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문제 정의
- 본 연구결과는 백하수오의 세포독성 확인 및 항산화 효과와 반추위내 휘발성 지방산 생성, 메탄가스 발생량, 단백질 대사 등 반추 위발효에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. 세포는 3T3-L1 세포와 C2C12에서 Alamar blue를 이용하여 독성을 확인하였으 며, 반추위액을 백하수오 분말과 함께 혼합 한 후 12시간 또는 24시간 in vitro 배양하였다.
- , 2011). 이와 같이 다양한 기능을 가진 천연추출물의 탐색을 통해 반추위 발효 조절이 가능할 것으로 생각되며, 본 연구에 서는 항균효과 등 생리활성기능으로 알려진 백하수오의 추출물을 이용하여 반추위 발효 성상 변화 및 메탄가스 생성조절에 대해 조사하였다.
제안 방법
- In vitro 배양액의 가스발생량은 압력변환 기 LANA/CENA-USP (Piracicaba, SP Brazil)을 사용하여 Mauricio 등 (1999)의 방법에 따라 분석하였다. 160 ml 혈청병에 희석한 반추위 용액 75 ml를 취하고 백하수오 분말 0.5g을 넣은 후 고무마개로 밀봉하고 흔들어 준 뒤 39℃에 인큐베이터 넣고 매뉴얼에 따라 흔들어 주며 발생가스를 측정하였다.
- 10% 로 나타났다. 160 ml 혈청병을 이용하여 티모시 등 조사료를 백하수오 첨가 또는 무첨가 반추위 용액 내에 첨가하여 (2:1 v/v) 기질로 이용하였다. 배양시간은 24시간 및 48시간 동안 실시하였다.
- Fig. 1에서는 지방전구 세포인 3T3-L1 cell 과 근섬유 세포인 C2C12 cell을 이용하여 백하수오 추출물의 세포독성을 확인하였다. 처리농도는 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖으로 실시하였으며, 처리 후 24시간 48시간에 따른 세포 독성을 조사하였다.
- Table 3에서는 미생물 활성에 따른 백하수 오 추출물의 반추위내 대사활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 암모니아태 질소를 측정 하였다. 본 실험결과 12시간과 24시간 배양 에서 시험구간 유의적인 차이가 없었다.
- 메탄가스분석은 Shimadzu 2014 gas chromatography를 이용하여 분석하였으며 열전도 검출기를 이용하여 검출하였다. 메탄가스 분리 는 ShinCarbon ST micro-packed column을 이 용하여 분리하였다.
- 세포는 3T3-L1 세포와 C2C12에서 Alamar blue를 이용하여 독성을 확인하였으 며, 반추위액을 백하수오 분말과 함께 혼합 한 후 12시간 또는 24시간 in vitro 배양하였다. 배양기간별 샘플링을 실시하여 pH, 휘발성 지방산 그리고 메탄가스 생성량을 측정하 였다. 3T3-L1 cell 에서는 처리 후 48시간이 경과하자 800 ㎍/㎖에서 대조구에 비하여 감소하는 것으로 나타났으며, 근섬유세포주인 C2C12 cell 에서는 처리 후 48시간 군에서는 100 ㎍/㎖에서부터 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.
- 160 ml 혈청병을 이용하여 티모시 등 조사료를 백하수오 첨가 또는 무첨가 반추위 용액 내에 첨가하여 (2:1 v/v) 기질로 이용하였다. 배양시간은 24시간 및 48시간 동안 실시하였다.
- cells을 분주하였다. 백하수오 추출물을 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 이를 37℃, 5% CO2 incubator에서 12시간과 24시간 동안 각 각 배양한 후, Alamar Blue 시약을 처리하였 으며, 시약을 처리 후, 3시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 뒤 ELISA reader기를 이용하여 570/600 nm로 흡광도를 측정하였다.
- 백하수오를 통풍건조기를 이용하여 50℃ 에서 충분히 건조시켜 그라인더로 파쇄한 후 1 mm sieve로 걸러 얻어진 고운 파우더를 사료내 1% 및 반추위용액 내 0.02%가 되도록 첨가하여 실험에 이용하였다.
- 백하수오의 세포생존능력을 확인하기 위하여 Alamar Blue (invitrogen Co, USA)를 실행 하였으며, 3T3-L1 cell과 C2C12 cell을 각각 96well plate에 well당 1×104 cells을 분주하였다.
- 백하수오 추출물을 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 이를 37℃, 5% CO2 incubator에서 12시간과 24시간 동안 각 각 배양한 후, Alamar Blue 시약을 처리하였 으며, 시약을 처리 후, 3시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 뒤 ELISA reader기를 이용하여 570/600 nm로 흡광도를 측정하였다.
- 1에서는 지방전구 세포인 3T3-L1 cell 과 근섬유 세포인 C2C12 cell을 이용하여 백하수오 추출물의 세포독성을 확인하였다. 처리농도는 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖으로 실시하였으며, 처리 후 24시간 48시간에 따른 세포 독성을 조사하였다. 실험 결과 지방전 구세포인 3T3-L1 cell 에서는 농도 및 시간에 따른 세포독성은 거의 나타나지 않았으나 800 ㎍/㎖ 처리 후 48시간이 경과하자 control에 비하여 감소하는 것을 확인하였다.
- 검출기 및 칼럼 내 온도는 각각 250℃ 및 60℃로 유지하였다. 최종 가스 발생량은 적정 농도구간 내에서 표준가스 농도의 면적에 따른 직선 회귀식을 작성하고 분석샘플 면적에 따른 농도를 구하였다.
대상 데이터
- 세포독성을 조사하기 위하여 중국산 백하수오를 구입하여 백하수오 샘플 무게의 10배의 물을 가한 후, 95~100℃, 6시간 동안 열수 추출하여 3000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 상등액을 얻은 다음 진공여과기를 이용하여 여과지 (No.4)로 거른 후 여액을 동결건조하여 실험에 이용하였다.
- 실험에 사용한 3T3-L1 마우스 지방전구세 포와 C2C12 마우스 근섬유세포는 한국세포주은행에서 분양 받았으며, 90%의 DMEM (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)와 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, Gibco BRL, USA)가 포함된 성장배지를 사용하여 배양하 였다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험데이터는 General Linear Model Procedure 를 이용하여 ANOVA 분석법을 통해 분산분석을 실시하였으며 각 평균값에 대해서는 T-test (SAS, 2000)를 실시하여 유의성(* : p< 0.05, ** : p<0.01)을 검정하였다.
이론/모형
- In vitro 배양액의 가스발생량은 압력변환 기 LANA/CENA-USP (Piracicaba, SP Brazil)을 사용하여 Mauricio 등 (1999)의 방법에 따라 분석하였다. 160 ml 혈청병에 희석한 반추위 용액 75 ml를 취하고 백하수오 분말 0.
- In vitro 배양액의 휘발성 지방산 분석은Erwin (1961) 방법에 준하여 분석하였다. 배양 이 완료된 배양물을 10 ml 정도 취하여 거즈 로 거른 후 여액 5 ml를 15 ml 원심튜브에 넣 고 HgCl2 0.
- 지질과산화를 측정하는 방법으로 과산화지표인 Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS)는 ZeptoMetrix의 Assay Kit를 이용 하여 Ohkawa 등 (1979)이 기술한 방법으로 Thiobarbituric acid (TBA)와 반응하는 물질을 추출하여 측정 하였다. 혈장 0.
성능/효과
- 배양기간별 샘플링을 실시하여 pH, 휘발성 지방산 그리고 메탄가스 생성량을 측정하 였다. 3T3-L1 cell 에서는 처리 후 48시간이 경과하자 800 ㎍/㎖에서 대조구에 비하여 감소하는 것으로 나타났으며, 근섬유세포주인 C2C12 cell 에서는 처리 후 48시간 군에서는 100 ㎍/㎖에서부터 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 또한 항산화 실험결과 TBARS 저해 능력이 농도에 따라 증가하는 경향을 보였다.
- Fig. 2에서는 백하수오 추출물이 항산화 효과를 확인한 결과로 실험결과 TBARS inhibition 능력이 농도에 따라 증가하는 경향이 나타났다.
- 또한 항산화 실험결과 TBARS 저해 능력이 농도에 따라 증가하는 경향을 보였다. In vitro 배양실험에서 pH 변화는 유의적인 차이가 없었으며 휘발성 지방산 생성은 백하수오 분말 처리구에서 증가하는 경향을 보였다. 또한 암모니아태 질소는 증가하는 경향을 보였다.
- 1 백만ton CO2eq. 과 1.2 백만ton CO2eq으로서 1990년에 비해 34.5%와 49.5% 증가하였으며 원인은 육류소 비 증가 추세에 따른 가축사육두수의 증가로 판단되었다. 하지만 가축은 우리에게 주요한 단백질을 제공해주는 매우 중요한 식량자원 중 하나이다.
- 실험결과로부터 백하수오의 12시간 처리구에서 메탄가스 발생량이 약 21% 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 백하수오의 24 시간 처리구에서는 감소했던 메탄가스량이 다시 증가하였는데 이는 총 휘발성 지방산 생산량의 증가와 관련이 있을 것으로 생각되는데 24시간 배양결과에서 acetate의 증가폭이 propionate보다 컸으며 propionate가 아닌 acetate 생성과정에서 발생되는 수소가 메탄 생성에 기여했을 것으로 판단된다.
- 실험 결과 지방전 구세포인 3T3-L1 cell 에서는 농도 및 시간에 따른 세포독성은 거의 나타나지 않았으나 800 ㎍/㎖ 처리 후 48시간이 경과하자 control에 비하여 감소하는 것을 확인하였다. 근섬유세포주인 C2C12 cell을 대상으로 한 결과에서는 처리 후 24시간 경과에서는 세포독성이 나타나지 않았으나 처리 후 48시간 군에서는 100 ㎍/㎖에서부터 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다. 다른 식물유래추출물의 연구결과와 유사하게 백하수오의 일정수준 이상의 첨가가 세포의 활성을 억제할 수 있음을 보여주었다 (Ok et al.
- In vitro 배양실험에서 pH 변화는 유의적인 차이가 없었으며 휘발성 지방산 생성은 백하수오 분말 처리구에서 증가하는 경향을 보였다. 또한 암모니아태 질소는 증가하는 경향을 보였다. 한편, 백하수오 분말의 12 시간 처리구에서 메탄가스 발생량이 유의하 게 감소한 것으로 나타났다.
- 3T3-L1 cell 에서는 처리 후 48시간이 경과하자 800 ㎍/㎖에서 대조구에 비하여 감소하는 것으로 나타났으며, 근섬유세포주인 C2C12 cell 에서는 처리 후 48시간 군에서는 100 ㎍/㎖에서부터 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 또한 항산화 실험결과 TBARS 저해 능력이 농도에 따라 증가하는 경향을 보였다. In vitro 배양실험에서 pH 변화는 유의적인 차이가 없었으며 휘발성 지방산 생성은 백하수오 분말 처리구에서 증가하는 경향을 보였다.
- 배양시간을 0, 12, 24시간 그룹으로 지정하여 수행한 결과 배양시간이 길어질 수록 대조군에 비해 백하수오 분말 처리구에서 acetate, propionate, iso-butylate, butylate의 농도가 전반적으로 증가하는 경향을 나타내었다 (P>0.05).
- 02%가 되도록 첨가하여 실험에 이용하였다. 백하수오 분말 의 일반성분분석 결과는 조단백질 8.64%, 조지방 1.13%, 조섬유 3.87%, 조회분 2.10% 로 나타났다. 160 ml 혈청병을 이용하여 티모시 등 조사료를 백하수오 첨가 또는 무첨가 반추위 용액 내에 첨가하여 (2:1 v/v) 기질로 이용하였다.
- , 1981). 본 시험의 결과로부터 백하수오 추출물이 박테리아와 프로토조아의 반추위 발효 모두에 영향을 미치지 않은 것으로 사료된다.
- Table 1에서는 미생물 활성에 따른 백하수오 추출물의 반추위 내 대사활성에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 본 실험결과 12시간, 24시간 배양결과 백하수오 분말에 의한 pH의 변화에 있어 유의적인 차이가 없었다. pH의 변화 및 총가스발생량은 발효속도와관련이 있다고 했는데(Yang et al.
- 처리농도는 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖으로 실시하였으며, 처리 후 24시간 48시간에 따른 세포 독성을 조사하였다. 실험 결과 지방전 구세포인 3T3-L1 cell 에서는 농도 및 시간에 따른 세포독성은 거의 나타나지 않았으나 800 ㎍/㎖ 처리 후 48시간이 경과하자 control에 비하여 감소하는 것을 확인하였다. 근섬유세포주인 C2C12 cell을 대상으로 한 결과에서는 처리 후 24시간 경과에서는 세포독성이 나타나지 않았으나 처리 후 48시간 군에서는 100 ㎍/㎖에서부터 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
- Table 2에서는 미생물 배양시간에 따른 백 하수오 추출물의 메탄가스 감소량을 확인하 였다. 실험결과로부터 백하수오의 12시간 처리구에서 메탄가스 발생량이 약 21% 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 백하수오의 24 시간 처리구에서는 감소했던 메탄가스량이 다시 증가하였는데 이는 총 휘발성 지방산 생산량의 증가와 관련이 있을 것으로 생각되는데 24시간 배양결과에서 acetate의 증가폭이 propionate보다 컸으며 propionate가 아닌 acetate 생성과정에서 발생되는 수소가 메탄 생성에 기여했을 것으로 판단된다.
- 한편, 백하수오 분말의 12 시간 처리구에서 메탄가스 발생량이 유의하 게 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과들을 종합할 때 백하수오 분말의 첨가급여는 휘발성 지방산 생성량을 증가시키며 메탄가스 발생을 줄일 가능성이 제시되었다. 결론적으로 백하수오는 항산화기능을 가진 반추위 발효 조절제로서의 역할이 기대된다.
- 또한 암모니아태 질소는 증가하는 경향을 보였다. 한편, 백하수오 분말의 12 시간 처리구에서 메탄가스 발생량이 유의하 게 감소한 것으로 나타났다. 이러한 결과들을 종합할 때 백하수오 분말의 첨가급여는 휘발성 지방산 생성량을 증가시키며 메탄가스 발생을 줄일 가능성이 제시되었다.
후속연구
- 이러한 결과들을 종합할 때 백하수오 분말의 첨가급여는 휘발성 지방산 생성량을 증가시키며 메탄가스 발생을 줄일 가능성이 제시되었다. 결론적으로 백하수오는 항산화기능을 가진 반추위 발효 조절제로서의 역할이 기대된다.
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