The purpose of this study is to investigate vasorelaxant effect of Epimedium koreanum(EK) extract on rabbit carotid artery. In this study, to determine vasorelaxant effect of EK extract on rabbit carotid artery, arterial rings with intact or damaged endothelium were used for experiment using organ b...
The purpose of this study is to investigate vasorelaxant effect of Epimedium koreanum(EK) extract on rabbit carotid artery. In this study, to determine vasorelaxant effect of EK extract on rabbit carotid artery, arterial rings with intact or damaged endothelium were used for experiment using organ bath, and were contracted by norepinephrine(NE). After being contracted, arterial rings were treated with EK extract in a dose-dependent manner To study its mechanism, the contracted arterial rings induced by NE were pretreated with indomethacin(IM), $N_{\omega}$-nitro-L-arginine(L-NNA), methylene blue(MB) or tetraethylammonium chloride(TEA) and 0.1 $mg/m{\ell}$ EK extract was added. To analyze the effect of the EK extract on influx of extracellular calcium chloride($Ca^{2+}$) in rabbit carotid artery, in $Ca^{2+}$-free krebs solution, krebs solution containing 1 mM $Ca^{2+}$ was infused into the contracted arterial ring by NE after pretreatment of EK extract. To measure the cytotoxicity of the EK extract, cell viability of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC) was measured by MTT assay, and nitric oxide(NO) was measured by Griess reagent. The EK extract significantly was relaxed the arterial ring with intact endothelium contracted by NE, but the vasorelaxant effect of the EK extract was inhibited in the arterial rings with damaged endothelium. The vasorelaxant effect of the EK extract was not different between the IM-pretreatedand and non-treated arterial rings. The vasorelaxant effect of EK extract were significantly inhibited, when arterial rings were pretreated with L-NNA, TEA, MB. And in $Ca^{2+}$-free krebs solution, increasing of arterial contraction by $Ca^{2+}$ addition were also inhibited by the treatment of EK, but not significant. The treatment of EK extract was increased NO concentration in HUVEC. This study suggested that the vasorelaxant effect of EK extract would be related with EDHF and NO production and increasing of cyclic GMP.
The purpose of this study is to investigate vasorelaxant effect of Epimedium koreanum(EK) extract on rabbit carotid artery. In this study, to determine vasorelaxant effect of EK extract on rabbit carotid artery, arterial rings with intact or damaged endothelium were used for experiment using organ bath, and were contracted by norepinephrine(NE). After being contracted, arterial rings were treated with EK extract in a dose-dependent manner To study its mechanism, the contracted arterial rings induced by NE were pretreated with indomethacin(IM), $N_{\omega}$-nitro-L-arginine(L-NNA), methylene blue(MB) or tetraethylammonium chloride(TEA) and 0.1 $mg/m{\ell}$ EK extract was added. To analyze the effect of the EK extract on influx of extracellular calcium chloride($Ca^{2+}$) in rabbit carotid artery, in $Ca^{2+}$-free krebs solution, krebs solution containing 1 mM $Ca^{2+}$ was infused into the contracted arterial ring by NE after pretreatment of EK extract. To measure the cytotoxicity of the EK extract, cell viability of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC) was measured by MTT assay, and nitric oxide(NO) was measured by Griess reagent. The EK extract significantly was relaxed the arterial ring with intact endothelium contracted by NE, but the vasorelaxant effect of the EK extract was inhibited in the arterial rings with damaged endothelium. The vasorelaxant effect of the EK extract was not different between the IM-pretreatedand and non-treated arterial rings. The vasorelaxant effect of EK extract were significantly inhibited, when arterial rings were pretreated with L-NNA, TEA, MB. And in $Ca^{2+}$-free krebs solution, increasing of arterial contraction by $Ca^{2+}$ addition were also inhibited by the treatment of EK, but not significant. The treatment of EK extract was increased NO concentration in HUVEC. This study suggested that the vasorelaxant effect of EK extract would be related with EDHF and NO production and increasing of cyclic GMP.
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문제 정의
이에 저자는 토끼의 적출혈관을 이용한 organ bath study를 통하여 혈관내피세포에서 분비되는 EDHF, NO 및 prostacyclin 을 중심으로 한 음양곽의 혈관이완효과에 대한 연구결과를 보고한 바 있으며21), 추가적으로 이완효과의 기전과 NO의 생성에 미치는 영향에 대한 연구에서 유의한 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
음양곽(Epimedium koreanum) 200 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 round flask에 넣고 2시간 동안 가열 추출한 다음 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축하였다. 농축액을 동결건조기로 건조하여 얻은 23.
음양곽의 혈관이완효과가 NO의 역할과 관련이 있는지 알아보기 위하여 혈관내피세포에서 NOS의 inhibitor로 작용하여 NO 의 생성을 막는 것으로 알려져 있는 L-NNA31,32)와 내피세포에서 생성된 NO가 혈관평활근으로 가서 soluble guanylyl cyclase를 활성화시킴으로써 GTP가 cyclic GMP로 전환되는 것을 차단하는 것으로 알려져 있는 MB33)를 사용하였다.
혈관내피세포가 존재하는 혈관절편과 혈관내피세포가 제거된 혈관절편에 5 µM NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 이완효과의 변화를 비교하였다.
혈관절편에 5 µM NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1 ㎎/㎖)로 투여하여 이완효과의 변화를 기록하였다.
혈관절편을 1 µM MB로 10분간 전처치하고 NE 5 µM를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여 하여 MB를 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.
혈관절편을 10 µM IM으로 10분간 전처치하고 5 µM NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 IM을 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교하였다.
혈관절편을 10 µM TEA로 10분간 전처치하고 5 µM NE를 투여하여 수축을 유발시킨 다음 음양곽 추출물(0.1 ㎎/㎖)을 투여하여 TEA를 전처치하지 않은 경우와 이완효과의 변화를 비교 하였다.
대상 데이터
체중 1.5 kg 내외의 Newzealand white 수컷 토끼(샘타코, 한국)를 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 1주 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다. 본 동물실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인(smec 12-05-02)하에 실시되었다.
데이터처리
실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었으며, 혈관수축의 변화는 실제 수축의 크기와 NE로 유발된 최고 수축에 대한 백분 율로 표현하였다. 실험결과의 비교는 student's t-test를 시행하였고, 유의성은 P<0.
실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었으며, 혈관수축의 변화는 실제 수축의 크기와 NE로 유발된 최고 수축에 대한 백분 율로 표현하였다. 실험결과의 비교는 student's t-test를 시행하였고, 유의성은 P<0.05로 판정하였다.
이론/모형
Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 배지로 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 배양한 HUVEC에 음양곽 추출물을 농도별로 처리한 다음 24시간 배양하여 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다25). MTT (methylthiazol-2-yl-2,5- diphenyl tetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖)를 20 ㎕ 넣고, 세포배양기에서 2시간 방치하였다.
성능/효과
또한 음양곽의 혈관이완효과는 IM의 전처치 유무에 상관없이 유의성 있게 나타났으나 TEA와 L-NNA, MB의 전 처치에는 유의성 있게 억제되어 나타났다. Ca2+을 제거한 krebs-ringer solution에서 음양곽의 전처치는 Ca2+의 첨가에 의한 수축의 증가를 억제하였으나 유의성이 관찰되진 않았으며, Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 NO 량을 측정하였을 때 음양곽 추출물을 투여한 경우 control에 비해 NO의 생성이 유의하게 증가된 것이 관찰되었다.
음양곽은 NE로 수축시킨 혈관에 대해 유의성 있는 이완효과를 나타내었으며 내피세포를 제거한 경우 음양곽의 혈관이완 효과는 내피세포를 제거하지 않은 경우에 비해 유의하게 억제되어 나타났다. 또한 음양곽의 혈관이완효과는 IM의 전처치 유무에 상관없이 유의성 있게 나타났으나 TEA와 L-NNA, MB의 전 처치에는 유의성 있게 억제되어 나타났다. Ca2+을 제거한 krebs-ringer solution에서 음양곽의 전처치는 Ca2+의 첨가에 의한 수축의 증가를 억제하였으나 유의성이 관찰되진 않았으며, Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 NO 량을 측정하였을 때 음양곽 추출물을 투여한 경우 control에 비해 NO의 생성이 유의하게 증가된 것이 관찰되었다.
실험결과 NE에 의한 최대수축에 대하여 0.01, 0.03, 0.1 ㎎/㎖ 음양곽 추출물 처리 시 유의성 있는 이완효과를 나타내었고, 내피세포를 제거한 경우엔 이완효과가 관찰되지 않았다. 이를 통해 음양곽의 혈관이완효과가 내피세포 의존성으로 일어난다는 사실을 알 수 있다.
실험결과 음양곽은 혈관내피세포에서 NO의 생성과 평활근에서 cGMP를 증가시키고, EDHF를 통해 세포막의 막전압을 과분극시킴으로써 혈관을 이완시키는 것으로 생각된다.
음양곽은 NE로 수축시킨 혈관에 대해 유의성 있는 이완효과를 나타내었으며 내피세포를 제거한 경우 음양곽의 혈관이완 효과는 내피세포를 제거하지 않은 경우에 비해 유의하게 억제되어 나타났다. 또한 음양곽의 혈관이완효과는 IM의 전처치 유무에 상관없이 유의성 있게 나타났으나 TEA와 L-NNA, MB의 전 처치에는 유의성 있게 억제되어 나타났다.
이상의 실험결과에서 음양곽은 내피세포 의존성으로 혈관이 완효과를 가지고 있으며 혈관을 이완시키는 기전은 EDHF를 통해 막전압을 과분극시키고 NOS로부터 NO의 생성을 도우며, NO의 생성을 통해 cGMP를 증가시키는 기전에 의한 것으로 판단된다.
후속연구
따라서 음양곽은 혈관수축에 의한 혈압상승 시 직접적인 혈관이완효과를 통해 심혈관계 질환에 폭넓게 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
Human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)에 음양곽 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정하였을 때 음양곽 추출물 100, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도에서 세포 생존율이 유의하게 감소되었다. 이는 음양곽 추출물이 세포에 대하여 일정 부분 독성이 있다고 생각할 수 있으나 평균 적으로 70 ~ 80%의 생존율을 나타내었으므로 정확한 독성여부에 관해서는 자세히 실험을 추가해봐야할 것이다.
음양곽을 전처치한 경우와 음양곽을 전처치하지 않은 경우를 비교하였을 때 Ca2+ 투여로 인한 수축의 증가는 음양곽의 전처치에 의해 감소되었지만 유의성이 나타나진 않았다. 이로써 음양곽이 혈관을 이완시키는 작용이 세포외 Ca2+의 유입과는 관련이 없다고 판단할 수 있으나 결과가 유의성만 나타나지 않았을 뿐 감소되는 추세에 있으므로 추후 추가실험이 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
혈관내피세포는 혈압의 조절에 어떻게 관여하는가?
혈관내피세포는 모든 혈관의 내강을 형성하는 단일 층의 특화된 상피세포로 신생 혈관의 성장을 촉진하는 물질을 분비하며, 혈액과 조직 사이의 물질 교환에 관여하고, 혈관을 수축하는 수축인자와 이완시키는 이완인자의 분비를 통해 말초저항을 유지함으로써 혈압의 조절에 관여된다6).
고혈압의 종류는?
고혈압은 원인 질환 없이 발생되는 본태성 고혈압과 신실질성 및 신혈관성 질환 등 여러 가지 원인이 복합적으로 작용하여 발생하는 이차성 고혈압으로 나뉘어진다1). 이 중 원인을 알 수 없는 본태성 고혈압이 약 90%를 차지하고 있고 뇌혈관 질환, 심장질환, 당뇨병 등 심혈관계 질환의 주된 원인이기도 하지만 단일 질병으로는 그 증상이 뚜렷이 나타나지 않아서 고혈압은 예방 및 치료가 어려운 질병 중의 하나이다2,3).
혈관내피세포내의 이완인자들은 각각 어떤 원리로 혈관을 이완시키는가?
Prostacyclin은 내피세포에서 cyclooxygenase에 의해 arachidonic acid로부터 생성되는 물질로서 평활근에서 cyclic AMP를 활성화시켜 혈관을 이완시키고7), EDHF는 calcium-activated potassium channels의 활성화로 막전압을 과분극시켜 혈관을 이완시키며8,9), NO는 혈관내피세포에서 endothelial nitric oxide synthase(eNOS)에 의해 합성되어 혈관 평활근 내 cyclic GMP를 증가시킴으로써 세포내 Ca2+ 농도를 감소시켜 혈관을 이완시키는 작용을 한다10).
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