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문제 정의
- 본 연구는 마우스에 고지방식이로 비만을 유도하면서 핑거루트 추출물(BPE)의 비만 억제 효과를 평가하는 것이었다. C57BL/6J 마우스를 두개의 실험군으로 나누어 8주 동안 각각 고지방식이와 고지방식이에 0.
- 최근에 고지방식이로 비만을 유도한 쥐에서 핑거루트의 활성성분 중 하나인 panduratin A가 AMP-activated protein kinase(AMPK)의 활성화를 통하여 항비만 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(8). 본 연구에서는 핑거루트 추출물(BPE)의 체중증가 예방효과를 in vitro 및 in vivo에서 확인하고 분자생물학적 작용기전을 밝히고자 수행하였다.
가설 설정
- a,bMeans not sharing a common superscript are significantly different (p<0.05).
제안 방법
- 24 well plate에 배양하여 분화를 유도한 3T3-L1 세포에 다양한 농도의 BPE를 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후 Zenbio Co.(Research Triangle Park, NC, USA)의 glycerol kit를 이용하여 세포 밖으로 분비된 glycerol의 농도를 측정하였다.
- 본 동물실험은 한국야쿠르트 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행하였다. 1주간의 적응기간을 거쳐 실험동물은 정상식이군(ND, AIN-76, Dyets, Bethlehem, PA, USA)과 고지방식이군으로 구분하였다. 고지방식이군은 무작위적으로 고지방식이 음성대조군(HFD)과 고지방식이에 BPE를 첨가한 BPE 보충군(0.
- 4 μm 두께로 절편을 잘라 hematoxylin과 eosin(H&E)으로 염색하여 광학현미경(Carl Ziess, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
- 400배의 배율에서 촬영한 후 AxioVision Rel. 4.6(Carl Ziess)을 이용하여 조직의 세포 크기를 비교하였다.
- BPE의 지방세포 분화 억제효능을 평가하기 위해 분화유도배지에 다양한 농도(10, 50, 100 μg/mL)의 BPE를 처리하였다. AdipoRed reagent로 세포 내의 지방축적 정도를 관찰하였으며, 지방전구세포 상태에서의 지방축적 정도를 blank로, BPE를 처리하지 않고 분화유도를 하여 성숙한 상태의 지방세포를 대조구(100%)로 하여 백분위로 표시하였다. 그 결과, BPE의 처리를 통해 지방축적이 농도 의존적으로 감소하였음을 확인하였다(Fig.
- 침지한 추출물을 여과하고 감압 증류장치(evaporator)을 이용하여 농축시킨 후 핑거루트 에탄올추출물(BPE)을 제조하였다. BPE가 HFD로 비만을 유도한 쥐에서 AMPK의 활성화를 통해 체중을 감소시킨다고 보고된 기능성 지표성분인 panduratin A를 함유하고 있는지 확인하기 위해 기존의 방법에 따라 panduratin A를 추출하고 그 함량을 분석하였다(9). 최종적으로 BPE에는 panduratin A가 8% 함유되어 있음을 확인하였다.
- BPE가 세포의 생존률에 미치는 영향을 확인하였다. 세포 생존률은 Roche Applied Science(Indianapolis, IN, USA)의 cell proliferation kit I을 이용하여 측정하였다.
- 지방축적 정도는 세포 내의 지방과 반응하는 AdipoRed reagent의 형광 정도로 분석하는데 excitation은 485 nm에서, emission은 572 nm에서 측정하였다. BPE를 무처리하고 분화시킨 well을 대조구(100%)로 하고, 분화시키지 않은 fibroblast well의 형광값을 blank로 하여 분화정도를 백분위로 표시하였다.
- 05). BPE에 의한 체중증가량 감소가 각 조직의 지방 축적 감소에 의한 것인지 알아보기 위해 동물 희생 후 지방조직의 무게를 확인하였다. 총 내장지방의 무게는 정상식이를 급여한 쥐와 비교하여 고지방식이군에서 98.
- BPE의 지방세포 분화 억제효능을 평가하기 위해 분화유도배지에 다양한 농도(10, 50, 100 μg/mL)의 BPE를 처리하였다.
- 본 연구는 마우스에 고지방식이로 비만을 유도하면서 핑거루트 추출물(BPE)의 비만 억제 효과를 평가하는 것이었다. C57BL/6J 마우스를 두개의 실험군으로 나누어 8주 동안 각각 고지방식이와 고지방식이에 0.5%의 BPE를 보충한 식이를 급여하였다. BPE는 식이섭취량에는 영향을 주지 않으면서도 고지방식이군과 비교하여 유의적으로 체중증가를 줄이고, 내장지방의 축적을 억제하였다.
- 혈장 중성지질 함량은 Asan pharmaceutical에서 구입한 시약을 활용하여 효소적인 방법으로 측정하였다. Leptin 농도는 mouse leptin ELISA(enzymelinked immunosorbent assay) kit(Biovendor, Brno, Czech) 을 이용하여 측정하였다. 간지질 분석을 위해, 간조직을 20 mM potassium phosphate buffer(pH 7.
- 4)에 넣고 분쇄한 후클로로포름과 메탄올을 혼합한 용액(1:1, v/v)을 넣어 지질을 추출하였다. 간 조직 내의 총콜레스테롤과 중성지질 함량은 혈청 분석과 동일한 방법으로 측정하였다.
- Leptin 농도는 mouse leptin ELISA(enzymelinked immunosorbent assay) kit(Biovendor, Brno, Czech) 을 이용하여 측정하였다. 간지질 분석을 위해, 간조직을 20 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)에 넣고 분쇄한 후클로로포름과 메탄올을 혼합한 용액(1:1, v/v)을 넣어 지질을 추출하였다. 간 조직 내의 총콜레스테롤과 중성지질 함량은 혈청 분석과 동일한 방법으로 측정하였다.
- 혈장의 총콜레스테롤 함량은 V-cholesterol kit(Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 고밀도 지단백(HDL)-콜레스테롤은 HDL-cholesterol kit(Asan Pharmaceutical)로 측정하였다. 저밀도 지단백(LDL)-콜레스테롤은 총콜레스테롤에서 HDL-콜레스테롤과 중성지질(triglyceride)을 5로 나눈 값을 빼준 것으로 결정하였다(10).
- 1주간의 적응기간을 거쳐 실험동물은 정상식이군(ND, AIN-76, Dyets, Bethlehem, PA, USA)과 고지방식이군으로 구분하였다. 고지방식이군은 무작위적으로 고지방식이 음성대조군(HFD)과 고지방식이에 BPE를 첨가한 BPE 보충군(0.5%, HFD-BPE)으로 구분하였다. 자세한 실험동물의 식이조성은 Table 1과 같다.
- 3T3-L1 세포를 지방전구세포(preadipocyte) 혹은 분화된 지방세포(matured adipocytes) 상태로 96 well plate에 배양하였다. 다양한 농도의 BPE를 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후 세포 생존률을 측정하였다. 지방 분해 효능은 지방세포에 BPE를 처리하고 분해되어 세포 밖으로 분비된 glycerol의 양을 측정하여 평가하였다.
- Real-time PCR을 통해 얻어진 결과는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 의 발현수준과 비교하여 보정하였고, comparative cycle threshold method를 이용하여 분석하였다. 또한 각각의 PCRreaction의 melting curve를 통해 증폭된 유전자의 순도를 확인하였다.
- 부고환지방 조직 내 adipogenesis와 관련된 C/EBPα와 PPARγ2 유전자의 발현을 분석하였다.
- 분화를 유도하기 위해서 배지를 10%의 FBS, 0.5 μM의 isobutylmethylxanthine(IBMX, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)과 1 μM의 dexamenthasone(Sigma Chemical Co.), 10 μg/mL의 bovine insulin(Sigma Chemical Co.)이 함유된 분화유도 배지로 치환하였다.
- BPE가 세포의 생존률에 미치는 영향을 확인하였다. 세포 생존률은 Roche Applied Science(Indianapolis, IN, USA)의 cell proliferation kit I을 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 세포를 지방전구세포(preadipocyte) 혹은 분화된 지방세포(matured adipocytes) 상태로 96 well plate에 배양하였다.
- 자세한 실험동물의 식이조성은 Table 1과 같다. 실험동물은 시험기간 동안 물과 사료를 자유롭게 섭취하였으며, 식이섭취량과 체중변화량은 일주일에 두 번씩 측정하였다. 8주 후, 마우스는 12시간 동안 금식시키고 zoletil을 이용하여 마취하였다.
- 이 때 BPE를 각 well에 10, 50, 100 μg/mL 농도로 함께 처리하였다.
- 이틀간 분화를 유도한 후 분화유도 배지를 10% FBS와 10 μg/mL의 insulin을 함유한 DMEM 배지로 치환하여 배양하였다.
- 각 조직의 무게를 칭량하고 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. 조직학적 분석을 위해 부고환지방 및 간조직은 4%의 완충포르말린 용액에 고정하였고, 파라핀에 포매하였다. 4 μm 두께로 절편을 잘라 hematoxylin과 eosin(H&E)으로 염색하여 광학현미경(Carl Ziess, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
- 다양한 농도의 BPE를 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후 세포 생존률을 측정하였다. 지방 분해 효능은 지방세포에 BPE를 처리하고 분해되어 세포 밖으로 분비된 glycerol의 양을 측정하여 평가하였다. 24 well plate에 배양하여 분화를 유도한 3T3-L1 세포에 다양한 농도의 BPE를 처리하고 24시간 동안 반응시킨 후 Zenbio Co.
- 분화된 지방세포에 BPE를 처리한 경우 지방 분해가 촉진되는 것을 확인할 수 있었다. 지방세포에 BPE를 처리하고 지방이 분해되어 세포 밖으로 분비된 glycerol의 발생량을 측정하였다. 이때 BPE의 농도 의존적으로 glycerol 발생량이 증가하였다(Fig.
- 지방세포에 대한 BPE의 효능을 확인하기 위해 고지방식이로 유도된 비만 동물 모델에서 BPE의 항비만 효과를 시험하였다. BPE 보충군의 각 마우스들은 8주 동안 하루에 약 18.
- 핑거루트의 근경 1 kg을 건조 분쇄한 후 4 L의 95% 에탄올을 첨가하고 2일간 상온에서 침지하였다. 침지한 추출물을 여과하고 감압 증류장치(evaporator)을 이용하여 농축시킨 후 핑거루트 에탄올추출물(BPE)을 제조하였다. BPE가 HFD로 비만을 유도한 쥐에서 AMPK의 활성화를 통해 체중을 감소시킨다고 보고된 기능성 지표성분인 panduratin A를 함유하고 있는지 확인하기 위해 기존의 방법에 따라 panduratin A를 추출하고 그 함량을 분석하였다(9).
- 혈장 포도당 함량은 Amplex Red glucose kit(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈장 insulin은 mouse insulin kit(SIBAYAGI, Shibukawa, Japan)를 이용하여 측정하였다. 혈장의 총콜레스테롤 함량은 V-cholesterol kit(Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 혈장 포도당 함량은 Amplex Red glucose kit(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 이용하여 측정하였다. 혈장 insulin은 mouse insulin kit(SIBAYAGI, Shibukawa, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 혈장 insulin은 mouse insulin kit(SIBAYAGI, Shibukawa, Japan)를 이용하여 측정하였다. 혈장의 총콜레스테롤 함량은 V-cholesterol kit(Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 고밀도 지단백(HDL)-콜레스테롤은 HDL-cholesterol kit(Asan Pharmaceutical)로 측정하였다.
대상 데이터
- 3T3-L1 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. 먼저 3T3-L1을 10% fetal bovine serum(FBS, GibcoⓇ, Carlsbad, CA, USA)을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 106 cells/well이 되도록 fibroblast 상태(preadipocyte)의 세포를 배양하였다.
- 실험에 사용한 C57BL/6J 마우스(male)는 15～20 g 사이인 개체를 일본 SLC(Shizuoka)로부터 구입하여 사용하였다. 실험동물은 개별적으로 스테인리스 스틸 케이지에서 사육되었으며, 사육실 온도는 22℃로 항온항습이 유지되었고 명암은 12시간 주기로 자동 조절되었다. 본 동물실험은 한국야쿠르트 동물실험윤리위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행하였다.
- 실험에 사용한 C57BL/6J 마우스(male)는 15～20 g 사이인 개체를 일본 SLC(Shizuoka)로부터 구입하여 사용하였다. 실험동물은 개별적으로 스테인리스 스틸 케이지에서 사육되었으며, 사육실 온도는 22℃로 항온항습이 유지되었고 명암은 12시간 주기로 자동 조절되었다.
- 핑거루트의 근경(rhizome)은 인도네시아 자카르타에서 구입하였다. 핑거루트의 근경 1 kg을 건조 분쇄한 후 4 L의 95% 에탄올을 첨가하고 2일간 상온에서 침지하였다.
데이터처리
- 관련된 template의 GenBank accession number 및 forward(F)와 reverse(R) primer의 염기서열은 Table 2와 같다. Real-time PCR을 통해 얻어진 결과는 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 의 발현수준과 비교하여 보정하였고, comparative cycle threshold method를 이용하여 분석하였다. 또한 각각의 PCRreaction의 melting curve를 통해 증폭된 유전자의 순도를 확인하였다.
- 모든 결과는 평균과 표준오차를 계산하였다. 실험군 사이의 차이는 one-way ANOVA를 실시한 후, p<0.
- 실험군 사이의 차이는 one-way ANOVA를 실시한 후, p<0.05의 유의수준에서 Duncan’s test를 실시하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 저밀도 지단백(LDL)-콜레스테롤은 총콜레스테롤에서 HDL-콜레스테롤과 중성지질(triglyceride)을 5로 나눈 값을 빼준 것으로 결정하였다(10). 혈장 중성지질 함량은 Asan pharmaceutical에서 구입한 시약을 활용하여 효소적인 방법으로 측정하였다. Leptin 농도는 mouse leptin ELISA(enzymelinked immunosorbent assay) kit(Biovendor, Brno, Czech) 을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- BPE 보충군에서 C/EBPα와 PPARγ2 발현양은 고지방식이군 대비 각각 1.30배와 1.16배로 유의적으로 증가하였다(p<0.05).
- RT-PCR 분석 결과, 부고환 지방내에서의 C/EBPα와 PPARγ2의 발현수준이 고지방식이 대비 각각 1.30배와 1.16배 증가하였다.
- 16배 증가하였다. 결론적으로 BPE는 고지방식이로 유도된 비만 마우스 모델에서 내장지방의 축적을 감소시키고, 이상지질혈증 개선을 통해 항비만 효과를 나타내는 것으로 판단된다.
- 특정 조건에서는 C/EBPα와 PPARγ의 활성인자들이 대사 장애 치료제로서 활용 가능성이 있다고 보고되고 있다(19). 결론적으로 BPE는 고지방식이에 의해 비만이 유도된 마우스에서 체중 증가를 억제하고, 지방간, 이상지질혈증, 고렙틴혈증을 개선하는데 있어 효과적인 소재임을 확인할 수 있었다.
- 부고환지방에서 얻어진 RNA를 real-time RT-PCR을 통해 분석한 결과, 고지방식이군에서는 C/EBPα와 PPARγ2 유전자가 유의적으로 저발현(down-regulation) 되었음을 확인할 수 있었다. 고지방식이에 의한 지방 분해 관련 유전자의 발현 수준 변화는 BPE 급여를 통해 모두 회복되었다 (Fig. 4). BPE 보충군에서 C/EBPα와 PPARγ2 발현양은 고지방식이군 대비 각각 1.
- AdipoRed reagent로 세포 내의 지방축적 정도를 관찰하였으며, 지방전구세포 상태에서의 지방축적 정도를 blank로, BPE를 처리하지 않고 분화유도를 하여 성숙한 상태의 지방세포를 대조구(100%)로 하여 백분위로 표시하였다. 그 결과, BPE의 처리를 통해 지방축적이 농도 의존적으로 감소하였음을 확인하였다(Fig. 1A). 또한 BPE는 3T3-L1 지방전 구세포의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- BPE의 급여는 고지방식이 대비 간무게에는 크게 영향을 주지 않았다(Table 3). 그러나 조직학적 관찰을 통해 BPE가 고지방식이로 유도된 간조직 내의 지방 축적을 개선하고(Fig. 3B), 중성지질 함량을 낮춰주는 것을 확인할 수 있었다 (Table 4).
- 그리고 adipocytokine의 분비 변화는 인슐린 저항성 및 비알콜성 지방간 등에 영향을 줄 수 있다(16). 따라서 BPE 보충에 따른 혈장 지질 및 adipocytokine의 함량을 측정한 결과(Table 4), 혈장 중의 중성지질 농도는 고지방식이군 대비 BPE 보충군에서 24.4%나 낮아졌지만 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 또한 혈장 중 총콜레스테롤 함량 및 LDL-콜레스테롤 함량에는 크게 영향을 주지 않았으며, 혈장 중 포도당 및 인슐린 함량도 고지방식이나 BPE 섭취를 통해 크게 변화하지 않았다.
- 1A). 또한 BPE는 3T3-L1 지방전 구세포의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1B).지방전구세포에 BPE를 24시간 동안 처리하였을 때, 10 μg/mL의 경우 91.
- BPE는 식이섭취량에는 영향을 주지 않으면서도 고지방식이군과 비교하여 유의적으로 체중증가를 줄이고, 내장지방의 축적을 억제하였다. 또한 BPE를 급여한 군은 고지방식이군과 비교하여 혈중 지질, 간지질의 축적, 혈중 렙틴 농도를 감소시켰다. RT-PCR 분석 결과, 부고환 지방내에서의 C/EBPα와 PPARγ2의 발현수준이 고지방식이 대비 각각 1.
- 4%나 낮아졌지만 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 또한 혈장 중 총콜레스테롤 함량 및 LDL-콜레스테롤 함량에는 크게 영향을 주지 않았으며, 혈장 중 포도당 및 인슐린 함량도 고지방식이나 BPE 섭취를 통해 크게 변화하지 않았다. 그러나 고지방식이를 통해 상승한 렙틴의 농도는 BPE의 급여를 통해 46.
- 부고환지방에서 얻어진 RNA를 real-time RT-PCR을 통해 분석한 결과, 고지방식이군에서는 C/EBPα와 PPARγ2 유전자가 유의적으로 저발현(down-regulation) 되었음을 확인할 수 있었다.
- 식이섭취량에 있어서 군간의 차이는 없었으며, BPE 보충군의 사료효율(food efficiency ratio, FER)은 고지방식이군 대비 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- 실험이 완료되었을 때 고지방식이군 대비 BPE를 투여한 쥐의 체중은 9.3%, 체중증가량은 23.8% 감소하였다(p<0.05).
- 8 mg/kg/day와 동일한 함량이었다(8). 음성대조군인 고지방식이군과 비교하여 BPE 보충군에서 체중증가량이 유의적으로 감소하였다(Table 3). 실험이 완료되었을 때 고지방식이군 대비 BPE를 투여한 쥐의 체중은 9.
- 이번 연구에서 고지방식이를 급여한 마우스의 내장지방에서 PPARγ2와 C/EBPα의 발현은 줄어들었다.
- 지방전구세포에 BPE를 24시간 동안 처리하였을 때, 10 μg/mL의 경우 91.7%, 100 μg/mL의 경우 39.9%로 농도 의존적으로 정상세포의 수가 감소함을 확인할 수 있었다.
- 총 내장지방의 무게는 정상식이를 급여한 쥐와 비교하여 고지방식이군에서 98.8%가 증가하였다(p<0.05).
- BPE가 HFD로 비만을 유도한 쥐에서 AMPK의 활성화를 통해 체중을 감소시킨다고 보고된 기능성 지표성분인 panduratin A를 함유하고 있는지 확인하기 위해 기존의 방법에 따라 panduratin A를 추출하고 그 함량을 분석하였다(9). 최종적으로 BPE에는 panduratin A가 8% 함유되어 있음을 확인하였다.
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