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문제 정의
- 따라서 본 연구는 니코틴이 함유되어 있는 전자담배 액상이 유사 구성을 지닌 합성착향료로 사용될 여지가 충분하기 때문에 HPLC/PDA를 이용한 합성 착향료 중 니코틴 정량분석법을 개발하여 식품첨가물의 안전관리를 도모하고자 하였다.
- 전자담배의 구성품 중 액상카트리지는 식품첨가물로 사용되는 합성착향료와 유사한 성분으로 구성되어 있어, 이를 합성착향료로 사용하게 되면, 인체에 유해한 니코틴의 잔류 가능성이 존재한다. 따라서 본 연구는 식품첨가물로 사용되고 있는 합성착향료 중 니코틴 검출 분석법을 개발하였다. 분석에 사용된 검체는 시중에 사용되는 합성착향료를 이용하였다.
제안 방법
- HPLC/PDA를 이용한 니코틴 분석 조건은 설정되었지만, 분석물질에 대한 정성적 확인과 차후 LC-MS/MS를 이용한 분석 조건 설정을 위해 니코틴에 대한 확인 이온을 설정하였다. Full scan mode에서 precursor ion을 질량 스펙트럼을 통해 확인한 다음 collision energy를 설정하여 product ion을 생성한 후 높은 감도와 양호한 스펙트럼을 보이는 이온을 선택하여 최적의 multiple reaction monitoring (MRM) 조건을 설정하였다.
- HPLC/PDA를 이용한 니코틴 분석 조건은 설정되었지만, 분석물질에 대한 정성적 확인과 차후 LC-MS/MS를 이용한 분석 조건 설정을 위해 니코틴에 대한 확인 이온을 설정하였다. Full scan mode에서 precursor ion을 질량 스펙트럼을 통해 확인한 다음 collision energy를 설정하여 product ion을 생성한 후 높은 감도와 양호한 스펙트럼을 보이는 이온을 선택하여 최적의 multiple reaction monitoring (MRM) 조건을 설정하였다.
- 분석에 사용된 검체는 시중에 사용되는 합성착향료를 이용하였다. 검체에 증류수와 디클로로메탄을 가하여 산-염기 액-액 추출법을 이용하여 추출 및 정제과정을 거친 후, 이를 질소 농축하고 이동상으로 재용해하여 HPLC/PDA에 주입하였다. 기기분석은 C18 컬럼을 사용하였고, 20 mM 개미산암모늄 함유 10% 아세토니트릴과 100% 아세토니트릴을 기울기 용리 조건으로 하여 261.
- 기기분석은 C18 컬럼을 사용하였고, 20 mM 개미산암모늄 함유 10% 아세토니트릴과 100% 아세토니트릴을 기울기 용리 조건으로 하여 261.9 nm 에서 측정하였다.
- 니코틴 분석을 위한 최적 조건과 기기를 선정하기 위해 증기압, log Pow 등 물리화학적 특성을 고려하였다. 니코틴의 증기압은 5.
- 니코틴 표준용액의 직선성을 구하기 위하여 10% 아세토니트릴로 희석하여 제조한 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 mg/kg 농도의 표준물질을 상기 분석법으로 측정하였다. 그 결과, 니코틴에 대한 상관계수(r2)가 0.
- 니코틴은 electro-spray ionization (ESI) 방법으로 positive mode에서 높은 감도를 보였으며, 모분자인 m/z 163.1에 충돌 에너지를 각각 20, 28 및 14 eV를 가하여 확인이온 m/z 130.1, 117.1 및 106.1을 얻어 니코틴에 대한 확인 시험을 확립하였다(Fig. 4).
- 니코틴의 분석은 PDA 검출기(photodiode-array detector)가 장착된 고성능액체크로마토그래프(high performance liquid chromatograph (HPLC): alliance e2695, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였다. 분석용 컬럼은 XBridge C18 (4.
- 탠덤 질량분석기를 통해 니코틴의 precursor ion을 선택하고 최적의 collision energy를 선택한 다음 product ion을 탐색하여 표준물질에 대한 fragmentation pattern을 확인하였다(Table 2). 니코틴의 재확인 분석은 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS, Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra, Waltham, MA, USA)를 사용하였다. 분석용 컬럼은 Xbridge C18 (2.
- 니코틴의 확인 시험은 먼저 질량분석기 조건을 확립하기 위해서 표준용액을 사용하여 컬럼을 통과하지 않고 직접 탠덤 질량분석기(tendem mass spectrometry)로 도입하였다. 탠덤 질량분석기를 통해 니코틴의 precursor ion을 선택하고 최적의 collision energy를 선택한 다음 product ion을 탐색하여 표준물질에 대한 fragmentation pattern을 확인하였다(Table 2).
- 정량한계는 분석결과를 수치화할 수 있는 최저 한계를 의미하는데, 각국 및 기관에서는 보통 S/N 비율 6-10 범위를 상용하고 있으며, 국내에 설정된 기준은 국제 기준을 수용하고 있다(10). 따라서 이를 근거로 하여 메트릭스에 첨가한 니코틴의 크로마토그램에서 S/N 비율이 10 이상이 되는 농도 값을 선택하였다.
- 정량 한계는 분석결과를 수치화할 수 있는 최저 한계를 의미하는데, 각국 및 기관에서는 보통 S/N 6-10 범위를 상용하고 있으며, 국내에 설정된 기준은 국제 기준을 수용하고 있다(10). 따라서 이를 근거로 하여 메트릭스에 첨가한 니코틴의 크로마토그램에서 신호 대 잡음비(S/N ratio)가 10 이상이 되는 농도 값을 이용해 다음과 같은 계산식에 의해 정량한계를 산출하였다.
- 분석법의 정밀성 및 정확성을 평가하기 위하여 SFS 시료에 니코틴을 각각 1, 2 및 4×LOQ 농도(0.4, 0.8 및 1.6 mg/kg)가 되도록 표준물질을 첨가하고, 상기 분석 과정을 거쳐 회수율 실험을 수행하였다.
- 분석용 컬럼은 XBridge C18 (4.6 mm×250 mm, 5 µm: Waters, Dublin, Ireland), 컬럼 온도는 40℃, 이동상으로는 용매 A:20 mM 개미산암모늄를 함유한 10% 아세토니트릴과 용매 B:100% 아세토니트릴을 이용하여 기울기 용리 조건으로 분석하였으며, 유속은 1 mL/min 속도로 유지시켰고, 주입량은 10 µL로 하여 261.9 nm에서 측정하였다(Table 2).
- 분석용 컬럼은 Xbridge C18 (2.1 mm×150 mm, 3.5 µm: Waters, Dublin, Ireland), 컬럼 온도는 40℃, 이동상으로는 용매 A: 20 mM 개미산 암모늄를 함유한 10% 아세토니트릴과 용매 B: 100% 아세토니트릴을 이용하여 90:10(v/v)의 등 용리 조건으로 분석하였으며, 유속은 1 mL/min 속도로 유지시켰고, 주입량은 10 µL로 하였다.
- 시료의 전처리는 기존에 보고된 Trehy 등의 방법(7)과 본 연구에서 개발한 방법을 사용하여 비교하였다. 즉, Trehy 등의 방법은 액상 시료 0.
- 이에 대한 분석법의 정확성을 평가하기 위하여 1, 2 및 4×LOQ(0.4, 0.8 및 1.6 mg/kg) 농도로 회수율을 측정하였다.
- 니코틴의 확인 시험은 먼저 질량분석기 조건을 확립하기 위해서 표준용액을 사용하여 컬럼을 통과하지 않고 직접 탠덤 질량분석기(tendem mass spectrometry)로 도입하였다. 탠덤 질량분석기를 통해 니코틴의 precursor ion을 선택하고 최적의 collision energy를 선택한 다음 product ion을 탐색하여 표준물질에 대한 fragmentation pattern을 확인하였다(Table 2). 니코틴의 재확인 분석은 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS, Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra, Waltham, MA, USA)를 사용하였다.
대상 데이터
- 니코틴 표준품(99%)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 물리화학적 특성은 Table 1에 나타내었다. 액체크로마토그래프 이동상 및 전처리 시약으로서 아세토니트릴 및 디클로로메탄은 HPLC급 시약(Merck, Darmstadt, Germany), 개미산암모늄은 Sigma-Aldrich (St.
- 따라서 본 연구는 식품첨가물로 사용되고 있는 합성착향료 중 니코틴 검출 분석법을 개발하였다. 분석에 사용된 검체는 시중에 사용되는 합성착향료를 이용하였다. 검체에 증류수와 디클로로메탄을 가하여 산-염기 액-액 추출법을 이용하여 추출 및 정제과정을 거친 후, 이를 질소 농축하고 이동상으로 재용해하여 HPLC/PDA에 주입하였다.
- 시료는 합성착향료의 주성분인 propylene glycol (Wako, Osaka, Japan)과 glycerine (Wako)을 인위적으로 혼합시킨 화학적 합성시료(65:35, w/w: P+G mix)와 시중에서 식품첨가물로 유통되고 있는 딸기향 합성착향료(synthetic favoring substances, SFS)를 사용하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 물리화학적 특성은 Table 1에 나타내었다. 액체크로마토그래프 이동상 및 전처리 시약으로서 아세토니트릴 및 디클로로메탄은 HPLC급 시약(Merck, Darmstadt, Germany), 개미산암모늄은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), 수산화나트륨, 염산 및 암모니아수는 Wako사(Osaka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다.
- 본 연구에서는 대상 검체인 SFS가 GC 분석 시, 점질성 액상성분인 propylene glycol (PG) 및 glycerine 등이 존재하여 전처리 과정에서 완전히 제거되지 못하고, 고정상에 흡착되거나 완전히 휘발되지 못하는 성질이 있어 HPLC 분석법이 적합할 것으로 판단되었다. 이에 HPLC/PDA를 이용하여 니코틴 표준용액을 210 nm에서 400 nm 범위로 스캔한 결과, 261.9 nm에서 최적의 흡수파장을 확인하여, 분석을 위한 파장으로 선택하였다(Fig. 1). 이동상의 경우는 Trehy 등(7)의 방법을 인용하였는데, A: 10% 아세토니트릴 함유 20 mM 개미산암모늄(암모니아수로 pH 8.
데이터처리
- SFS로부터 니코틴 0.1-2.0 mg/kg의 농도에 대한 각각의 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고, 각 검량선의 상관 계수(coefficient of correlation, r2)를 구하였다. 정량 한계는 분석결과를 수치화할 수 있는 최저 한계를 의미하는데, 각국 및 기관에서는 보통 S/N 6-10 범위를 상용하고 있으며, 국내에 설정된 기준은 국제 기준을 수용하고 있다(10).
- 6 mg/kg) 농도로 회수율을 측정하였다. 분석 크로마토그램으로부터 얻은 피크의 면적을 검량선에 대입하여 시료에 대한 니코틴의 회수율을 구하였고, 5반복 실험을 통해 정확성과 정밀성을 평가하였다.
- 6 mg/kg)가 되도록 표준물질을 첨가하고, 상기 분석 과정을 거쳐 회수율 실험을 수행하였다. 분석 크로마토그램은 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하고, 피크에 대한 면적을 구한 뒤, 검량선을 통해 시험용액 중 니코틴 함량을 확인함으로써 회수율을 구하였고, 5 반복 실험을 통해 정확성과 정밀성을 평가하였다. 회수율 시험 결과, 합성착향료에서의 회수율과 변동계수는 76.
이론/모형
- Trehy 등(7)에 의하면 SFS를 원료로 사용하는 전자담배 리필액체의 경우, 어떠한 추출 및 정제과정 없이 적정량 희석만으로도 분석이 가능하다 보고된 바 있다. 따라서 Trehy 등(7)의 방법에 따라 P+G mix 및 SFS를 이동상 A로 적정량 희석하여 분석하였다. 그 결과 Fig.
- 20 µm 멤브레인필터로 여과한 후 시험용액으로 사용하였다. 또한, 개발된 전처리 방법은 산-염기 액-액 추출법을 사용하였다. 액상 시료 0.
- 9 nm 에서 측정하였다. 또한, 액체크로마토그래프-질량분석기를 통해 확인시험을 수행하였으며, 모든 검증은 Codex 가이드라인의 규정에 따라 실시하였다. 그 결과, 니코틴의 정량한계는 0.
- 5 µm: Waters, Dublin, Ireland), 컬럼 온도는 40℃, 이동상으로는 용매 A: 20 mM 개미산 암모늄를 함유한 10% 아세토니트릴과 용매 B: 100% 아세토니트릴을 이용하여 90:10(v/v)의 등 용리 조건으로 분석하였으며, 유속은 1 mL/min 속도로 유지시켰고, 주입량은 10 µL로 하였다. 또한, 이온화 방법은 전자 분무 이온화 방법(ESI, electrospray ionization)을 사용하였고, spray voltage는 5000 V, capillary 온도는 350, collision 가스는 아르곤을 사용하였다.
- 본 연구에서는 니코틴의 물리화학적 특성을 고려해 산-염기 액-액 추출법에 의해 효율적으로 정제하였다. 니코틴은 담배 잎에서 유래된 알칼로이드 물질로서 pKa가 8인 약염기성을 나타낸다(12).
- 최종적으로 합성착향료를 이용하여 개발된 니코틴의 분석법은 Codex 가이드라인(8,9)에 준하여 직선성, 회수율 및 정량 한계(LOQ)로 유효성 검증을 실시하였다.
성능/효과
- 따라서 Trehy 등(7)의 방법에 따라 P+G mix 및 SFS를 이동상 A로 적정량 희석하여 분석하였다. 그 결과 Fig. 2와 같이 PG와 glycerine 성분으로만 구성되어 있는 P+G mix의 경우, 간섭물질 및 메트릭스가 검출되지 않아 높은 분리능과 선택성을 확인하였다. 하지만, SFS의 경우, 대상성분인 니코틴의 머무름 시간대에 간섭물질이 확인되었다.
- 그 결과, 니코틴에 대한 상관계수(r2)가 0.9999로 우수한 직선성을 나타내었으며(Table 3), 이는 Codex에서 권장하는 r2>0.95에 충족하였다(8,9)
- 또한, 액체크로마토그래프-질량분석기를 통해 확인시험을 수행하였으며, 모든 검증은 Codex 가이드라인의 규정에 따라 실시하였다. 그 결과, 니코틴의 정량한계는 0.4 mg/kg 수준이었고, 회수율은 76.40%-96.28%로 나타났다. 또한, 변동계수는 1.
- 12%로 Codex 가이드라인 규정에 만족하는 수준이 었다. 따라서 개발된 분석법은 식품첨가물에 함유된 니코틴을 분석하기 위한 효율적인 분석법으로 판단된다.
- 다시 5 M 수산화나트륨을 가하여 pH를 알칼리성으로 재차 조절하면 유기용매로 대상성분을 분배 추출함에 따라 니코틴이 회수된다. 따라서 이러한 특성을 이용해 메트릭스에서 문제가 되는 간섭물질(극성 또는 비극성 불순물)을 효과적으로 제거할 수 있었고, 각 단계별로 분석성분에 대해 특성을 파악함으로써 추출 및 정제조건을 확립할 수 있었다.
- 본 연구에서는 대상 검체인 SFS가 GC 분석 시, 점질성 액상성분인 propylene glycol (PG) 및 glycerine 등이 존재하여 전처리 과정에서 완전히 제거되지 못하고, 고정상에 흡착되거나 완전히 휘발되지 못하는 성질이 있어 HPLC 분석법이 적합할 것으로 판단되었다. 이에 HPLC/PDA를 이용하여 니코틴 표준용액을 210 nm에서 400 nm 범위로 스캔한 결과, 261.
- 본 연구의 분석 조건에 대한 특이성을 검증하기 위해, 공시험 분석을 수행한 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 니코틴의 머무름 시간대에 어떠한 방해물질 또는 메트릭스가 검출되지 않아, 본 분석법의 높은 분리능과 선택성을 확인하였다.
- 1). 이동상의 경우는 Trehy 등(7)의 방법을 인용하였는데, A: 10% 아세토니트릴 함유 20 mM 개미산암모늄(암모니아수로 pH 8.7 조정)과 B: 아세토니트릴을 등 용리 조건으로 시험한 결과, 모두 적당한 머무름 시간과 좋은 피크모양을 보였으나 저감도로 분석되었고, 상기 용리액을 기울기 용리 조건으로 변경한 후 분석한 결과, 알맞은 머무름 시간과 피크모양 그리고 우수한 감도로 분석되어 용리액의 최적 조건으로 선정하였다(Fig. 1).
- 분석 크로마토그램은 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하고, 피크에 대한 면적을 구한 뒤, 검량선을 통해 시험용액 중 니코틴 함량을 확인함으로써 회수율을 구하였고, 5 반복 실험을 통해 정확성과 정밀성을 평가하였다. 회수율 시험 결과, 합성착향료에서의 회수율과 변동계수는 76.40%-96.28% 및 1.74%-5.12%로 나타났다(Table 4 및 Fig. 3). 이는 Codex에서 권장하는 회수율 및 변동계수에 충족하는 결과를 나타내어 합성착향료 중 니코틴 정량분석법으로서 적합함을 확인하였다(8,9).
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