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문제 정의
- 따라서 본 연구는 다양한 식품 또는 분변으로부터 식중독을 유발하는 유해성 세균을 저해하는 유산균들을 분리 및 탐색하고, 이를 유전학적인 방법을 사용하여 미생물을 동정하였다.
가설 설정
- 3) Numbers are mean±SD.
제안 방법
- Corkborer를 사용하여 well(직경 8 mm)을 제조한 nutrient agar plate에 여과제균한배양상등액 150μL를 적가한 다음, 37℃에서 18시간 동안 배양하여 생성된 생육 저지환(clear zone)의 직경(mm)을 측정하였다.
- PCR 반응시 0.4 mM dNTP, 0.5 units Taq polymerase, 4 mM Mg2+이 함유된 Takara Perfect Premix(Takara, Japan) 10μL에 DNA template(20μg/mL) 1μL, 1.0μM forward primer와 1.0μM reverse primer를 각각 1μL씩 넣고, 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20μL가 되도록 제조하였다.
- A)에 결합시킨 후 형질 전환하였다. T vector sequencing primer를 이용하여 염기서열을 분석하고, BLAST search(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) program을 이용하여 GENBANK(NCBI, Bethesda, MD, U.S.A)의 ribosomal DNA gene sequence와 비교하여 동정하였다.
- 또한, well diffusion 방법은 MRS 액체배지에서 배양(37℃, 48시간)한 후, 원심분리(8,000×g/15 min)하여 배양상등액을 취하고 pH 7.0으로 조정한 다음, 여과제균(0.45μm, Whatman, Springfield Mill, England)을 하였다.
- 분리 선발한 미생물의 동정은 Gram 염색법과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 관찰하였다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S ribosomal DNA gene sequencing 분석을 통하여 동정하였다. 선발미생물의 chromosomal DNA는 DNeasy tissue kit(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
- 분리 선발한 미생물의 동정은 Gram 염색법과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 관찰하였다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S ribosomal DNA gene sequencing 분석을 통하여 동정하였다.
- 0으로 조정한 후, 항균활성을 조사해야 한다. 분리미생물의 배양상등 액을 pH 7.0으로 조정하고 여과제균한 후, well-diffusion 방법을 사용하여 피검균주의 생육저지환 직경을 측정하여 박테리오신 생산 미생물 26주를 최종 선발하였다(Fig. 1).
-
2. 미생물의 분리
분리시료는 각각 10 g 또는 10 mL씩 취하여 멸균 생리식염수에 1:9 비율로 혼합한 후, homogenizer(Stomacher 400, Seward, England)를 사용하여 10분 동안 균질화한 후, 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을 멸균 생리식염수로 십진희석한 후, 0.
- 수집한 17 종류의 시료는 멸균 생리식염수로 단계 희석하고, BCP 지시약이 첨가된 MRS agar plate에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 산이 생성되어 노란색으로 변한 colony의 형태에 따라 유아 분변에서 150주, 소 분변에서 120주, 염소 분변에서 87주, 개 분변에서 142주, 돼지 분변에서 130주, vaginal tract 채취물에서 76주, 채소류에서 210주, 부패한 과일류에서 202주, 김치에서 610주, 젓갈에서 165주, 발효 소시지에서 86주, 원유에서 330주, 치즈에서 148주, 발효유에서 310주, 청국장에서 110주, 메주에서 58주, 그리고 막걸리에서 46주를 각각 분리하였다(Table 1).
- 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S ribosomal DNA gene sequencing 분석을 통하여 동정하였다. 선발미생물의 chromosomal DNA는 DNeasy tissue kit(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 16S rDNA gene 증폭을 위하여 일반적으로 사용 하는 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACT T-3') primer를 사용하였다.
- 유아 분변, 우분, 염소 분변, 개 분변, 돼지 분변, vaginal tract 채취물, 채소류, 부패한 과일류, 김치, 젓갈, 발효 소세지, 원유, 치즈, 발효유, 청국장, 메주, 막걸리 등 다양한 시료로부터 3,000주의 미생물을 분리하였다. 분리미생물은 L.
- 유아 분변, 우분, 염소 분변, 개 분변, 돼지 분변, vaginal tract 채취물, 채소류, 부패한 과일류, 김치, 젓갈, 발효 소시지, 원유, 치즈, 발효유, 청국장, 메주, 막걸리 등 다양한 시료로부터 미생물을 분리하였다.
- 항균활성 측정은 paper disc 방법으로 각각의 피검균주(108 CFU/mL)를 0.5%(v/v) 접종한 nutrient agar plate 상에 직경 8 mm의 paper disc(Advantec Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 올려 놓은 후, 원심분리 (8,000×g/15 min)하여 취한 배양상등액 50μL를 적가한 다음, 37℃에서 18시간 동안 배양하여 생성된 생육 저지환(clear zone)의 직경(mm)을 측정하였다(Tagg and Mcgiven, 1971).
대상 데이터
- 16S rDNA gene 증폭을 위하여 일반적으로 사용 하는 27F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGATACCTTGTTACGACT T-3') primer를 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 유산균주는 American Type Culture Collection(ATCC), Korean Collection for Type Culture(KCTC), Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)으로부터 분양받은 Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Weissella 표준균주로 MRS broth(Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 항균활성 실험을 위한 피검균주로는 식중독을 유발하는 병원성 세균인 Listeria monocytogenes ATCC15313, Escherichia coli O157: H7 ATCC43894, Salmonella enterica serovar Enteritidis CCARM 8200을 American Type Culture Collection(ATCC)과 항생제 내성 균주은행(CCARM)으로부터 분양을 받아 사용하였다.
- 유아 분변, 우분, 염소 분변, 개 분변, 돼지 분변, vaginal tract 채취물, 채소류, 부패한 과일류, 김치, 젓갈, 발효 소세지, 원유, 치즈, 발효유, 청국장, 메주, 막걸리 등 다양한 시료로부터 3,000주의 미생물을 분리하였다. 분리미생물은 L. monocytogenes, E. coli O157:H7, S. enterica serovar Enteritidis에 대해 항균활성을 측정하여 박테리오신 생산 미생물 26주를 최종 선발하였다. 16S rDNA gene sequencing 분석을 통하여 동정한 결과, Enterococcus faecalis(7주), E.
- 수집한 17 종류의 시료는 멸균 생리식염수로 단계 희석하고, BCP 지시약이 첨가된 MRS agar plate에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 산이 생성되어 노란색으로 변한 colony의 형태에 따라 유아 분변에서 150주, 소 분변에서 120주, 염소 분변에서 87주, 개 분변에서 142주, 돼지 분변에서 130주, vaginal tract 채취물에서 76주, 채소류에서 210주, 부패한 과일류에서 202주, 김치에서 610주, 젓갈에서 165주, 발효 소시지에서 86주, 원유에서 330주, 치즈에서 148주, 발효유에서 310주, 청국장에서 110주, 메주에서 58주, 그리고 막걸리에서 46주를 각각 분리하였다(Table 1).
- 본 연구에 사용한 유산균주는 American Type Culture Collection(ATCC), Korean Collection for Type Culture(KCTC), Korean Culture Center of Microorganisms(KCCM)으로부터 분양받은 Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Weissella 표준균주로 MRS broth(Difco, Detroit, MI, USA)를 사용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 항균활성 실험을 위한 피검균주로는 식중독을 유발하는 병원성 세균인 Listeria monocytogenes ATCC15313, Escherichia coli O157: H7 ATCC43894, Salmonella enterica serovar Enteritidis CCARM 8200을 American Type Culture Collection(ATCC)과 항생제 내성 균주은행(CCARM)으로부터 분양을 받아 사용하였다. 피검균주들은 tryptic soy broth(TSB; Difco, Detroit, MI)를 사용하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- enterica serovar Enteritidis에 대해 항균활성을 측정하여 박테리오신 생산 미생물 26주를 최종 선발하였다. 16S rDNA gene sequencing 분석을 통하여 동정한 결과, Enterococcus faecalis(7주), E. faecium(8주), E. hirae(5주), Lactobacillus acidophilus(1주), L. amylovorus(1주), L. curvatus(2주), L. plantarum(1주), Pediococcus acidilactici(1주)와 같이 8종의 미생물이 박테리오신을 생산하는 것으로 확인되었다. 미생물이 생산한 박테리오신은 대부분이 단백질 또는 펩타이드성 물질이어서 인간 또는 동물의 소화효소에 의해 분해되므로 식품에서 안전한 천연보존제로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
- plantarum(1주), Pediococcus acidilactici(1주)와 같이 8종의 미생물이 박테리오신을 생산하는 것으로 확인되었다(Table 2). 그 중에서 분변유래의 E. faecalis(7주)와 E. faecium(8주)은 박테리오신을 생산하는 미생물 중에서 58%를 차지하였는데, 본 연구를 통해 사람 또는 가축 유래 장내미생물에서 항균활성이 우수한 미생물이 다수 존재할 것으로 사료되었다. 그람음성 식중독 세균에 대해서 항균활성이 우수한 유산균주인 B10G은 L.
- 그람양성 식중독 세균인 L. monocytogenes에 대한 항균활성은 소 분변 유래 유산균주 CMA8(생육저지대 10±1 mm)와 DC8(생육저지대 16±2 mm), 발효 소시지 유래 유산균주 FS43(생육저지대 10±1 mm)만 항균활성을 나타내었다(Table 2).
- faecium(8주)은 박테리오신을 생산하는 미생물 중에서 58%를 차지하였는데, 본 연구를 통해 사람 또는 가축 유래 장내미생물에서 항균활성이 우수한 미생물이 다수 존재할 것으로 사료되었다. 그람음성 식중독 세균에 대해서 항균활성이 우수한 유산균주인 B10G은 L. amylovorus(98%), M21과 19-3은 E. faecium(99%), 그리고 그람 양성 식중독 세균인 L. monocytogenes에 대한 항균활성이 우수한 유산균주인 DC8은 E. faecium(98%)으로 동정하였다.
- enterica serovar Enteritidis에 대해 항균활성을 측정한 결과, 유아 분변 유래 분리균주에서 21주, 소 분변 유래 분리균주에서 18주, 염소 분변 유래 분리균주에서 12주, 개 분변 유래 분리균주에서 15주, 돼지 분변 유래 분리균주에서 11주, vaginal tract 채취물 유래 분리균주에서 5주, 부패한 과일류 유래 분리균주에서 12주, 김치 유래 분리균주에서 71주, 젓갈 유래 분리균주에서 11주, 발효 소시지 유래 분리균주에서 5주, 원유 유래 분리균주에서 38주, 발효유 유래 분리균주에서 30주, 청국장 유래 분리균주에서 5주, 표준균주에서는 1주를 항균활성 보유 미생물로 선발하였다(Table 1). 다양한 분리시료들 중에서 분변(8.5~15.0%), 김치(11.9%), 원유(11.5%) 시료로부터 분리한 미생물에서 항균활성 효과가 더 많은 것으로 확인되었다. 그러나, 부패한 채소류, 치즈, 메주, 그리고 막걸리로부터 분리한 미생물에서는 항균활성을 확인할 수 없었다.
- 유산균들은 요거트, 치즈, 버터 등의 유제품이나 발효 소세지 같은 육제품 뿐만 아니라, 우리나라 전통발효 식품인 김치, 젓갈, 장류 등에 많이 존재하며, 사람이나 동물의 장이나 질내에 정상 미생물군으로 존재하고 있다. 또한, 유산균과 같은 식품유래 미생물들은 오랜 기간 동안 인류가 발효식품과 함께 섭취한 GRAS(generally regarded as safe) 미생물로서 안전성이 증명되었다. 미생물 유래의 항균물질인 bacteriocin은 천연의 antimicrobial polypeptide로서, 기존의 항생제가 2차 대사산물인데 반하여 자신의 유전자로부터 직접 생합성 되는 것이 특징이다(Cleveland et al.
- 박테리오신 생산 미생물로 선발한 미생물의 동정은 그람 염색법과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 관찰한 결과, 선발미생물 모두 그람양성의 구균과 간균으로 확인되었다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S rDNA gene sequencing 분석을 통하여 동정한 결과, Enterococcus faecalis(7주), E.
- 박테리오신 생산 미생물로 선발한 미생물의 동정은 그람 염색법과 현미경 관찰을 통해 형태학적 특성을 관찰한 결과, 선발미생물 모두 그람양성의 구균과 간균으로 확인되었다. 보다 더 정확한 동정을 위하여 16S rDNA gene sequencing 분석을 통하여 동정한 결과, Enterococcus faecalis(7주), E. faecium(8주), E. hirae(5주), Lactobacillus acidophilus(1주), L. amylovorus(1주), L. curvatus(2주), L. plantarum(1주), Pediococcus acidilactici(1주)와 같이 8종의 미생물이 박테리오신을 생산하는 것으로 확인되었다(Table 2). 그 중에서 분변유래의 E.
- 분리한 미생물 2,965주와 분양받은 표준균주 35주를 MRS broth에서 각각 배양한 후, paper disc 방법을 통해 식중독균인 L. monocytogenes, E. coli O157:H7, S. enterica serovar Enteritidis에 대해 항균활성을 측정한 결과, 유아 분변 유래 분리균주에서 21주, 소 분변 유래 분리균주에서 18주, 염소 분변 유래 분리균주에서 12주, 개 분변 유래 분리균주에서 15주, 돼지 분변 유래 분리균주에서 11주, vaginal tract 채취물 유래 분리균주에서 5주, 부패한 과일류 유래 분리균주에서 12주, 김치 유래 분리균주에서 71주, 젓갈 유래 분리균주에서 11주, 발효 소시지 유래 분리균주에서 5주, 원유 유래 분리균주에서 38주, 발효유 유래 분리균주에서 30주, 청국장 유래 분리균주에서 5주, 표준균주에서는 1주를 항균활성 보유 미생물로 선발하였다(Table 1). 다양한 분리시료들 중에서 분변(8.
- monocytogenes에 대한 항균활성은 소 분변 유래 유산균주 CMA8(생육저지대 10±1 mm)와 DC8(생육저지대 16±2 mm), 발효 소시지 유래 유산균주 FS43(생육저지대 10±1 mm)만 항균활성을 나타내었다(Table 2). 선발한 박테리오신 생산 미생물은 그람양성 식중독 균주보다 그람음성 식중독 균주에 대해서 비교적 넓은 항균활성을 나타내었다.
- 선발한 유산균주들이 생산하는 박테리오신은 E. coli O157: H7와 S. enterica serovar Enteritidis와 같은 그람음성 식중독 세균에 대해서 항균활성을 나타내었는데, 그 중에서 원유 유래 유산균주 B10G(생육저지대 19±2 mm와 26±3 mm)와 M21(생육저지대 17±2 mm와 26±3 mm), 소 분변 유래 유산균주 19-3(생육저지대 20±3 mm와 26±2 mm)이 가장 우수한 항균활성능을 나타내었다.
후속연구
- 유산균은 glucose 및 lactose를 탄소원으로 사용하여 최종산물로 lactic acid, acetic acid, propionic acid, benzoic acid, mevalonic acid 등과 같이 유기산을 주로 생산하는데, 유산균이 생성한 유기산은 pH를 감소시켜 병원성 미생물이나 식품위생 미생물의 생육을 억제하는 작용을 하며, 유기산 자체가 항균력을 나타내기도 한다고 보고되어 있다(McGroarty, 1993). 따라서, 항균물질인 bacteriocin을 생산하는 미생물을 선발하기 위해서는 pH를 6.5~7.0으로 조정한 후, 항균활성을 조사해야 한다. 분리미생물의 배양상등 액을 pH 7.
- plantarum(1주), Pediococcus acidilactici(1주)와 같이 8종의 미생물이 박테리오신을 생산하는 것으로 확인되었다. 미생물이 생산한 박테리오신은 대부분이 단백질 또는 펩타이드성 물질이어서 인간 또는 동물의 소화효소에 의해 분해되므로 식품에서 안전한 천연보존제로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이러한 관점에서 유산균은 장내에서 정상 미생물군으로 존재하고 있기 때문에, 독성이 비교적 적다고 판단된다. 유산균들이 생산하는 항균 물질은 식품 등의 새로운 생물학적 보존제로서 효용이 크며, 식품 산업이나 의약품 산업에의 응용도 기대될 것이다.
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