[논문]맥문동탕이 호흡기 점액의 생성 및 분비에 미치는 영향

성현경; 민상연; 김장현

doi:10.7778/jpkm.2013.27.1.069

맥문동탕이 호흡기 점액의 생성 및 분비에 미치는 영향
Effect of Macmundongtang on Production and Secretion of Respiratory Mucus 원문보기

大韓韓方小兒科學會誌 = The journal of pediatrics of Korean medicine, v.27 no.1, 2013년, pp.69 - 81

성현경 (동국대학교 한의과대학 소아과학교실) , 민상연 (동국대학교 한의과대학 소아과학교실) , 김장현 (동국대학교 한의과대학 소아과학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives In this study, effects of Macmundongtang (MMT) on ATP or TNF-${\alpha}$ or PMA or EGF induced MUC5AC mucin production and gene expression from human airway epithelial cells and the increase in airway epithelial mucosubstances of rats were investigated. Materials and Methods Confluent NCI-H292 cells were pretreated for 30min in the presence of MMT and treated with ATP ($200{\mu}M$) or PMA (10 ng/ml) or EGF (25 ng/ml) or TNF-${\alpha}$ (0.2 nM) for 24hrs, to assess the effect of MMT both on ATP- or PMA- or EGF- or TNF-${\alpha}$-induced MUC5AC mucin production using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and on gene expression by the same inducers using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). At the same time, hypersecretion of airway mucus was induced by exposure of rats to SO2 during 3 weeks. Effect of orally-administered MMT during 2 weeks on increase in airway epithelial mucosubstances from tracheal goblet cells of rats was assesed using histopathological analysis after staining the epithelial tissue with PAS-alcian blue. Possible cytotoxicity of MMT was assessed by investigating the potential damage of kidney and liver functions by measuring serum GOT/GPT activities and serum BUN concentration of rats and the body weight gain during experiment, after administering MMT orally. Results (1) MMT did not only inhibit but also increased MUC5AC mucin productions and expression levels of MUC5AC gene from NCI-H292 cells. (2) MMT did not decrease the amount of intraepithelial mucosubstances of trachea of rats. (3) MMT did not show renal and hepatic toxicities and did not affect body weight gain of rats during experiment. Conclusions The result from the present study suggests that MMT might normalize the production and gene expression of airway mucin observed in various respiratory diseases accompanied by yin-deficiency, without in vivo toxicity to liver and kidney functions after oral administration.

주제어

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문제 정의

이에 저자는 麥門冬湯이 기도 점액의 과다 분비 및 이와 연관된 기도 뮤신의 생성 및 유전자 발현에 어떠한 작용을 발현할 수 있는지 알아보기 위하여, in vitro 의 수준에서 인체 기도 상피세포인 NCI-H292에서 기도 뮤신인 MUC5AC 뮤신의 생성에 대한 麥門冬湯의 영향과 기도 뮤신 유전자인 MUC5AC mRNA의 발현을 관찰하고 in vivo 수준에서 기도 점액 과다분비 흰쥐 모델에서 상피 배상세포 내의 점액 함유량에 대한 麥門冬湯의 영향을 관찰하고, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
이에 저자는 麥門冬湯이 기도 점액의 과다 분비와 뮤신생성 및 유전자 발현에 어떠한 영향을 미치는지 관찰함으로써, 麥門冬湯이 면역관련 효과뿐만 아니라 기도 점액 과다 분비상태의 조절약물로서의 활용가치에 관하여 연구하였다.

제안 방법

이산화황 노출방법은 Pon 등¹⁷⁾이 보고한 방법을 개량하여 사용하였다. 15% (V/V) Sodium metabisulfite (MBS) 수용액을 초음파 가습기에 주입하고 가습기를 작동시켰다. 작동 후 3분 이내에 MBS의 증기가 충만했고 작동 종료 시까지 실험장치 내부의 이산화황 농도는 130 - 150 ppm으로 유지되었다.
1시간 후 PBS-T 200µl로 3회 세척하고 MUC5AC에 대한 monoclonal antibody인 mouse anti-MUC5AC clone 45M1을 2% BSA에 1: 200의 비율로 희석한 후에 각 well당 100µl씩 첨가하고 1시간 동안 incubation하였다.
24시간의 약물 처리 기간 동안, 약물이 인체 기도 상피세포인 NCI-H292 세포 내에 존재하는 MUC5AC 뮤신의 생성 및 유전자 (mRNA)의 발현에 미치는 영향을 검증하기 위하여 NCI-H292 세포를 다음과 같은 방법으로 배양하였다. 세포는 습도가 충분히 유지되며 95% 공기, 5% CO₂를 함유하는 37 ℃ 조건에서 HEPES (25 mM), penicillin G (100 U/㎖), streptomycin (100 ㎍/㎖), FBS (10%, V/V)등이 첨가된 RPMI 1640 배양액 (이하 배양액)에서 배양되며 1주에 2회의 빈도로 subculture 하였다.
MMT가 흰쥐의 기도 배상세포 내 점액 함유량에 미치는 영향을 측정하기 위하여 기관내강 상피세포층에 대한 병리조직학적 검사를 실시하였다. 3주간의 이산화황 노출 기간이 종료된 후 각 군에 소속된 해당 실험 동물을 이산화탄소로 질식사시킨 후 기관을 절개하고 분리한 후 냉각된 10% formalin in PBS (pH 7.2)에 넣어 24시간동안 고정하였다. 고정한 조직을 파라핀으로 포매(embedding)하였다.
PBS-T로 다시 3회 세척 후, 3,3',5,5'- tetramethyl-benzidine peroxide (TMB) 용액 100 µl를 각 well에 첨가하고, 5분 후 1N H₂SO₄ 50 µl를 첨가, 반응을 정지시켰다. 450 ㎚에서 각 well의 흡광도를 Shao¹⁴⁾, Song¹⁵⁾의 연구에서 사용된 방법에 준해서 측정함으로써 대조군과 약물 처리군 간의 MUC5AC 함량을 측정, 비교하였다.
먼저, 혈청 중의 GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase)는 L-Asparatate와α-ketoglutarate를 Oxaloacetate와 L-Glutamate로 전환시키며 이때 생성된 oxaloacetate는 Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH)의 존재 하에 Malate Dehydrogenase (MDH)의 작용으로 L-Malate로 전환된다. GOT의 활성값은 340 nm에서 NADH의 감소 속도를 측정함으로써 계산하였다. 혈청 중 GPT (Glutamate Pyruvate Transaminase)는 L-alanine과 α-ketoglutarate를 pyruvate와 L-glutamate로 변환시키며, 이때 생성된 pyruvate는 NADH의 존재 하에 Lactate Dehydrogenase (LDH) 의 작용으로 lactate로 전환된다.
0％ agarose gel에서 전기 영동하였다. Gel 상에서 이동된 각각의 DNA band는 자외선 투사기 (ultraviolet transilluminator)를 이용하여 관찰하고, 사진 촬영하였다.
MMT가 흰쥐의 기도 배상세포 내 점액 함유량에 미치는 영향을 측정하기 위하여 기관내강 상피세포층에 대한 병리조직학적 검사를 실시하였다. 3주간의 이산화황 노출 기간이 종료된 후 각 군에 소속된 해당 실험 동물을 이산화탄소로 질식사시킨 후 기관을 절개하고 분리한 후 냉각된 10% formalin in PBS (pH 7.
MMT는 최종 추출물 2, 5, 10µl/200µl 배양액의 투여 농도에서 PMA로 자극된 뮤신 생성을 유의성 있게증가시켰다 (Fig. 3).
MMT는 최종 추출물 2, 5, 10µl/200µl 배양액의 투여 농도에서 TNF-α로 자극된 뮤신 생성을 유의성 있게 증가시켰다 (Fig. 2).
MUC5AC 유전자에 대한 PCR은, 각각의 역전사 반응에서 얻은 cDNA 산물 2µl를 PCR premix kit의 사용자 설명서에 따라 진행시켰다.
Microtome을 이용하여 5 μm 두께로 잘라 조직절편을 제작하였다.
NCI-H292 세포에서의 human MUC5AC 유전자 합성을 위해 사용한 sense primer의 염기서열은 5‘-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3', antisense primer의 염기서열은 5’-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G-3'이며, β-actin 유전자 합성을 위해 사용한 sense primer의 염기서열은 5'-TAC AAC GAG CTG CGT GTG GCC-3'이고, antisense primer는 5'-CAA CGG AAC CGC CTC GTT GC-3'였다. RNA의 역전사 반응 및 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)으로 얻은 total RNA를 이용하여 역전사 반응 (Reverse Transcription) 으로 cDNA를 만들고 이를 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭시켰다. 즉, 얻어진 total RNA 1µl을 75 ℃에서 5분간 가열함으로써 denaturation시키고, 이를 얼음에 담가 급냉시킨 후 RT premix kit의 사용자 설명서에 따라 역전사 반응을 진행시켰다.
RNA의 역전사 반응 및 중합효소 연쇄반응으로 증폭된 cDNA 산물들을 전기영동으로 분리함으로써 MUC5AC 유전자 발현 변동여부를 관찰하였다. 즉, 증폭된 PCR 산물 10 µl를 10×gel loading buffer (0.
麥門冬湯이 기도 점액 분비 및 이와 연관된 기도 뮤신의 생성 및 유전자 발현에 대한 작용을 알아보기 위하여, 이산화황 흡입 투여로 유발된 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에서 상피 배상세포 내의 점액 함유량에 대한 麥門冬湯의 영향을 관찰하고, 인체 기도 상피세포인 NCI-H292 세포에서 기도 뮤신인 MUC5AC 뮤신의 생성에 대한 약물의 영향과 기도 뮤신 유전자인 MUC5AC mRNA의 발현을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
동물을 대조군 (무처치군), 이산화황 3주 처리군, 이산화황 1주 처리 후 최종 2주간 이산화황 처리 및 麥門冬湯 동시 투여군으로 무작위 배정하고, 각 군당 동물 수는 5마리 이상으로 하였다. 노출 기간은 1일 3시간, 1주일에 5일, 3주간이었다. 대조군은 실험장치가 설치된 동일한 실내에 전 실험기간 동안 1일 3시간의 이산화황 노출 및麥門冬湯 처리 과정만 제외하고 노출군과 동일한 조건으로 사육하였다¹⁸⁾.
5) 염색을 실시한 후 광학 현미경 하에서 관찰하고 200배 배율에서 사진 촬영하였다. 대조군, 이산화황 처리군, MMT 처리군의 배상세포 내 점액 함유량을 비교함으로써 MMT가 배상세포 내 점액 함유 상태에 미치는 영향을 관찰하였다^19,20).
노출 기간은 1일 3시간, 1주일에 5일, 3주간이었다. 대조군은 실험장치가 설치된 동일한 실내에 전 실험기간 동안 1일 3시간의 이산화황 노출 및麥門冬湯 처리 과정만 제외하고 노출군과 동일한 조건으로 사육하였다¹⁸⁾.
작동 후 3분 이내에 MBS의 증기가 충만했고 작동 종료 시까지 실험장치 내부의 이산화황 농도는 130 - 150 ppm으로 유지되었다. 동물을 대조군 (무처치군), 이산화황 3주 처리군, 이산화황 1주 처리 후 최종 2주간 이산화황 처리 및 麥門冬湯 동시 투여군으로 무작위 배정하고, 각 군당 동물 수는 5마리 이상으로 하였다. 노출 기간은 1일 3시간, 1주일에 5일, 3주간이었다.
먼저 세포 및 분자수준에서 麥門冬湯의 효과에 대하여 알아보기 위해 인체 기도 상피세포인 NCI-H292세포를 뮤신의 생성에 관여하는 ATP, PMA, EGF, TNFα로 각각 자극한 상태에서 24시간동안 약물처리를 한후 MUC5AC 뮤신의 생성 정도를 측정하였고, 같은 방법으로 뮤신의 유전자 발현을 자극한 상태에서 24시간의 약물 처리 기간 동안 MUC5AC mRNA의 발현 정도를 관찰하였다.
세포는 습도가 충분히 유지되며 95% 공기, 5% CO₂를 함유하는 37 ℃ 조건에서 HEPES (25 mM), penicillin G (100 U/㎖), streptomycin (100 ㎍/㎖), FBS (10%, V/V)등이 첨가된 RPMI 1640 배양액 (이하 배양액)에서 배양되며 1주에 2회의 빈도로 subculture 하였다. 뮤신 생성 및 그 유전자 발현에 대한 MMT의 작용을 검증하기 위하여 뮤신 생성량 검증을 위해서는 24 well culture plate를 기준으로 well 당 2.0 x 10⁴ cells/well의 밀도로, 뮤신 유전자 발현 정도의 검증을 위해서는 6 well culture plate를 기준으로 well 당 5.0 x 10⁴ cells/well의 밀도로 각각 세포를 도포하고 배양하였다. 세포가 다 자라면 FBS의 농도를 0.
24시간의 약물 처리 기간 동안, 약물이 인체 기도 상피세포인 NCI-H292 세포 내에 존재하는 MUC5AC 뮤신의 생성 및 유전자 (mRNA)의 발현에 미치는 영향을 검증하기 위하여 NCI-H292 세포를 다음과 같은 방법으로 배양하였다. 세포는 습도가 충분히 유지되며 95% 공기, 5% CO₂를 함유하는 37 ℃ 조건에서 HEPES (25 mM), penicillin G (100 U/㎖), streptomycin (100 ㎍/㎖), FBS (10%, V/V)등이 첨가된 RPMI 1640 배양액 (이하 배양액)에서 배양되며 1주에 2회의 빈도로 subculture 하였다. 뮤신 생성 및 그 유전자 발현에 대한 MMT의 작용을 검증하기 위하여 뮤신 생성량 검증을 위해서는 24 well culture plate를 기준으로 well 당 2.
수거된 RNA 침전물을 5분간 대기 중에서 건조시킨 후, 20 µl의 RNase-free water로 부유시키고, UV-spectrophotometer를 사용하여 260 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정함으로써 RNA의 농도를 측정한 후 실험에 사용하였다16).
이렇게 준비된 세포에 약물 추출물 각각 2, 5, 10 µl씩을 함유하는 배양액 200 µl를 well (24 well plate 기준)마다 가하고 30분이 지난 시점에 ATP 200μM, 또는 TNF-α 0.2 nM, 또는 PMA 10 ng/㎖, 또는 EGF 25 ng/㎖을 각 well마다 투여한 후 37 ℃에서 24시간동안 배양하였다.
다음으로, 麥門冬湯이 기도점액의 주된 생화학적 구성요소인 뮤신의 생성 및 유전자 발현 등 세포 및 분자 수준에서 영향을 줄 가능성이 크다면, 임상에서麥門冬湯이 인체에 경구로 투여된다는 점을 고려하여 실험동물을 대상으로 한 in vivo 실험에서는 麥門冬湯 이 어떠한 약리작용을 나타낼 지를 검증하기 위하여 후속연구가 필요하였다. 이를 위해 이산화황 흡입으로 유발된 기도 점액 과다분비 동물모델에 麥門冬湯을 2주간 경구투여한 후 기도 배상세포 내의 점액 함유량에 대한 麥門冬湯의 영향을 조직병리학적인 방법으로 확인하였다. 그 결과 대조군과 이산화황 3주 흡입군에 비해 이산화황 1주 흡입 후 2주간 이산화황 흡입 및麥門冬湯 동시 투여군에서, 2주간의 경구투여 후 기도 배상세포 내 점액의 함유량이 감소하지 않고 오히려 증가하는 경향을 보여주었다 (Fig.
이산화황 1주 처리 후 최종 2주간 이산화황 처리 및麥門冬湯 동시투여 군에 배당된 실험동물을 대상으로, 체중 70 kg 성인이 복용하는 麥門冬湯의 용량을 기준으로 환산된 체중 350 g의 흰쥐에의 투여용량인 麥門冬湯 추출물 2 ml를 경구투여용 주사바늘을 이용하여 투여하였다. 즉, 총 3주간의 이산화황 노출 기간 중 마지막 2주간 (총10일) 매일 1회 麥門冬湯을 투여하였는데 麥門冬湯 투여는 오전 10시에서 11시 사이에, 이산화황 노출은 오후 1시에서 4시까지, 각각 실시하였다.
즉, 얻어진 total RNA 1µl을 75 ℃에서 5분간 가열함으로써 denaturation시키고, 이를 얼음에 담가 급냉시킨 후 RT premix kit의 사용자 설명서에 따라 역전사 반응을 진행시켰다.
이산화황 1주 처리 후 최종 2주간 이산화황 처리 및麥門冬湯 동시투여 군에 배당된 실험동물을 대상으로, 체중 70 kg 성인이 복용하는 麥門冬湯의 용량을 기준으로 환산된 체중 350 g의 흰쥐에의 투여용량인 麥門冬湯 추출물 2 ml를 경구투여용 주사바늘을 이용하여 투여하였다. 즉, 총 3주간의 이산화황 노출 기간 중 마지막 2주간 (총10일) 매일 1회 麥門冬湯을 투여하였는데 麥門冬湯 투여는 오전 10시에서 11시 사이에, 이산화황 노출은 오후 1시에서 4시까지, 각각 실시하였다.
MUC5AC 유전자에 대한 PCR은, 각각의 역전사 반응에서 얻은 cDNA 산물 2µl를 PCR premix kit의 사용자 설명서에 따라 진행시켰다. 증폭반응을 위하여, PCR을 40회 실시 (PCR thermal cy cler, Takara MP-300, Japan)하였으며, denaturation은 94℃에서 30초, annealing은 60 ℃에서 30초, extension은 72 ℃에서 30초간 각각 시행하였다.
직육면체 상자 (200 cm × 60 cm × 30 cm, 아크릴 수지)의 가로면에 실험동물이 출입할 수 있도록 출입문을 만들고 좌우 양 세로면의 중심부에 구멍을 만든 후 폴리에틸렌 소재의 관 (管)을 부착시켰다.
Microtome을 이용하여 5 μm 두께로 잘라 조직절편을 제작하였다. 탈파라핀 과정을 거치고 Hematoxylin-eosin 염색과 Periodic Acid Schiff (PAS) - Alcian Blue (pH 2.5) 염색을 실시한 후 광학 현미경 하에서 관찰하고 200배 배율에서 사진 촬영하였다. 대조군, 이산화황 처리군, MMT 처리군의 배상세포 내 점액 함유량을 비교함으로써 MMT가 배상세포 내 점액 함유 상태에 미치는 영향을 관찰하였다^19,20).
투여된 MMT에 의한 신장독성 발생 여부를 검증하기 위하여, MMT 투여 후 혈청 중의 BUN (Blood Urea Nitrogen) 값을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 혈청 중의 요소 (urea)는 urease에 의해 특이적으로 분해되어 암모니아와 이산화탄소를 생성하며, 생성된 암모니아는 2-oxoglutarate와 먼저 반응하고 GLDH의 존재 하에 NADH 와 반응하여 Glutamate와 NAD를 생성하고, 이 반응에서 감소하는 NADH의 감소 속도를 측정하여 혈청 중의 요소질소 (BUN)의 양 (농도)을 계측하였다.
투여된 MMT의 생체 안전성을 검증하기 위한 하나의 지표로서 MMT 투여 기간을 포함하여 전 실험 기간 중 각 동물의 체중 증가 정도, 즉 실험 시작 시점의 각 동물의 체중과 실험 종료 시점의 체중의 차이를 측정하고, 대조군과 MMT 투여군 간에 비교함으로써 麥門冬湯 투여가 각 동물의 영양 및 대사 상태에 미치는 영향을 검증하고자 하였다.
투여된 麥門冬湯에 의한 간독성 발생 여부를 검증하기 위하여, MMT 투여 후 간세포 파괴 시 혈청으로 유출 되는 효소인 GOT (AST), GPT (ALT)의 혈청 중 활성을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 먼저, 혈청 중의 GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase)는 L-Asparatate와α-ketoglutarate를 Oxaloacetate와 L-Glutamate로 전환시키며 이때 생성된 oxaloacetate는 Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH)의 존재 하에 Malate Dehydrogenase (MDH)의 작용으로 L-Malate로 전환된다.
투여된 MMT에 의한 신장독성 발생 여부를 검증하기 위하여, MMT 투여 후 혈청 중의 BUN (Blood Urea Nitrogen) 값을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 혈청 중의 요소 (urea)는 urease에 의해 특이적으로 분해되어 암모니아와 이산화탄소를 생성하며, 생성된 암모니아는 2-oxoglutarate와 먼저 반응하고 GLDH의 존재 하에 NADH 와 반응하여 Glutamate와 NAD를 생성하고, 이 반응에서 감소하는 NADH의 감소 속도를 측정하여 혈청 중의 요소질소 (BUN)의 양 (농도)을 계측하였다.

대상 데이터

1) 배양세포- NCI-H292 세포는 American Type Culture Collection사 (Manassas, VA, U.S.A.)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
2) 동물- 5주령의 체중 200g 내외의 Sprague-Dawley (SD)계 雄性 흰쥐 (대한바이오링크 (주), Kyung-gi, Korea)를 구입하고, 3~4일간 실험실 환경에서 순화시킨 후 실험에 사용하였다.
24시간의 배양이 종료된 시점에 세포 용해용 완충액 (20 mM Tris, 0.5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, protease inhibitor cocktail)을 가하여 세포 내에 존재하는 MUC5AC 뮤신을 추출한 후 이후의 실험에 사용하였다. 즉, 수거된 세포 용해 추출액 (cell lysate)을 PBS로 1/10배 희석하고 희석된 각 sample 을 ELISA 전용의 96-well plate에 각각 100 µl씩 분포시킨 후 완전히 건조될 때까지 42 ℃ 조건에서 incubation 하였다.
3) 약재- 麥門冬湯 (MMT) 의 구성 약물은 《東醫寶鑑》⁷⁾에 준하여 동국대학교 부속 한방병원 약제실에서 공급받아 사용하였다. 한 첩당 처방의 내용과 용량은 다음과 같다.
5) 시약- Mouse anti-MUC5AC clone 45M1은 NeoMarkers 사 (Freemont, CA, U.S.A.)에서, adenosine triphodphate (ATP), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), epidermal growth factor (EGF), Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA), ethidium bromide, trypsin-EDTA, formaldehyde, alcian blue, periodic acid-schiff (PAS), Tween 20, bovine serum albumin (BSA), HEPES, dimethyl sulfoxide (DMSO), diethylpyrocarbonate (DEPC), 3,3',5,5'- tetramethyl- benzidine peroxide solution (TMB), Trizma base, NP-40, EDTA, EGTA 등은 Sigma사 (St. Louis, Mo., U.S.A.)에서, Easy-Blue RNA extraction kit는 INTRON biotechnology사 (Kyung-gi, Korea)에서, Accuprep RT premix kit와 Accuprep PCR premix kit는 Bioneer사 (Daejeon, Korea)에서, Protease in- hibitor cocktail은 Roche사 (Indianapolis, IN, U.S.A.) 에서, penicillin-G, streptomycin, fetal bovine serum (FBS), RPMI 1640은 GIBCO-BRL사 (Grand Island, New York, U.S.A.)에서, 기타 모든 시약은 일급시약 등급 이상의 제품을 구입하여 사용하였으며 물은 탈이온 2차 증류수를 사용하였다.
PCR에 사용된 primer는 전문 제조회사인 Genotec(주) (Daejeon, Korea)에 주문, 합성하였다. NCI-H292 세포에서의 human MUC5AC 유전자 합성을 위해 사용한 sense primer의 염기서열은 5‘-TGA TCA TCC AGC AGC AGG GCT-3', antisense primer의 염기서열은 5’-CCG AGC TCA GAG GAC ATA TGG G-3'이며, β-actin 유전자 합성을 위해 사용한 sense primer의 염기서열은 5'-TAC AAC GAG CTG CGT GTG GCC-3'이고, antisense primer는 5'-CAA CGG AAC CGC CTC GTT GC-3'였다.

데이터처리

모든 측정 결과는 Mean±S.E.M.으로 환산된 후, 麥門冬湯 처리군의 측정치는 대조군 측정치의 백분율로 나타냈다.
통계처리는 unpaired Student's t-test로 하였으며, p<0.05인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

이론/모형

한쪽 관은이산화황 (sulfur dioxide, SO₂)이 발생되는 초음파 가습기의 분무구에 연결시키고 반대쪽 관은 배기 장치에 연결하였다. 이산화황 노출방법은 Pon 등¹⁷⁾이 보고한 방법을 개량하여 사용하였다. 15% (V/V) Sodium metabisulfite (MBS) 수용액을 초음파 가습기에 주입하고 가습기를 작동시켰다.

성능/효과

1. 麥門冬湯은 배양된 인체 기도 상피 세포에서 뮤신 생성과 그 유전자 발현을 증가시키는 경향을 보여주었다.
2. 이산화황으로 유발된 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에 麥門冬湯을 경구 투여한 결과, 기도 배상 세포 내 점액 함유량을 증가시키는 경향을 보여주었다.
2주간의 麥門冬湯 경구투여 기간을 포함한 전체 3주간의 실험 기간 동안 각 실험동물의 체중 변화를 측정한 결과, 대조군과 麥門冬湯 투여군 간에 유의한 차이를 보이지 않음으로써 MMT가 실험동물의 영양 섭취 및 대사 상태에 유의한 독성을 유발하지 않음을 알게 되었다 (Fig. 10).
3. 麥門冬湯을 실험동물에게 투여하였을 때 체중증가도, 간기능 및 신장 기능에 영향을 주지 않음으로써 생체 독성을 유발하지 않음을 보여 주었다.
4) 약물 제조- 麥門冬湯 한 첩 분량에 중량의 10배 용량의 탈이온 2차 증류수를 가하고 100 ℃로 가열된 상태에서 3시간 동안 전탕하여, 최종 100 ㎖ 의 탕액을 수거하였다. 탕액을 실온 정도로 식게 한 후, 클린 벤치 안에서 0.
MMT는 24시간의 처리기간 동안 EGF로 유도된 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 최고농도에서 감소시키는 듯한 경향을 보였으나, 저농도와 중간농도에서는 유의한 감소 경향을 나타내지 않았다 (Fig. 8).
MMT는 최종 추출물 저농도 투여 시에는 24시간의 처리기간 동안 ATP로 유도된 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 감소시키는 듯한 경향을 보였으나, 농도가 증가할수록 특히 최고농도에서는 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 증가시키는 경향을 보여주었다 (Fig.5).
간독성의 지표로는 Tranaminase인 GOT (AST), GPT (ALT)의 혈청 중 활성을 선정하였으며, 2주간의 麥門冬湯 경구투여 후 GOT, GPT의 혈청 중 활성을 측정한 결과, 대조군과 麥門冬湯 투여군 간에 유의한 차이를 보이지 않음으로써 MMT가 실험동물에서 간독성도 유발하지 않음을 알게 되었다 (Fig. 11).
이를 위해 이산화황 흡입으로 유발된 기도 점액 과다분비 동물모델에 麥門冬湯을 2주간 경구투여한 후 기도 배상세포 내의 점액 함유량에 대한 麥門冬湯의 영향을 조직병리학적인 방법으로 확인하였다. 그 결과 대조군과 이산화황 3주 흡입군에 비해 이산화황 1주 흡입 후 2주간 이산화황 흡입 및麥門冬湯 동시 투여군에서, 2주간의 경구투여 후 기도 배상세포 내 점액의 함유량이 감소하지 않고 오히려 증가하는 경향을 보여주었다 (Fig. 9). 이러한 실험결과는 麥門冬湯이 호흡기 염증 상태에서 발생되는 기도 점액 과다분비 상태에서 淸熱, 消炎作用 등을 경유하여 뮤신의 생성 감소 및 분비 억제작용을 발현하기 보다는, 오히려 補陰, 滋陰作用을 통하여 肺陰虛, 肺燥상태에서의 점액의 생성 및 분비를 적절히 증가시킴으로써 호흡기 질환의 병태를 정상화 시킨다는 것을 보여준다고 할 수 있다.
기도 상피세포층에 Hematoxylin-eosin 염색과 Periodic Acid Schiff (PAS) - Alcian Blue 염색을 실시한 후 광학 현미경 하에서 관찰한 결과, 이산화황에 3주간 노출된 흰쥐의 배상세포 내에 검은 보라색으로 염색된 뮤신 (점액)의 양이 증가되어 있으며, 이산화황 1주 노출 후 2주간 MMT 동시 투여군 에서도 배상세포 내 검은 보라색으로 염색된 뮤신 (점액)의 양이 이산화황 3주 단독 흡입군 에서의 결과와 거의 유사한 경향을 보여주었다. 이는 MMT가 흰쥐에서 이산화황으로 유발된 기도 배상세포 내 점액 함유량 증가에 대해 뚜렷한 억제 경향을 나타내지 않음을 의미한다 (Fig.
동시에, 麥門冬湯은 최종 추출물 2µl/200µl 투여 시에는 24시간의 처리기간 동안 ATP로 유도된 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 감소시키는 듯한 경향을 보였으나, 농도가 증가할수록 특히 10µl/200µl 투여 시에는 MUC5AC mRNA의 발현 수준을 증가시키는 경향을 보여주었다 (Fig. 5).
또한, EGF로 유도된 MUC5AC mRNA 발현 수준은 10µl/200µl 투여 시 감소하는 듯한 경향을 보였으나, 2µl/200µl 와 5µl/200µl 투여 시에는 유의한 감소 경향을 나타내지 않았다 (Fig. 8).
마지막으로 麥門冬湯이 기도 점액의 분비를 조절하는 효능을 가지고 있음에도 불구하고 임상적으로 활용 ㄱ되기 위해서는 경구 투여 시 독성을 유발하지 않아야 하기 때문에, 기도점액 과다분비 흰쥐모델에 麥門冬湯을 투여 시 흰쥐의 체중증가에 미치는 영향과 간독성과 신독성에 미치는 영향을 측정한 결과, 2주간 麥門冬湯을 투여 받은 흰쥐의 간기능 및 신기능에 유의한 수준의 독성이 나타나지 않음을 알게 되었으며 또한 실험 전체 기간 중 각 실험동물의 체중 증가 정도에도麥門冬湯이 유의한 영향을 주지 않음으로써, 동물의 전반적인 영양 및 대사 상태에도 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다 (Fig. 10, 11, 12).
신장독성의 지표로는 Blood Urea Nitrogen (BUN)의 혈청 중 농도를 선정하였으며, 2주간의 麥門冬湯 경구 투여 후 Blood Urea Nitrogen (BUN)의 혈청 중 농도를 측정한 결과, 대조군과 麥門冬湯 투여군 간에 유의한 차이를 보이지 않음으로써 MMT가 실험동물에서 신장독성을 유발하지 않음을 알게 되었다 (Fig. 12).
8). 이러한 결과들을 요약해 보면, 麥門冬湯은 전반적으로 MUC5AC 뮤신의 생성 및 mRNA의 발현을 감소시키기 보다는 오히려 증가시키는 경향을 보여주었다.
9). 이러한 실험결과는 麥門冬湯이 호흡기 염증 상태에서 발생되는 기도 점액 과다분비 상태에서 淸熱, 消炎作用 등을 경유하여 뮤신의 생성 감소 및 분비 억제작용을 발현하기 보다는, 오히려 補陰, 滋陰作用을 통하여 肺陰虛, 肺燥상태에서의 점액의 생성 및 분비를 적절히 증가시킴으로써 호흡기 질환의 병태를 정상화 시킨다는 것을 보여준다고 할 수 있다.
이상의 연구결과를 종합하면, 麥門冬湯은 기도 뮤신의 생성을 정상화시키고 뮤신 유전자의 발현에 영향을 줌으로써 결과적으로 기도 점액의 분비를 조절하는 효과를 나타내었다. 이를 통해 麥門冬湯은 기도 점액 관련 병증을 나타내는 환자 중 특히 陰虛, 燥證에 의한 점액 객출부전상태의 환자에서 점액분비를 정상화 시켜 기도 점액 분비 부족상태를 동반하는 다양한 호흡기 질환에 활용될 수 있는 가능성이 있음을 제시하였다.
15% (V/V) Sodium metabisulfite (MBS) 수용액을 초음파 가습기에 주입하고 가습기를 작동시켰다. 작동 후 3분 이내에 MBS의 증기가 충만했고 작동 종료 시까지 실험장치 내부의 이산화황 농도는 130 - 150 ppm으로 유지되었다. 동물을 대조군 (무처치군), 이산화황 3주 처리군, 이산화황 1주 처리 후 최종 2주간 이산화황 처리 및 麥門冬湯 동시 투여군으로 무작위 배정하고, 각 군당 동물 수는 5마리 이상으로 하였다.

후속연구

다음으로, 麥門冬湯이 기도점액의 주된 생화학적 구성요소인 뮤신의 생성 및 유전자 발현 등 세포 및 분자 수준에서 영향을 줄 가능성이 크다면, 임상에서麥門冬湯이 인체에 경구로 투여된다는 점을 고려하여 실험동물을 대상으로 한 in vivo 실험에서는 麥門冬湯 이 어떠한 약리작용을 나타낼 지를 검증하기 위하여 후속연구가 필요하였다. 이를 위해 이산화황 흡입으로 유발된 기도 점액 과다분비 동물모델에 麥門冬湯을 2주간 경구투여한 후 기도 배상세포 내의 점액 함유량에 대한 麥門冬湯의 영향을 조직병리학적인 방법으로 확인하였다.
이를 통해 麥門冬湯은 기도 점액 관련 병증을 나타내는 환자 중 특히 陰虛, 燥證에 의한 점액 객출부전상태의 환자에서 점액분비를 정상화 시켜 기도 점액 분비 부족상태를 동반하는 다양한 호흡기 질환에 활용될 수 있는 가능성이 있음을 제시하였다. 앞으로 뮤신 분비 조절기전에 관한 자세한 연구와 함께 인체에 임상적으로 활용할 수 있는 효과적인 투여량과 각 성분의 역할에 관한 연구, 특정한 호흡기 질환 연구모델에서의 효과에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	상피 배상세포 내의 점액 함유량에 대한 麥門冬湯의 영향을 분석해본 연구 결과는 무엇인가?	1. 麥門冬湯은 배양된 인체 기도 상피 세포에서 뮤신 생성과 그 유전자 발현을 증가시키는 경향을 보여주었다. 2. 이산화황으로 유발된 기도 점액 과다 분비 흰쥐 모델에 麥門冬湯을 경구 투여한 결과, 기도 배상 세포 내 점액 함유량을 증가시키는 경향을 보여주었다. 3. 麥門冬湯을 실험동물에게 투여하였을 때 체중증가도, 간기능 및 신장 기능에 영향을 주지 않음으로써 생체 독성을 유발하지 않음을 보여 주었다.
	객담 혹은 점액은 무엇으로 구성되는가?	기도질환을 일으키는 주요 원인 중 하나인 객담 혹은 점액 (mucus)은 당단백질, 수분, 전해질, 지질로 구성되며 기도 내 배상세포 및 점막 하 분비선 등에서 생성된 후 점막에 도포되며3) , 뮤신 (mucin)은 점액성 당단백질 (mucous glycoprotein)로 점액에 점탄성(viscoelasticity) 을 부여하는 중요한 구성 요소이며 기도 내강에서 상피세포층을 이루고 있는 섬모세포와의 작용을 통해 인체에 유해한 요소들의 제거에 있어서 중요한 역할을 한다4) . 그러나 정상상태에서는 뮤신이 기도의 방어 작용을 하지만, 양과 질에 이상이 생기면 호흡기 생리 및 방어 작용에 영향을 주어 병리적 요소로 작용하여 질환 악화의 주요한 원인이 된다5) .
	뮤신은 어떤 역할을 하는가?	기도질환을 일으키는 주요 원인 중 하나인 객담 혹은 점액 (mucus)은 당단백질, 수분, 전해질, 지질로 구성되며 기도 내 배상세포 및 점막 하 분비선 등에서 생성된 후 점막에 도포되며3) , 뮤신 (mucin)은 점액성 당단백질 (mucous glycoprotein)로 점액에 점탄성(viscoelasticity) 을 부여하는 중요한 구성 요소이며 기도 내강에서 상피세포층을 이루고 있는 섬모세포와의 작용을 통해 인체에 유해한 요소들의 제거에 있어서 중요한 역할을 한다4) . 그러나 정상상태에서는 뮤신이 기도의 방어 작용을 하지만, 양과 질에 이상이 생기면 호흡기 생리 및 방어 작용에 영향을 주어 병리적 요소로 작용하여 질환 악화의 주요한 원인이 된다5) .

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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