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문제 정의
- 본 연구는 민들레의 추출물을 Rat에 경구 투여 후 X선을 전신 조사하여 적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 혈구수와 생화학적 검사를 시행하고, 소장융모세포 사멸 기작과 형태학적 변화를 관찰하여 민들레 추출물의 방사선 방호효과를 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 전통적으로 약용으로 효능이 탁월하다고 알려져 있는 민들레 추출물을 Rat에 투여하여 10Gy의 고에너지 방사선을 조사 시킨 후 1일, 7일, 14일 기간에 따른 혈구 구성성분, 혈액성분의 생화학적 검사, 소장융모세포 괴사 관찰을 통하여 민들레 추출물의 방사선 방호 작용을 알아보고자 하였다. 실험 결과 백혈구, 적혈구 보다 혈소판에서 유의한 결과를 확인하였다.
제안 방법
- Rat에 10Gy 에너지 방사선 전신 조사 후 14일간 경과에 따른 혈액의 생화학적 변화를 관찰하였다. 알부민과글로블린의 함량은 민들레 섭식군과 방사선 조사군의 큰 차이가 없었으나 총 단백질의 함량은 민들레 섭식군에 비해 방사선만 조사된 실험군의 감소폭이 높았다.
- Rat에 방사선종양치료기를 이용하여 10Gy의 X-선을 조사 시킨 후 민들레 추출물의 방사선방어효과 연구를 진행하였다. 민들레 추출물 섭식군은 대조군에 비하여 방사선에 의한 혈소판 손상을 감소시키고 간 손상을 억제하며 생체 면역계에 대해 소장융모세포의 apoptosis를 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다.
- 광학 현미경 관찰에 사용할 간 및 소장은 10% FAA 로 고정한 뒤, 일반적인 paraffin method에 따라 표본을 제작하였다. 고정된 조직은 ethyl alcohol을 사용하여 탈수하였고, xylene으로 치환한 후 paraffin block을 제작하여 박절 후 hematoxylene 과 eosin으로 H-E stain 을 염색하여 관찰하였다.
- 광학 현미경 관찰에 사용할 간 및 소장은 10% FAA 로 고정한 뒤, 일반적인 paraffin method에 따라 표본을 제작하였다. 고정된 조직은 ethyl alcohol을 사용하여 탈수하였고, xylene으로 치환한 후 paraffin block을 제작하여 박절 후 hematoxylene 과 eosin으로 H-E stain 을 염색하여 관찰하였다.
- 민들레 추출물 섭식 후 10Gy 방사선 전신 조사 한 Rat을 대조군과 민들레 섭식군으로 나누어 1일, 7일 경과 후 소장 융모세포 괴사 변화를 관찰하였다. 소장 하나 당 양 끝과 가운데 세 부분을 잘라 각 부분에서 다시 10시, 2시, 6시 방향으로 나누어 총 6방향을 400배 시야에서 소장 융모세포의 apoptosis의 개수를 조사하였다.
- 민들레(Taraxacum officinale)는 강원도 정선에 소재한 정선아리아리원에서 100% 동결건조하여 추출한 분말을 구입하여 생리식염수에 녹여 0.01㎎/㎖의 농도로 실험동물의 체중을 측정하여 경구투여 하였다.
- 방사선 조사 후 1일, 7일, 14일 간격으로 실험을 하였다, 혈액 시료는 전신 마취 후 복부를 절개하여 복강 동맥에서 전혈을 채취하여 혈구검사를 실시하였으며, 생화학검사는 3,000 rpm으로 원심분리 후 혈장을 시료로 하여 분석하였다.
- 민들레 추출물 섭식 후 10Gy 방사선 전신 조사 한 Rat을 대조군과 민들레 섭식군으로 나누어 1일, 7일 경과 후 소장 융모세포 괴사 변화를 관찰하였다. 소장 하나 당 양 끝과 가운데 세 부분을 잘라 각 부분에서 다시 10시, 2시, 6시 방향으로 나누어 총 6방향을 400배 시야에서 소장 융모세포의 apoptosis의 개수를 조사하였다. 대조군의 소장 융모 세포의 괴사 정도는 평균 3.
- 실험동물은 생후 4주된 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley Rat) 36마리를 효창사이언스(Daegu, Korea)로부터 구입하여 실내온도 20~22℃, 명암주기 12시간 cycle 조건의 사육실에서 표준사료와 탈이온수를 완전 자유급식으로 2주간 공급하여 환경에 적응시킨 후, 6주령이 되었을 때 그룹으로 나누어 민들레 추출물 식이를 경구투여 하였다. 실험군은 대조군, 민들레추출물 투여군, 방사선조사군으로 나누어 실험하였다[표 1].
- 조사방법은 Rat을 5마리씩 특수 제작한 30×30 아크릴 case에 넣은 다음 Depth 3㎝에 100% 에너지가 되도록 6Mev 에너지로 10Gy를 조사하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 생후 4주된 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley Rat) 36마리를 효창사이언스(Daegu, Korea)로부터 구입하여 실내온도 20~22℃, 명암주기 12시간 cycle 조건의 사육실에서 표준사료와 탈이온수를 완전 자유급식으로 2주간 공급하여 환경에 적응시킨 후, 6주령이 되었을 때 그룹으로 나누어 민들레 추출물 식이를 경구투여 하였다. 실험군은 대조군, 민들레추출물 투여군, 방사선조사군으로 나누어 실험하였다[표 1].
- 실험동물의 X-선 조사는 임상병원에서 종양치료에 사용되고 있는 선형가속기(Electa Linac, Sweden)를 이용하였다. 조사방법은 Rat을 5마리씩 특수 제작한 30×30 아크릴 case에 넣은 다음 Depth 3㎝에 100% 에너지가 되도록 6Mev 에너지로 10Gy를 조사하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 SPSS/PC+ package를 사용하여 분석하여 평균 ±표준편차로 표시하였으며 일원배치분산 분석으로 비교하여 Duncan 다중범위 분석에 의해 각 실험 군 간의 유의성을 p<0.05 수준에서 검정하였다.
성능/효과
- 10Gy 전신 방사선 조사 후 7일된 소장(small intestine) 조직에서 민들레 추출물의 섭식 결과, 정상 소장 조직([그림 2] A)과 비교한 방사선 조사군에서는 융모로 덮여 있는 돌림주름(Plica circularis: PC)의 간격이 넓게 관찰되었다. 이는 흡수상피세포로서 물질에서 영양분 흡수와 관련이 있는 세포이다.
- 간 조직 손상 지표인 ALT, AST, GGT는 민들레 섭식군에 비해 방사선 조사군의 농도가 크게 증가하는 경향을 보였으나 ALP 농도는 오히려 방사선 조사군에서 감소한 것으로 나타났다. BUN과 creatinine의 농도에 미치는 영향을 살펴보면 방사선만 조사된 실험군에서 BUN과 creatinine 농도 모두가 감소하는 경향을 보였으며 glubulin 농도는 증가하는 것을 볼 수 있다[표 3].
- 알부민과글로블린의 함량은 민들레 섭식군과 방사선 조사군의 큰 차이가 없었으나 총 단백질의 함량은 민들레 섭식군에 비해 방사선만 조사된 실험군의 감소폭이 높았다. 간 조직 손상 지표인 ALT, AST, GGT는 민들레 섭식군에 비해 방사선 조사군의 농도가 크게 증가하는 경향을 보였으나 ALP 농도는 오히려 방사선 조사군에서 감소한 것으로 나타났다. BUN과 creatinine의 농도에 미치는 영향을 살펴보면 방사선만 조사된 실험군에서 BUN과 creatinine 농도 모두가 감소하는 경향을 보였으며 glubulin 농도는 증가하는 것을 볼 수 있다[표 3].
- 소장 하나 당 양 끝과 가운데 세 부분을 잘라 각 부분에서 다시 10시, 2시, 6시 방향으로 나누어 총 6방향을 400배 시야에서 소장 융모세포의 apoptosis의 개수를 조사하였다. 대조군의 소장 융모 세포의 괴사 정도는 평균 3.5개에서 4.5개인데 반해 방사선 조사 후 1일 경과 후의 실험 군에서는 7.3개로 높게 나타났으나 민들레 추출물 섭식후 방사선 조사군에서는 5.2개로 감소된 것을 볼 수 있었다. 방사선 조사 7일 후 소장융모세포 괴사 관찰에서는 민들레 추출물 섭식 후 방사선 조사 실험군은 4.
- 민들레 추출물 섭식군은 대조군에 비하여 방사선에 의한 혈소판 손상을 감소시키고 간 손상을 억제하며 생체 면역계에 대해 소장융모세포의 apoptosis를 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 민들레 추출물의 투여가 방사선 조사에 의한 소장조직의 손상을 감소시켜 떨어진 생체에서 면역 활성 효과가 있음을 확인하였다.
- Apoptosis에 의한 세포사는 DNA 손상에 의한 급성효과의 결과로 인식할 수 있는데 소장의 융모세포는 성숙개체에서 가장 빠르게 증식하는 세포로써 각 융모는 250개의 세포로 구성되어 있으며 이 중 약 150개가 세포증식주기에 포함되어 있다고 알려져 있다[14]. 또한 소장 조직의 광학현미경학적 관찰에서는 방사선 조사군은 영양분 흡수와 관련되어 있는 흡수상피세포의 돌림주름의 간격이 넓게 관찰되었으며 혈관과 림프관이 존재하는 점막밑조직층에 염증이 발생되어 막의 형태만 남아있는 공포가 관찰되는 반면 민들레 추출물 섭식 방사선 조사군에서는 장막과 바깥세로막, 점막하층에서도 일정한 조직 구성을 보였으며 동맥혈관의 내막과 외막에서도 방사선 조사로 인한 특이한 손상이 보이지 않았다.
- 점막근육판 안쪽의 횡단면 창자샘(crypt)에서는 내분비세포(endocrine cell :E)들이 핵과 세포질사이가 부풀어 있었으며 불규칙한 모양으로 헝클러져 기능을 하지 못하는 것으로 보였다. 또한 외막에서도 선예한 경계선을 보이지 않고 주변 조직들과 섞여 외막손상(DM) 이 확인되었다. 민들레 섭식군에서는 속돌림층 주변의 횡단조직들이 정상적인 형태를 보이고 동맥혈관의 내막과 외막에서도 특이한 손상이 확인되지 않은 것으로 나타났다([그림 3] E).
- 일반적으로 방사선에 가장 민감한 백혈구의 변화가 먼저 일어날 것으로 예상하였으나 이번 연구에서는 10Gy 고에너지를 조사하여 임파구를 생성하는 조혈기관이 완전히 손상을 입어 백혈구 수치가 낮게 나온 것으로 사료된다. 또한 혈액의 생화학적 검사 중 ALT, AST, GGT 등의 간 지표 항목에서 방사선 조사군 보다 민들레 추출물을 섭식한 군에서 유의하게 증가한 것을 볼 수 있는데 이는 민들레가 간 조직을 안정화하여 간을 보호하는 효능이 있다는 것으로 사료된다. 소장 융모세포에서 세포사 발생률을 관찰한 결과, 민들레 추출물 섭식한방사선 조사군이 방사선 대조군과 비교하여 2배 이상의 유의한 차이를 보였다.
- 민들레 추출물 섭식 후 방사선 조사 후 14일된 Rat의 혈구 중 혈소판(Platelet)의 수치가 가장 큰 변화가 보였다[표 2]. 민들레 추출물 섭식 실험군은 방사선 조사 실험군 보다 혈소판의 감소량이 약 3배가량 증가한 것을 알 수 있으며 방사선에 가장 민감한 백혈구의 경우에는 민들레 섭식에 큰 변화를 보이지 않는 것으로 관찰되었다. 적혈구는 민들레 섭식에 따라 증가하였으며 이에 따라 적혈구에 영향을 많이 받는 헤모글로빈 함량과 PCV(적혈구용적), MCV(평균적혈구용적), MCH(평균적혈구헤모글로빈), MCHC(평균적혈구헤모글로빈농도) 또한 일정 수준 증가한 것으로 조사 되었다.
- 민들레 추출물 섭식 후 방사선 조사 후 14일된 Rat의 혈구 중 혈소판(Platelet)의 수치가 가장 큰 변화가 보였다[표 2]. 민들레 추출물 섭식 실험군은 방사선 조사 실험군 보다 혈소판의 감소량이 약 3배가량 증가한 것을 알 수 있으며 방사선에 가장 민감한 백혈구의 경우에는 민들레 섭식에 큰 변화를 보이지 않는 것으로 관찰되었다.
- Rat에 방사선종양치료기를 이용하여 10Gy의 X-선을 조사 시킨 후 민들레 추출물의 방사선방어효과 연구를 진행하였다. 민들레 추출물 섭식군은 대조군에 비하여 방사선에 의한 혈소판 손상을 감소시키고 간 손상을 억제하며 생체 면역계에 대해 소장융모세포의 apoptosis를 효과적으로 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 민들레 추출물의 투여가 방사선 조사에 의한 소장조직의 손상을 감소시켜 떨어진 생체에서 면역 활성 효과가 있음을 확인하였다.
- 하지만 근육으로 구성된 바깥세로층(LM)의 두께는 일정하고 조밀한 형태로 관찰되었으며 점액을 생산하는 술잔세포(Gc)는 대조군과 같이 일정한 모습으로 확인되었다([그림 2] C). 민들레추출물 섭식 후 방사선 조사한 실험군에서는 술잔세포(Gc)가 선명하고 조밀하게 분포된 것으로 나타났다. 장막과 바깥세로막에 분포된 근육조직층의 두께에는 정상조직과 차이가 없었다.
- 2개로 감소된 것을 볼 수 있었다. 방사선 조사 7일 후 소장융모세포 괴사 관찰에서는 민들레 추출물 섭식 후 방사선 조사 실험군은 4.3개로 오히려 1일 때 보다 감소하였으나 방사선 조사군은 8개로 유의하게 증가하는 것을 관찰 할 수 있었다[그림 1].
- 또한 혈액의 생화학적 검사 중 ALT, AST, GGT 등의 간 지표 항목에서 방사선 조사군 보다 민들레 추출물을 섭식한 군에서 유의하게 증가한 것을 볼 수 있는데 이는 민들레가 간 조직을 안정화하여 간을 보호하는 효능이 있다는 것으로 사료된다. 소장 융모세포에서 세포사 발생률을 관찰한 결과, 민들레 추출물 섭식한방사선 조사군이 방사선 대조군과 비교하여 2배 이상의 유의한 차이를 보였다. Apoptosis에 의한 세포사는 DNA 손상에 의한 급성효과의 결과로 인식할 수 있는데 소장의 융모세포는 성숙개체에서 가장 빠르게 증식하는 세포로써 각 융모는 250개의 세포로 구성되어 있으며 이 중 약 150개가 세포증식주기에 포함되어 있다고 알려져 있다[14].
- 본 연구는 전통적으로 약용으로 효능이 탁월하다고 알려져 있는 민들레 추출물을 Rat에 투여하여 10Gy의 고에너지 방사선을 조사 시킨 후 1일, 7일, 14일 기간에 따른 혈구 구성성분, 혈액성분의 생화학적 검사, 소장융모세포 괴사 관찰을 통하여 민들레 추출물의 방사선 방호 작용을 알아보고자 하였다. 실험 결과 백혈구, 적혈구 보다 혈소판에서 유의한 결과를 확인하였다. 일반적으로 방사선에 가장 민감한 백혈구의 변화가 먼저 일어날 것으로 예상하였으나 이번 연구에서는 10Gy 고에너지를 조사하여 임파구를 생성하는 조혈기관이 완전히 손상을 입어 백혈구 수치가 낮게 나온 것으로 사료된다.
- Rat에 10Gy 에너지 방사선 전신 조사 후 14일간 경과에 따른 혈액의 생화학적 변화를 관찰하였다. 알부민과글로블린의 함량은 민들레 섭식군과 방사선 조사군의 큰 차이가 없었으나 총 단백질의 함량은 민들레 섭식군에 비해 방사선만 조사된 실험군의 감소폭이 높았다. 간 조직 손상 지표인 ALT, AST, GGT는 민들레 섭식군에 비해 방사선 조사군의 농도가 크게 증가하는 경향을 보였으나 ALP 농도는 오히려 방사선 조사군에서 감소한 것으로 나타났다.
- 실험 결과 백혈구, 적혈구 보다 혈소판에서 유의한 결과를 확인하였다. 일반적으로 방사선에 가장 민감한 백혈구의 변화가 먼저 일어날 것으로 예상하였으나 이번 연구에서는 10Gy 고에너지를 조사하여 임파구를 생성하는 조혈기관이 완전히 손상을 입어 백혈구 수치가 낮게 나온 것으로 사료된다. 또한 혈액의 생화학적 검사 중 ALT, AST, GGT 등의 간 지표 항목에서 방사선 조사군 보다 민들레 추출물을 섭식한 군에서 유의하게 증가한 것을 볼 수 있는데 이는 민들레가 간 조직을 안정화하여 간을 보호하는 효능이 있다는 것으로 사료된다.
- 민들레 추출물 섭식 실험군은 방사선 조사 실험군 보다 혈소판의 감소량이 약 3배가량 증가한 것을 알 수 있으며 방사선에 가장 민감한 백혈구의 경우에는 민들레 섭식에 큰 변화를 보이지 않는 것으로 관찰되었다. 적혈구는 민들레 섭식에 따라 증가하였으며 이에 따라 적혈구에 영향을 많이 받는 헤모글로빈 함량과 PCV(적혈구용적), MCV(평균적혈구용적), MCH(평균적혈구헤모글로빈), MCHC(평균적혈구헤모글로빈농도) 또한 일정 수준 증가한 것으로 조사 되었다.
- 이는 흡수상피세포로서 물질에서 영양분 흡수와 관련이 있는 세포이다. 혈관과 림프관이 발달되어 있는 점막밑조직층(submucosa :SM)의 일부분에서는 염증(IM)과 관련된 형태로 염색이 잘되지 않은 조직이 확인되었으며, 속돌림층(CM) 주변의 횡단면 세포에서도 조직의 일부가 손상(Da)되어 가장자리에는 막의 형태만 남아있는 공포(Vc)가 관찰되었다. 하지만 근육으로 구성된 바깥세로층(LM)의 두께는 일정하고 조밀한 형태로 관찰되었으며 점액을 생산하는 술잔세포(Gc)는 대조군과 같이 일정한 모습으로 확인되었다([그림 2] C).
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