 부위를 10회 이상 상처를 주었다. 이와 같이 준비된 자엽절 절편을 공동배양재료로 사용하였으며, 형질전환방법은 Cho 등 (2005b)의 방법에 따라 수행하였다 (Fig.
형질전환체를 얻기 위하여 자엽절 절편을 pPZP211벡터로 형질전환시킨 25 ml의 Agrobacterium용액 (EHA101)에 30분 동안 침지한 후 공동배양용 배지 (Cho et al. 2005b)에 6개씩 치상 하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 자엽절 절편으로부터 초기 2주 동안에 유도된 부정아의 제거, 항생제 저항성 부정아 유도, 부정아로 부터 부정근 유도 및 유식물체 순화 등의 실험방법과 모든 배지 조성은 Cho 등 (2005a,b)의 방법에 따라 수행하였다.

대상 데이터

1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin이 첨가된 LB액체배지 25 mL에 각각의 colony를 접종하여 28℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD₆₅₀ = 0.6 - 1.0)의 균을 사용하였다.
국내 재배품종인 “Eunsung” 종자를 7 - 8일 동안 무균 발아시켜 유식물체를 얻었다.
2% sucrose가 첨가된 MS기본 고체배지 (Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상 하고 25℃ 암 상태에서 7 - 8일 동안 발아시켰다. 발아된 오이 유식물체로부터 자엽과 자엽 사이를 종단으로 절단한 후 해부현미경하에서 자엽 사이에 있는 유경 조직을 제거하여 Agro-bacterium과 공동배양하기 위한 재료로 사용하였다.
Agrobacterium과 자엽절 절편 공동배양으로 오이 형질전환체를 생산하였다. 오이 자엽절 절편 (c.v. Eunsung)은 선발 마커로서 nptII유전자와 유용유전자로서 DQ유전자가 포함된 pPZP211를 EHA101에 형질전환하여 공동 배양하였다. 3회 반복실험으로부터 평균 형질전환 빈도는 4.

이론/모형

2005b)에 6개씩 치상 하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 자엽절 절편으로부터 초기 2주 동안에 유도된 부정아의 제거, 항생제 저항성 부정아 유도, 부정아로 부터 부정근 유도 및 유식물체 순화 등의 실험방법과 모든 배지 조성은 Cho 등 (2005a,b)의 방법에 따라 수행하였다. 선발배지에 100 mg/L paromomycin 항생제를 첨가하였으며, 모든 배지는 8 g/L Phyto-agar를 첨가하기 전 pH를 조정하여 121℃, 1.
발현벡터 (pPZP211)는 CaMV 35S 프로모터에 선발마커로서 nptII유전자와 저온저항성 유전자로서 인삼유래 DQ유전자가 (unpublished data) 발현될 수 있도록 제조하였으며 (Fig. 1), freeze-thaw방법으로 EHA101에 형질전환하여 균주로 사용하였다 (Jefferson et al. 1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin이 첨가된 LB액체배지 25 mL에 각각의 colony를 접종하여 28℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (OD₆₅₀ = 0.
11)로 조심스럽게 제거한 후 자엽절 부위를 10회 이상 상처를 주었다. 이와 같이 준비된 자엽절 절편을 공동배양재료로 사용하였으며, 형질전환방법은 Cho 등 (2005b)의 방법에 따라 수행하였다 (Fig. 2A). 공동배양 3일 후 초기 2주 동안 선발배지에서 발생된 측아 및 부정아는 모두 제거하였다 (Fig.

성능/효과

Eunsung)은 선발 마커로서 nptII유전자와 유용유전자로서 DQ유전자가 포함된 pPZP211를 EHA101에 형질전환하여 공동 배양하였다. 3회 반복실험으로부터 평균 형질전환 빈도는 4.01%를, 최대 빈도는 5.97%를 보여 주었다. Paromomycin항생제 저항성을 갖는 9개의 식물체를 선발과정을 통해 얻었으며, Southern blot 분석에 의해 6개 식물체의 genome에 nptII유전자자 안정적으로 도입되어 있음을 확인할 수 있었다.
온실에서 건강하게 자란 7개의 식물체 (I-1, II-1, II-2, II-3, II-4, III-1, III-2) 잎 절편으로부터 genomic DNA를 추출하여 Southern분석을 수행하였다. III-1을 제외한 나머지 형질전환체의 genome에 nptII유전가 안정적으로 도입되어 있음을 확인 할 수 있었고, 또한 모든 형질전환체의 게놈에는 1 copy가 도입되어 있었다 (Fig. 3). 따라서 항생제가 첨가된 선발배지에서 paromomycin 저항성식물체 선발과 Southern분석 결과로 미루어 볼 때 배양재료로서 자엽절 절편은 자엽이나 배축 절편에 비하여 매우 효율적임을 알 수 있었고, 그 형질전환 빈도 또한 매우 높아 유용 유전자 도입을 위한 새로운 방법임을 제시할 수 있었다.
Paromomycin에 저항성을 나타내는 22개체의 유식물체를 토양으로 순화하였으나 최종적으로 9개체를 성숙한 개체로 생육시킬 수 있었다. 식물체의 크기가 50 cm이상 된 성숙한 식물체의 어린 잎 조직으로부터 genomic DNA를 추출하였다 (Dellaporta et al.
97%를 보여 주었다. Paromomycin항생제 저항성을 갖는 9개의 식물체를 선발과정을 통해 얻었으며, Southern blot 분석에 의해 6개 식물체의 genome에 nptII유전자자 안정적으로 도입되어 있음을 확인할 수 있었다.
32 %)를 보였다. 결과적으로 3회의 반복 실험으로부터 총 224개의 자엽절 절편으로 부터 22개의 항생제 저항성 부정아를 선발하였고, 9개의 완전한 개체를 생육시켜 4.01%의 형질전환 빈도를 얻었다. 식물의 형질전환빈도는 매우 다양한 요인에 의해 영향을 받는다.
3). 따라서 항생제가 첨가된 선발배지에서 paromomycin 저항성식물체 선발과 Southern분석 결과로 미루어 볼 때 배양재료로서 자엽절 절편은 자엽이나 배축 절편에 비하여 매우 효율적임을 알 수 있었고, 그 형질전환 빈도 또한 매우 높아 유용 유전자 도입을 위한 새로운 방법임을 제시할 수 있었다.
97%)를 보였다. 또한 실험III에서 86개의 배양절편으로부터 5개의 부정아를 얻었고, 2개체의 완전한 식물체를 얻어 가장 낮은 형질전환빈도 (2.32 %)를 보였다. 결과적으로 3회의 반복 실험으로부터 총 224개의 자엽절 절편으로 부터 22개의 항생제 저항성 부정아를 선발하였고, 9개의 완전한 개체를 생육시켜 4.
2005b). 반면 본 연구에서는 오이 자엽절 절편을 이용하였을 경우 4.01%의 비교적 높은 형질전환을 보여 줌으로서 배양절편의 종류따라 매우 달라질 수 있음 보여 주었다. 따라서 오이의 형질전환 효율을 개선하기 위해서는 최적의 배양재료 선택이 매우 중요함을 알 수 있었다.
Paromomycin 항생제가 첨가된 선발배지에서 자엽절 절편 (224개)으로부터 형성된 22개의 부정아 중에서 최종적으로 9개체가 토양순화과정을 거쳐 정상적으로 생육되었다. 실험I에서 71개의 자엽절 절편으로부터 항생제 저항성 부정아는 6개체, 이중에서 완전한 유식물체는 3개체를 얻어 4.22%의 형질전환빈도를 그리고 실험II의 경우 67개의 배양절편으로부터 11개의 항생제 저항성 부정아를 얻었고, 이중에서 4개의 완전한 개체를 얻어 가장 높은 형질전환 빈도 (5.97%)를 보였다. 또한 실험III에서 86개의 배양절편으로부터 5개의 부정아를 얻었고, 2개체의 완전한 식물체를 얻어 가장 낮은 형질전환빈도 (2.
오이 자엽절 절편의 경우도 선발배지에서 멜론 자엽절 절편과 매우 유사한 경향을 보였으며, 특히 배양 8주째 자엽절 절편으로부터 형성되는 항생제 저항성 부정아는 자엽 절편으로부터 발생되는 부정아에 비하여 (Cho et al. 2005a) 매우 빠른 생장을 보여 주위의 괴사되는 조직과 뚜렷하게 구분할 수 있었다.

후속연구

2005a) 매우 빠른 생장을 보여 주위의 괴사되는 조직과 뚜렷하게 구분할 수 있었다. 따라서 향후 유용유전자 도입을 위한 오이 형질전환에서 자엽절 절편은 매우 유용한 배양재료가 될 수 있음을 시사한다.
식물형질전환이 어려운 작물의 경우 일반적으로 배양 재료의 선택, 선발 마커의 최적화, Agrobacterium의 최적 공동배양조건 및 항산화제 등과 같은 형질전환효율을 증가시키기 위한 연구가 더욱 요구된다 (Somers et al. 2003). 배양재료에 대한 가장 좋은 예로서 대두의 경우 배축, 잎, 자엽, 미숙배가 아닌 자엽절 절편을 이용하여 성공적으로 형질전환방법을 확립되었고 (Clemente et al.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	식물형질전환이 어려운 작물의 경우 무엇이 더 요구되는가?	식물형질전환이 어려운 작물의 경우 일반적으로 배양재료의 선택, 선발 마커의 최적화, Agrobacterium의 최적공동배양조건 및 항산화제 등과 같은 형질전환효율을 증가시키기 위한 연구가 더욱 요구된다 (Somers et al. 2003).
	초기오이 형질전환 연구의 문제점들은 무엇이 있었는가?	2001)가 이루어져 왔다. 그러나 기 연구에서 개발된 형질전환시스템의 경우 실험의 재현성, 높은 chimeric 형질전환체의 발생빈도, nptII선발마커의 비 효율성 등 많은 문제점이 보고되어 왔고 (Gaba et al. 2004), 최근 이러한 문제점을 해결하기 위하여 제초제에 저항성을 나타내는 bar유전자를 선발 마커로 이용하거나 (Cho et al.
	오이란 무엇인가?	오이는 미국, 아시아 및 유럽을 중심으로 열대와 아열대 지방에서 재배되는 주요 박과 작물로 식용채소뿐 아니라 피부 미용에도 사용되는 중요한 경제작물로서 국내 소비량이 점차 증가되고 있다. 오이 형질전환연구는 모자이크 바이러스 (CMV) 및 zucchini yellow 모자이크 바이러스 (Boyhan et al.

참고문헌 (21)

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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