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문제 정의
- , 2008). 이에 본 연구에서는 경련 발작을 유도한 동물모델을 이용하여 간질의 병태생리학적 기전연구 및 치료제로서의 이용가능성이 있는 물질의 작용기전을 연구하고자 하였다. 파극천 추출물은 4주간 경구투여하고 수면연장에 어떠한 영향을 주는 가를 관찰하였던 바 pentobarbital로 유도한 생쥐의 수면유도 시간 및 수면시간이 정상군에 비하여 수면이 연장되는 경향을 보였다.
- 간질등과 같이 뇌조직의 퇴행성 기능장해를 초래하는 질환들의 병태생리학적 현상들은 활성산소중의 생성과 분해기구의 조절 증이 상실 되어질 때 잔존하는 과량의 활성산소들이 뇌조직 중의 불포화지방산을 과산화 시켜 세포막의 손상을 유도하는 산화적 스트레스 유도과정과 밀접한 관계를 갖고 있음이 밝혀지고 있다(Halliwell, 1992; Coyle and Puttfarcken, 1993). 이에 본 연구에서는 파극천의 메탄올 추출물을 이용하여 진정효과와 항 뇌전증 작용기전 및 시험관 내에서 파극천의 각 분획별로 항산화 작용을 검토하였다.
제안 방법
- 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 시료를 경구투여 한 30분 후 pentobarbital sodium(42 ㎎/㎏)을 복강 주사하였다. 15분 이내에 수면을 취하지 않는 동물은 실험에서 배제 하였고, 정향반사 소실을 지표로 수면효과를 관찰(정향 반사가 소실되는 시점부터 정향반사가 회복되는 시점까지의 시간)하였다. 대조물질로는 muscimol(0.
- 남은 여액에 n-butanol을 가하고 분리하여 butanol분획을 감압농축(21 g)하였다. Butanol분획에 다시 dichloromethane(CH2Cl2)을 가하여 혼합한 후 CH2Cl2로 이행되는 부분을 분별 깔대기에서 분리하여 감압농축하고 CH2Cl2 분획(8.5 g)으로 하였다. 이렇게 얻어진 파극천 추출물은 생리식염수에 용해한 1% CMC용액에 현탁(100, 200 mg/kg)하여 4주간 esophagus needle을 사용하여 경구로 투여하였으며, 대조군은 같은 방법으로 1% CMC 용액을 경구 투여하였다.
- 15분 이내에 수면을 취하지 않는 동물은 실험에서 배제 하였고, 정향반사 소실을 지표로 수면효과를 관찰(정향 반사가 소실되는 시점부터 정향반사가 회복되는 시점까지의 시간)하였다. 대조물질로는 muscimol(0.2 mg/kg)을 경구투여 하였다(Wolfman et al., 1996).
- , 1976)에 따라 경련발작 정도를 5단계로 구분하여 각 단계에서 발생하는 경련의 횟수의 곱을 모두 합하고 이 것을 다시 전체 경련횟수로 나누어 경련강도(severity)를 산출하였다. 또한, Vogel의 방법(Vogel. 2007)에 준하여 pentylenetetrazole(PTZ, 70 mg/kg, s.c.)을 주사하여 경련의 발현 및 사망의 유무를 관찰하였다. 항경련 효과는 PTZ 투여 후의 경련발작 발현시간(onset time), 경련 지속시간(duration of convulsion), 회복시간(recover time) 등을 측정하여 종합적인 현상을 참조한 경련상태 지표로 나타내었다.
- 생쥐 10마리를 한 군으로 하여 시료를 경구투여 한 30분 후 pentobarbital sodium(42 ㎎/㎏)을 복강 주사하였다. 15분 이내에 수면을 취하지 않는 동물은 실험에서 배제 하였고, 정향반사 소실을 지표로 수면효과를 관찰(정향 반사가 소실되는 시점부터 정향반사가 회복되는 시점까지의 시간)하였다.
- 이렇게 얻어진 파극천 추출물은 생리식염수에 용해한 1% CMC용액에 현탁(100, 200 mg/kg)하여 4주간 esophagus needle을 사용하여 경구로 투여하였으며, 대조군은 같은 방법으로 1% CMC 용액을 경구 투여하였다. 실험동물은 처치 전 12시간 동안 사료를 제거하고 물만 섭취하도록 하였다.
- 8)에 첨가한 후 빙냉의 ethanol로 제단백 시켰다. 이것을 원심분리 하여 얻은 상칭액을 membrane filter를 사용하여 여과한 다음 여액 중에 함유된 GABA의 함량을 고속액체 크로마토그래프를 이용하여 분리시킨 후 표준품의 유지시간(GABA: 11.3분)과 비교 확인한 후 표준 검량선에 준해 그 함량을 산정하였다. GABA의 함량은 조직 단백질 1 mg당 nmole로 나타내었다.
- 5 g)으로 하였다. 이렇게 얻어진 파극천 추출물은 생리식염수에 용해한 1% CMC용액에 현탁(100, 200 mg/kg)하여 4주간 esophagus needle을 사용하여 경구로 투여하였으며, 대조군은 같은 방법으로 1% CMC 용액을 경구 투여하였다. 실험동물은 처치 전 12시간 동안 사료를 제거하고 물만 섭취하도록 하였다.
- 파극천 추출물 투여에 의한 수면시간을 알아보기 위하여 4주간 파극천 추출물을 경구 투여하고, 투여 마지막 날 pentobarbital을 투여하고서 수면유도 및 수면시간을 관찰한 결과가 Table 1이다. 대조군의 수면유도시간은 3.
대상 데이터
- 본 시험에 사용한 ICR계 30-35 g의 수컷 생쥐를 효창사이언스㈜(대구, 한국)에서 구입하여 본 대학교 동물사에서 일정한 조건(온도: 22 ± 0.5℃, 습도: 46-60%, 명암 : 12시간 light/dark cycle)으로 1주 동안 검역과 순화 사육을 거친 건강한 동물로 실시되었다.
- 5℃, 습도: 46-60%, 명암 : 12시간 light/dark cycle)으로 1주 동안 검역과 순화 사육을 거친 건강한 동물로 실시되었다. 사료는 실험동물용 고형사료(천하제일사료, 대전, 한국), 음수는 상수도를 자유 섭취시켰다. 이때 효소 활성의 일중의 변동을 고려하여 실험동물을 일정시간(오전 10:00-12:00) 내에서 처치하였다.
- 실험재료는 부산진 시장(부산시 동구 범일동)의 약제상에서 구입하였으며 본 대학교 생물학과 문 성기 교수에게 검증을 받은 후 표본은 약학대학 생약학교실에 보관하고 있는 파극천을 먼지 등의 부착물을 제거할 목적으로 세척한 후 건조하여 사용하였다. 건조된 파극천을 분말로 하여 1 kg당 3L의 methanol을 가한 다음 70℃에서 5시간 간격으로 3회 반복추출하고 여과하여 methanol분획(243 g)을 얻고 농축하였다.
데이터처리
- Data are mean ± SD (n=6) and values sharing the same superscript letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- Values sharing the same superscript letter are not significantly different each other (p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치 ± 표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- Halliwell 등의 방법(Halliwell et al., 1987)에 따라 20 mM potassium dihydrogen phosphate-potassium hydroxide buffer(pH 7.4)에 2.8 mM deoxyribose, 100 μM ferric chloride, 104 μM ethylenediaminetetraacetic acid, 1 mM hydrogen peroxide, 100 μM ascorbate를 최종부피가 3 ml 되게 가하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켜 이때 hydroxyl radical에 의해 생성되는 malondialdehyde의 함량을 과산화지질 함량 측정법과 동일한 방법으로 측정하였다.
- Ohkawa 등의 방법(Ohkawa et al., 1979)에 준해 조직마쇄 균질액 일정량에 8.1% sodium dodesyl sulfate, 20% acetate buffer(pH 3.5) 및 0.8% thiobarbituric acid(TBA) 용액을 가해 95℃에서 1시간 동안 반응시키고 실온으로 냉각한 다음 생성된 홍색의 TBA reactive substance를 n-butanol : pyridine(15:1)혼액으로 이행시켜 파장 532 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 정량하였다. 과산화지질의 함량은 단백 1 mg당 malondialdehyde (MDA)의 양을 nmole로 나타내었다.
- 경련상태는 Roussinov 등의 방법(Roussinov et al., 1976)에 따라 경련발작 정도를 5단계로 구분하여 각 단계에서 발생하는 경련의 횟수의 곱을 모두 합하고 이 것을 다시 전체 경련횟수로 나누어 경련강도(severity)를 산출하였다. 또한, Vogel의 방법(Vogel.
성능/효과
- , 1984; Callaghan and Goggin, 1988). GABA-T의 활성은 PTZ 단독 투여군에서 정상군에 비해 약 40% 정도 증가하였으나, 파극천 추출물을 전처리한 군에서는 PTZ에 의하여 증가되던 효소의 활성에도 영향이 없었다. 이로 보아 파극천 추출물의 PTZ 유도에 항경련 작용은 중추신경계의 억제성 전달물질인 GABA의 농도와는 무관한 것으로 생각된다.
- PTZ로 경련을 유발시킨 실험동물에서의 뇌중 지질과산화의 함량을 관찰하였던바 대조군에 비하여 PTZ를 투여함으로서 현저히 증가되던 뇌조직중의 지질과산화의 함량이 파극천 추출물을 용량별로 4주간 전처리하고 PTZ를 투여함으로서 용량의존적으로 억제되었으며, PTZ로 유발된 뇌조직을 효소원으로 사용하여 시험관내에 파극천의 각 분획을 첨가하고서 수산기 소거능을 관찰하였을 때 부탄올 및 디클로로메탄분획을 각각 용량 별(5 × 10-2에서 20 x 10-2 g/ml)로 첨가함으서 약 35%에서 50%까지 감소시켰다.
- 13 NADPH nmole/mg protein/min)은 정상군에 비하여 약 85% 증가하였으며 파극천 추출물 200 mg/kg의 투여로 PTZ 투여군 보다 약 25% 정도 억제되었다. 대조 약물인 vigabatrin(100 mg/kg)의 투여로서 PTZ의 투여로 증가되던 효소의 활성이 정상군의 수준으로 회복되고 있음을 관찰 할 수 있었다.
- 대조군의 수면유도시간은 3.77 ± 0.56분, 수면시간 68.3 ± 6.8분이었으며, 파극천 추출물 100 mg/kg과 200 mg/kg을 전 처리하고 pentobarbital을 투여 함으로서 수면유도시간은 대조군에 비하여 별다른 영향이 없었으나, 수면시간은 용량 의존적으로 수면이 연장되었다.
- 8분이었으며, 파극천 추출물 100 mg/kg과 200 mg/kg을 전 처리하고 pentobarbital을 투여 함으로서 수면유도시간은 대조군에 비하여 별다른 영향이 없었으나, 수면시간은 용량 의존적으로 수면이 연장되었다. 대조군인 muscimol의 투여에서는 수면유도시간이 단축되었으며 수면시간도 연장되는 것을 관찰하였다.
- 파극천 추출물은 4주간 경구투여하고 수면연장에 어떠한 영향을 주는 가를 관찰하였던 바 pentobarbital로 유도한 생쥐의 수면유도 시간 및 수면시간이 정상군에 비하여 수면이 연장되는 경향을 보였다. 도한, PTZ의 투여로서 나타나는 항경련 효과를 관찰 하였던 바 PTZ에 의한 경련발작의 지속시간과 회복시간 및 경련발적 정도가 유의성 있게 감소됨을 관찰하였다. PTZ는 strychnine과 picrotoxin과는 달리 접합 전 및 접합 후 기능에는 관계없이 중추신경 흥분제로 chloride 이온 전도에 미치는 GABA의 작용을 저해하는 것으로 보고되어 있으며, 현재 absence seizure나 myochlonic seizure의 경련 양상을 일으키는 간질 발작을 유도하는 실험 모델로서의 용도로만 주로 사용되고 있는 약물이다(Jung et al.
- 일반적으로 항산화 작용은 활성산소의 소거 작용과 상관성이 있는 경우가 많으므로 활성산소 종들의 연쇄적인 반응으로 생성되어지는 과정(O2→-O2→H2O2→-OH)의 마지막 생성물이며 가장 강력한 활성을 지니고 있어서 산화적 스트레스에 의한 조직 손상 과정에서 대단히 중요한 핵심적인 역할을 하는 인자로 알려지고 있는 hydroxy radical(Valko et al., 2006; Jomova and Valko, 2011)에 대한 파극천을 용매를 사용하여 각 분획을 재조하여 이 분획에 대한 소거작용을 관찰하여 본 결과 부탄올 및 디클로로메탄 분획을 시험관내에 용량 별로 첨가하였을 때 5×10-2 g/ml농도에서 화학반응으로 생성시킨 반응액 중의 hydroxy radical의 양이 감소하다 최고농도인 20×10-2 g/ml의 첨가에서 약 35%에서 최고 50%까지 용량의존적으로 현저히 억제되었다.
- , 1994; Bejma and Ji, 1999). 지질과산화의 지표로 부산물인 malondialdehyde의 함량을 측청하여 지질과산화의 생성 정도를 살펴 본 결과 PTZ의 투여로 경련발작을 유도한 흰쥐에서 PTZ는 뇌조직의 지질과산화반응을 생리식염수만을 투여한 정상군에 비해 과산화지질의 생성량도 40%정도 증가하는 유의성 있는 변화가 관찰되었다. 이는 PTZ에 의한 경련발작의 유도는 지질과산화반응이 관여하는 것으로 사료된다.
- 이에 본 연구에서는 경련 발작을 유도한 동물모델을 이용하여 간질의 병태생리학적 기전연구 및 치료제로서의 이용가능성이 있는 물질의 작용기전을 연구하고자 하였다. 파극천 추출물은 4주간 경구투여하고 수면연장에 어떠한 영향을 주는 가를 관찰하였던 바 pentobarbital로 유도한 생쥐의 수면유도 시간 및 수면시간이 정상군에 비하여 수면이 연장되는 경향을 보였다. 도한, PTZ의 투여로서 나타나는 항경련 효과를 관찰 하였던 바 PTZ에 의한 경련발작의 지속시간과 회복시간 및 경련발적 정도가 유의성 있게 감소됨을 관찰하였다.
- 파극천 추출물을 전처리하고 PTZ에 의해 유도되는 경련 발작 및 항경련 효과에 미치는 영향을 관찰한 결과 파극천 추출물을 100 mg/kg 4주간 투여하고 PTZ를 투여한 군에서는 PTZ를 단독으로 투여한 대조군에 비하여 경련 발작이 용량의존적으로 억제되었으며(Fig. 1), 경련발현시간, 경련시간 및 사망시간에서 유의한 차이는 나타내지 않았으나 파극천 추출물 200 mg/kg을 4주간 투여한 군에서는 경련발현 시간이 연장되었으며, 경련발현 시간, 경련시간 및 사망시간을 유의적으로 억제 되었다(Table 2).
- 한편, GABA-T의 활성은 정상군(1.46 ± 0.09 NADPH nmole/mg protein/min)인데 비하여 PTZ투여군(2.77 ± 0.13 NADPH nmole/mg protein/min)은 정상군에 비하여 약 85% 증가하였으며 파극천 추출물 200 mg/kg의 투여로 PTZ 투여군 보다 약 25% 정도 억제되었다.
- )을 주사하여 경련의 발현 및 사망의 유무를 관찰하였다. 항경련 효과는 PTZ 투여 후의 경련발작 발현시간(onset time), 경련 지속시간(duration of convulsion), 회복시간(recover time) 등을 측정하여 종합적인 현상을 참조한 경련상태 지표로 나타내었다.
후속연구
- 한편 메탄올 및 ether추출물은 다소 감소하는 경향은 보였으나 별다른 영향이 없었다. 이상의 실험결과들을 종합하여 볼 때 파극천 성분 중에는 PTZ로 유도한 항경련 작용을 억제하는 물질이 함유되어 있으며 이 작용은 hydroxy radical의 소거작용 등으로 산화적 스트레스 상태를 개선하여 과산화지질의 생성을 억제하여 경련작용을 억제하는 것으로 생각되며 계속하여 활성 산소의 생성 및 해독계에 대하여 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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