선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 을 제시하였다. 이러한 최근의 발효연구동향에 주목하여 약리 작용과 한의학에서 補腎壯陽, 强筋健骨, 祛風除濕의 효능이 있는 淫羊藿 발효 추출물의 면역 활성에 대한 연구를 하게 되었다.
- 이에 著者는 본 연구에서 淫羊藿을 Saccharomyces cerevisiae STV89로 발효 추출하여 제조한 시료 EHS를 대상으로 마우스 대식세포에서 세포증식율, 세포내 과산화수소 (H2O2)생성과 lipopolysaccharide(LPS)에 의해 촉발되는 산화질소(nitric oxide; NO) 생성 및 각종 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1) 생성에 미치는 영향을 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포로부터 NO의 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 24 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal) 보다 NO 생성이 유의하게 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 EHS는 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소 되었다.
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 IL-1β 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다.
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 3시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 모두 유의하게 감소되었다(Fig.
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 TNF-α 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다.
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 24시간동안 LPS 단독으로 배양 한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 MCP-1 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 일 때만 유의하게 감소되었다.
- EHS가 대식 세포의 증식에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 배양처리 한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 세포증식율이 증가하였다(Fig.
- EHS가 대식세포의 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간의 배양결과, 50 ㎍/mL 이상의 농도에서 유의한 증가를 나타내었다(Fig.
- EHS가 정상 대식세포의 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간의 배양 결과, 25 ㎍/mL이상의 농도에서 유의한 감소를 나타내었다(Fig.
- Saccharomyces cerevisiae STV89 효모로 발효 추출한 淫羊藿의 마우스 대식세포인 Raw 274.7 세포에서의 염증유발물질 생성에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 산화질소(nitric oxide, NO)의 기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다. 그리스 시약(griess reagent : 0.5 % sulfanilamide, 2.5 % phaphate, 0.5 % naphthylethylenediamine dihydrochloride, NED)은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 추정하기 위해 Microplate Reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 NO의 생성정도를 비교 하였다. 이를 위해 다음과 같이 실험하였다.
- 배양이 끝나면 상등액을 채 취하여 Bio-Plex Suspension Array System의 Bio-Plex Cytokine Assay를 실시하여 각종의 사이토카인류(TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1)의 발현에 대한 시료의 영향을 계산, 비교하였다.
- 사이토카인 분비와 관련된 시료의 영향을 알아보기 위해 Anderson 등16)의 방법을 응용하여 Bio-Plex Cytokine Assay를 다음과 같이 시행하였다. 96 well plate에 1×105 cells/mL의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 Incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1×PBS 용액으로 씻어준 뒤 각 well에 LPS를 단독처리(2 ㎍/mL)하거나 혹은 다양한 농도의 시료와 함께 배지에 담아 처리하고 배양하였다.
- 위에서 제조된 淫羊藿 추출물을 이용하여 다음과 같은 방법으로 淫羊藿 발효 추출물을 제조하였다.
- 이에 著者는 발효한약의 유의성을 적용하여 淫羊藿을 발효 추출하여 만들어진 시료 EHS로 마우스 대식세포를 이용한 세포증식율, 세포내 과산화수소 및 산화질소 생성, 그리고 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1) 생성에 미치는 영향을 측정하였다.
대상 데이터
- ① 조효소 조제 : 조효소제인 α-Herbzyme (한국효소) 3 g에 증류수 100 mL를 가하고 37℃에서 30분간 침출 하여 여과시킨 후 그 여액을 조효소액으로 사용하였다.
- 2007-1012) 모든 약재는 쓰기 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다. 淫羊藿의 발효에 사용한 균주로는 효모 균주 중 Saccharomyces cerevisiae STV89를 사용하였다.
- 본 실험을 위해서 ethyl alcohol (Samchun Chemical, Korea), DMSO (Sigma, USA), DMEM (Sigma, USA), 1×PBS (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA), Bio-Plex cytokine assay kit (Panomics, USA) 등이 사용 되었다. 본 실험에 사용된 기기는 CO2 incubator (Nuaire, USA), rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan), research microscope (Becton dickinson, USA), centrifuge (Hanil, Korea), fume hood (Hanil, Korea), clean bench (Jeio thec, Korea), ultrasonic cleaner (Branson, USA), microplate reader (Bio-Rad, USA), vortex mixer (Vision Scientific Co, Korea), water bath (Intron Biotech, Korea), ice-maker (Vision Scientific Co, Korea) 등이다.
- 본 실험을 위해서 ethyl alcohol (Samchun Chemical, Korea), DMSO (Sigma, USA), DMEM (Sigma, USA), 1×PBS (Sigma, USA), EDTA (Sigma, USA), isopropanol (Sigma, USA), trypsin-EDTA (Sigma, USA), Bio-Plex cytokine assay kit (Panomics, USA) 등이 사용 되었다.
- 실험에 사용된 淫羊藿(Epimedii Herba, Epimedium koreanum Nakai)은 한국 서울의 경동시장에서 2007년 10월에 구입하였으며, 약재의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과대학 본초학교실에서 감정하였고(No. 2007-1012) 모든 약재는 쓰기 전에 초음파 세척기(Branson, USA)를 이용하여 불순물을 제거하고 실험에 사용하였다. 淫羊藿의 발효에 사용한 균주로는 효모 균주 중 Saccharomyces cerevisiae STV89를 사용하였다.
- 실험에 사용된 대식세포는 마우스 복강 대식세포(mouse macrophage line)인 Raw 264.7 세포로서 한국세포주은행 (KCLB, Korea)으로부터 구입하여 사용하였다.
- . 이에 본 실험에서는 Saccharomyces cerevisiae STV89(효모)를 균주로 이용하여 발효하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 mean ± SD로 나타내 었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test와 ANOVA test로 분석하여 p-value값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 세포내의 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)의 생성양은 dihydrorhodamine 123(DHR) assay를 이용하여 측정하였다. 먼저, 96 well plate 1×104 cells/well의 cell을 100 ㎕씩 넣고 37℃, 5 % CO2 Incubator에서 24시간동안 배양 한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다.
- 준비된 시료가 Raw 264.7 세포의 증식율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 96 well plate에 1×104 cells/well의 세포를 100㎕씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 phosphate buffered saline(1×PBS) 용액으로 씻어주었다.
성능/효과
- 1. 淫羊藿 발효 추출물은 대식세포에서 세포증식율 감소를 유발하지 않았다.
- 2. 淫羊藿 발효 추출물은 정상 대식세포의 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2) 생성을 유의하게 증가시켰다.
- EHS가 대식 세포의 증식에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간 배양처리 한 결과 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 세포증식율이 증가하였다(Fig. 1).
- EHS가 정상 대식세포의 산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간의 배양 결과, 25 ㎍/mL이상의 농도에서 유의한 감소를 나타내었다(Fig. 3).
- ) 생성에 미치는 영향을 비교하였다. 24시간의 배양결과, 50 ㎍/mL 이상의 농도에서 유의한 증가를 나타내었다(Fig. 2).
- 28) 그러나 감염 등으로 유발되는 인체의 염증반응에 있어서 NO의 과잉생성은 급만성의 염증질환 발생·악화와 연관되어진다고 할 수 있다.
- 29,30) EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 TNF-α 생성 증가에 미치는 영향을 비교했을 때 3 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 TNF-α 생성이 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL이상의 모든 농도에서 모두 유의하게 감소되었다.
- 3. 淫羊藿 발효 추출물은 정상 대식세포의 산화 질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제시켰으며, 또한 LPS로 활성화된 대식세포의 NO 생성 증가를 유의하게 감소시켰다.
- 31,32) EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였는데 3 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으 며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍ /mL 이상의 모든 농도에서 모두 유의하게 감소되었다.
- 4. 淫羊藿 발효 추출물은 LPS로 활성화된 대식세포에서 TNF-α와 IL-6 생성을 모두 유의하게 감소시켰다.
- 그 결과, 24 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal) 보다 NO 생성이 유의하게 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 EHS는 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소 되었다. 48 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우에도 정상군 (Normal) 보다 NO 생성이 유의하게 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 EHS는 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소되었다(Fig. 4).
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포로부터 NO의 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 24 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal) 보다 NO 생성이 유의하게 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 EHS는 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소 되었다. 48 시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우에도 정상군 (Normal) 보다 NO 생성이 유의하게 증가하였으며 LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 EHS는 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 유의하게 감소되었다(Fig.
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 24시간동안 LPS 단독으로 배양 한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 MCP-1 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 일 때만 유의하게 감소되었다.
- 그 결과, 24시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 IL-1β 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 일 때만 유의하게 감소되었다.
- EHS가 LPS로 활성화된 대식세포에서 IL-6 생성 증가에 미치는 영향을 비교하였다. 그 결과, 3시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 IL-6 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 모두 유의하게 감소되었다(Fig. 6).
- 그 결과, 3시간동안 LPS 단독으로 배양한 경우 정상군(Normal)보다 유의하게 TNF-α 생성이 증가하였으며, LPS로 활성화된 대식세포에 EHS를 처리한 경우 25, 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 모두 유의하게 감소되었다(Fig. 5).
- 7에 발효 淫羊藿 추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리하여 세포증식율에 대한 영향을 검사한 결과, 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 발효 淫羊藿 추출물이 세포증식율 감소를 나타내지 않았으며 이는 발효 淫羊藿 추출물이 세포독성을 유발하 지 않는다는 것으로 볼 수 있다. 또한 50 ㎍/mL 이상의 농도에서는 세포증식율을 유의하게 증가시키는 것이 확인되었는데, 이는 본 추출물이 대식세포의 수를 늘림으로써 면역기능 을 강화하는 것으로 해석될 수 있을 것이다. 이와 같은 결과를 바탕으로 다음 단계의 실험에서는 200 혹은 100 ㎍/mL의 농도까지 사용하였다.
- 그러므로 여러 가지 산화적 반응을 일으키는 물질들로 인해 mouse의 대식세포 내에서 발생하는 reactive oxygen species(ROS)의 수준을 dihydrorhodamine 123(DHR) assay을 이용하여 측정할 수 있다. 본 연구결과 EHS는 50 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 대식세포로부터의 과산화수소 생성을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다. 비록 EHS에 의한 세포증식율 증가에는 미치지 못하지만, 유의한 증가가 나타났다는 것은 EHS가 대식세포의 항병(抗病)능력을 감퇴시키지 않음을 의미하는 것이다.
- 본 연구를 통해 발효 淫羊藿(EHS)의 염증억제작용에 대한 효과는 확인한 결과 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서의 NO, TNF-α 그리고 IL-6의 생성 증가가 억제됨을 확인하였으며, 이는 EHS가 면역조절 사이토카인의 발현을 조절함으로써 염증 반응 조절 효능이 있음을 의미하는 것이다.
- 28) 그러나 감염 등으로 유발되는 인체의 염증반응에 있어서 NO의 과잉생성은 급만성의 염증질환 발생·악화와 연관되어진다고 할 수 있다. 본 연구에서 EHS는 24시간에서 25 ㎍/mL이상의 모든 농도에서 대식세포로부터 NO의 생성을 감소시켰으며, 또한 LPS로 활성화된 대식세포에서는 24시간의 배양에서 25, 50, 100 ㎍ /mL일 때, 48시간의 배양에서는 50, 100 ㎍/mL의 농도에서 NO 생성증가를 유의하게 억제시키는 것으로 나타났다. 이는 EHS가 활성화된 대식세포로부터 분비되는 NO의 증가를 효과적으로 억제함으로써 NO 증가로 악화될 수 있는 급성 혹은 만성의 염증반응을 제어할 수 있는 효능을 가지고 있음을 의미한다.
- 본 연구에서는 마우스 대식세포인 Raw 264.7에 발효 淫羊藿 추출물을 25, 50, 100, 200 ㎍/mL의 농도로 처리하여 세포증식율에 대한 영향을 검사한 결과, 25 ㎍/mL 이상의 모든 농도에서 발효 淫羊藿 추출물이 세포증식율 감소를 나타내지 않았으며 이는 발효 淫羊藿 추출물이 세포독성을 유발하 지 않는다는 것으로 볼 수 있다. 또한 50 ㎍/mL 이상의 농도에서는 세포증식율을 유의하게 증가시키는 것이 확인되었는데, 이는 본 추출물이 대식세포의 수를 늘림으로써 면역기능 을 강화하는 것으로 해석될 수 있을 것이다.
- 이상의 결과, 발효 淫羊藿 추출물은 대식세포에 세포증식율 감소를 유발하지 않는 농도에서 과산화수소 생성 증가 및 활성화된 대식세포로부터 산화질소의 생성과 면역조절 사이토카인의 생성을 억제함으로써 유의한 면역활성을 가지는 것으로 나타났다.
- 이상의 결과, 발효 淫羊藿 추출물은 대식세포에 세포증식율 감소를 유발하지 않는 농도에서 과산화수소의 생성을 증가 시키고 산화질소의 생성을 감소시켰으며 LPS로 활성화된 대식세포에서 산화질소와 TNF-α, IL-6의 면역사이토카인 생성 증가를 억제시킴으로써 유의한 면역조절 활성이 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과, 발효 淫羊藿 추출물은 대식세포에 세포증식율 감소를 유발하지 않는 농도에서 과산화수소의 생성을 증가 시키고 산화질소의 생성을 감소시켰으며 LPS로 활성화된 대식세포에서 산화질소와 TNF-α, IL-6의 면역사이토카인 생성 증가를 억제시킴으로써 유의한 면역조절 활성이 있음을 알 수 있었다. 앞으로 발효 淫羊藿 추출물을 이용한 대식세포 연관 면역질환 치료제로의 개발을 위하여 더욱 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.