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문제 정의
- 식품 내에 존재하고 있는 정상 세균총은 배양과정에서 목적균과 경쟁적으로 작용하여 목적균의 검출에 영향을 줄 수 있는 것으로 알려져 있다(10). 따라서 본 연구에서는 정상 세균총이 Y. enterocolitica 검출에 미치는 영향을 과학적으로 평가하기 위하여 식품 시료 내 정상 세균총을 함께 측정하였다. 정상 세균총은 실험에 사용된 식품 시료 외에 아무것도 접종되지 않은 25 g의 동일한 시료에서 측정하였으며 아래와 같이 aerobic plate count 방법을 사용하였다.
- 본 연구에서는 식품에서 real-time PCR과 배지검출법을 비교 검증하여 real-time PCR이 표준화된 검출법인 배지검출법에 비해 어느 정도의 민감도와 신속성을 가지고 있는지 비교평가 하였다. 순수 배양액에서 사용된 real-time PCR의 특이도와 검출한계를 측정하였으며, 실제 식품에 인위적으로 접종하여 배지검출법과 비교하였다.
가설 설정
- 1)Different letters within a row indicate a significant difference (p<0.05).
제안 방법
- 5개의 Y. enterocolitica와 6개의 Y. enterocolitica가 아닌 균주에서 real-time PCR을 실시하여 특이도를 측정하였으며 검증을 위한 균주는 −70℃에 보관하고 있다가 위에서 언급한대로 해동하여 사용하였다.
- 5 µL, template DNA는 5 µL를 넣어주었다. ABI PRISM 7500HT sequence detection system(Applied Biosystems)을 사용하여 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시킨 다음, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분을 1회로 반응조건을 맞추어 40 cycles을 반응시켰다.
- 검출한계는 위에서 언급된 방법으로 균수를 측정하여 108 CFU/mL 수준의 균수를 함유한 순수 배양균액을 사용하여 측정되었다. 순수 배양균액의 DNA를 추출한 후, 추출된 DNA 중 5 µL를 45 µL의 PBS에 10진 희석법으로 단계적으로 희석(108 CFU/mL에서 102 CFU/mL까지)한 것으로 real-time PCR을 시행하여 검출한계를 측정하였다.
- 균수가 측정된 순수 배양균액의 genomic DNA를 PBS로 10진 희석한 후, real-time PCR을 실시하여 각 단계별 농도에서 Ct값을 측정하였다. 측정된 Ct값은 Table 2에 제시되어 있으며 검출 가능한 한계농도는 103 CFU/mL 수준으로 나타났다.
- 냉동 보관(−70℃)되어 있던 Y. enterocolitica 균주를 녹여 cefsulodin-irgasan-novobiocin agar(CIN agar; Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하였다.
- enterocolitica를 접종하고 PSBB에서 증균배양 하였으며, CIN agar에서 선택배양하였다. 동시에 증균배양액에서 1 mL을 채취하여 real-time PCR을 실시하였다. 실험결과, real-time PCR은 소시지에서 배지검출법과 비교하여 동일한 검출력을 보였으나 야채 샐러드에서는 훨씬 더 많은 양성을 검출하였다(p< 0.
- 1 mL를 PBS에 10진 희석법으로 단계별로 희석하여 NA에 접종하고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 NA상의 집락을 계수하고 희석배수를 고려하여 각 시료 내의 정상 세균 총 수를 최종적으로 산출하였다.
- 배양 후, CIN agar에서 중심부가 짙은 적색을 보이는 집락을 골라 triple sugar iron(Difco) 사면배지에 접종하고 35℃에서 24시간 배양 후, 고층부와 사면이 노랗고 황화수소가 발생하지 않은 균주를 선택하여 API 20 E kit(BioMerieux, Marcy I’Etoile, France)를 이용하여 생화학적 확인동정을 실시하였다.
- 본 연구에서는 소시지와 야채 샐러드에서 Y. enterocolitica의 검출을 위해 배지법과 real-time PCR법을 비교하였다. 소시지와 야채 샐러드에 Y.
- 사용된 primers/probe set를 이용하여 특이도와 검출한계를 측정하였다. 5개의 Y.
- enterocolitica의 검출을 위해 배지법과 real-time PCR법을 비교하였다. 소시지와 야채 샐러드에 Y. enterocolitica를 접종하고 PSBB에서 증균배양 하였으며, CIN agar에서 선택배양하였다. 동시에 증균배양액에서 1 mL을 채취하여 real-time PCR을 실시하였다.
- 순수 배양균액의 DNA를 추출한 후, 추출된 DNA 중 5 µL를 45 µL의 PBS에 10진 희석법으로 단계적으로 희석(108 CFU/mL에서 102 CFU/mL까지)한 것으로 real-time PCR을 시행하여 검출한계를 측정하였다.
- 본 연구에서는 식품에서 real-time PCR과 배지검출법을 비교 검증하여 real-time PCR이 표준화된 검출법인 배지검출법에 비해 어느 정도의 민감도와 신속성을 가지고 있는지 비교평가 하였다. 순수 배양액에서 사용된 real-time PCR의 특이도와 검출한계를 측정하였으며, 실제 식품에 인위적으로 접종하여 배지검출법과 비교하였다. 식품 내 접종 시에는 정상 세균총의 수준이 다른 두 가지 식품시료에 대해 실험하였으며, 두 방법 간의 차이를 정확히 분석하기 위해 20개의 시료 중, 부분양성과 부분음성이 나와 양성검출율의 통계학적 차이를 비교할 수 있도록 실험을 수행하였다.
- 식품 내 인위접종 실험을 위해 TSB 배지에서 배양된 Y. enterocolitica를 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4; Sigma, St Louis, MS, USA)로 적절히 희석한 후 500 g의 bulk 시료에 접종하고 균이 고르게 분포되도록 손으로 마사지 하였다. 추가적으로 25 g을 양성 대조군으로, 또 다른 25 g을 음성 대조군으로 설정해주고, 양성 대조군에는 107 CFU/mL 이상의 Y.
- 순수 배양액에서 사용된 real-time PCR의 특이도와 검출한계를 측정하였으며, 실제 식품에 인위적으로 접종하여 배지검출법과 비교하였다. 식품 내 접종 시에는 정상 세균총의 수준이 다른 두 가지 식품시료에 대해 실험하였으며, 두 방법 간의 차이를 정확히 분석하기 위해 20개의 시료 중, 부분양성과 부분음성이 나와 양성검출율의 통계학적 차이를 비교할 수 있도록 실험을 수행하였다.
- 접종이 끝난 모든 시료는 Han 등(9)과 Lee 등(10)의 연구를 참조하여 4℃에서 하루 동안 보관하여 실제 식품 보관 환경과 유사한 환경 속에서 안정화 과정을 거쳤다. 식품에 실질적으로 접종된 균수가 어느 정도인지 확인하기 위하여 접종과 동시에 접종량과 동일균량을 NA에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 실제 접종량을 산정하였다.
- 안정화 과정이 끝난 시료 500 g을 25 g씩 20개로 나누어 멸균 비닐백에 넣은 후 증균배지로 225 mL peptone-sorbitol-bile-broth(PSBB; Oxoid, Hampshire, U.K.)를 첨가하고 stomacher(Bag-Mixer’s Interscience, St. Nom, France)를 이용하여 30초간 균질화 ㅈ하였다.
- 섞어 준 균액을 100℃의 물에서 10분간 가열하고 2분 동안 상온에서 식힌 후, 14,000 rpm으로 3분간 다시 원심분리 하였다. 원심분리가 끝난 시료의 상층액을 새로운 튜브에 따로 담아 real-time PCR을 수행할 template DNA로 사용하였다.
- 접종량은 Hyeon 등(8)의 연구와 Han 등(9)의 연구를 참조하여 총 20개의 시료 중 일부분의 양성결과가 나와 통계학적 유의차를 비교할 수 있도록 설정하였으며, 각 시료당 3회의 반복실험을 실시하였다.
- 4; Sigma, St Louis, MS, USA)로 적절히 희석한 후 500 g의 bulk 시료에 접종하고 균이 고르게 분포되도록 손으로 마사지 하였다. 추가적으로 25 g을 양성 대조군으로, 또 다른 25 g을 음성 대조군으로 설정해주고, 양성 대조군에는 107 CFU/mL 이상의 Y. enterocolitica를, 음성 대조군에는 1 mL의 PBS를 접종하였다. 접종이 끝난 모든 시료는 Han 등(9)과 Lee 등(10)의 연구를 참조하여 4℃에서 하루 동안 보관하여 실제 식품 보관 환경과 유사한 환경 속에서 안정화 과정을 거쳤다.
대상 데이터
- 5균주의 Y. enterocolitica와 6균주의 non- Y. enterocolitica(Listeria monocytogens, Cronobacter sakazakii, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolyticus)가 실험에 사용되었다. Y.
- enterocolitica(Listeria monocytogens, Cronobacter sakazakii, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolyticus)가 실험에 사용되었다. Y. enterocolitica는 환경 분리주로서 서울시 보건환경연구원(Seoul, Korea)으로부터 분양 받았으며 그 외의 균주는 본 실험실에서 보관하고 있던 균주를 사용하였다. 냉동 보관(−70℃)되어 있던 Y.
- 정상 세균총의 수준에 따라 real-time PCR의 검출감도에 큰 차이가 있다는 앞선 연구를 바탕으로, 냉장 보관되는 제품이면서 정상 세균총에 차이를 보이는 가공육류와 신선야채를 시료로 선정하였다. 가공육류는 소시지를 사용하였으며, 신선야채로는 야채 샐러드를 사용하였다.
- enterocolitica 균주를 녹여 cefsulodin-irgasan-novobiocin agar(CIN agar; Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하였다. 검출한계 측정 및 식품 내 인위접종 실험을 위해 배양 후 단일 Y. enterocolitica 집락을 채취하여 tryptic soy broth(TSB; Difco)에서 2번 이상 계대하였으며 배양한 균액을 적절히 희석하여 실험에 사용하였다.
- 모든 식품시료는 서울시 광진구에 위치한 대형마트에서 구매하였으며, 구매 즉시 실험실로 옮긴 후 4℃에 보관하였다. 보관된 시료는 12시간 이내에 실험에 사용하였다.
- 보관된 시료는 12시간 이내에 실험에 사용하였다. 정상 세균총의 수준에 따라 real-time PCR의 검출감도에 큰 차이가 있다는 앞선 연구를 바탕으로, 냉장 보관되는 제품이면서 정상 세균총에 차이를 보이는 가공육류와 신선야채를 시료로 선정하였다. 가공육류는 소시지를 사용하였으며, 신선야채로는 야채 샐러드를 사용하였다.
데이터처리
- 배지법과 real-time PCR을 수행하여 얻은 양성 시료 수 결과의 유의적인 차이를 GraphPad Instat(GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA)의 Fisher’s extract test를 통해 비교하였다.
이론/모형
- Real-time PCR은 Sen 등(12)의 연구를 참조하여 Y. enterocolitica에 종 특이적인 16S rRNA 유전자를 타겟으로 한 primer/probe서열을 사용하였다. Forward primer는 CGGCAGCGGGAAGTAGTTT, reverse primer는 GCCATTACCCCACCTACTAGCTAA, probe는 5'-FAM-AAGGTCCCCCACTTTGGTCCGAAG-TAMRA-3'를 사용하였다.
- Real-time PCR을 시행하기 위해 증균된 각 시료에서 1 mL을 채취하여 DNA를 추출하였으며 아래와 같이 Chon 등(11)의 방법을 사용하였다. 채취한 1 mL의 배지액을 14,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 상층액을 버린 후, PrepMan® Ultra reagent(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 0.
- enterocolitica 검출에 미치는 영향을 과학적으로 평가하기 위하여 식품 시료 내 정상 세균총을 함께 측정하였다. 정상 세균총은 실험에 사용된 식품 시료 외에 아무것도 접종되지 않은 25 g의 동일한 시료에서 측정하였으며 아래와 같이 aerobic plate count 방법을 사용하였다. 25 g의 시료를 멸균 비닐 백에 225 mL buffered peptone water(Difco)와 함께 넣어준 후 stomacher를 이용하여 30초간 균질화 시켜주었다.
성능/효과
- enterocolitica에서는 양성을 나타내고 6개의 non-Y. enterocolitica 균주에서는 음성을 나타내어 사용된 primer와 probe가 Y. enterocolitica의 검출에 적합함을 확인하였다.
- 결론적으로 real-time PCR은 Y. enterocolitica의 검출에 있어서 식품의 성상이나 정상 세균총의 수에 관계없이 표준검출법인 배지검출법과 동등하거나 더 우수한 검출민감도를 가진 기법으로 사료된다. 현재 미국 농림부 식품검사국(United States Department of Agriculture/Food Safety and Inspection Service, Washington, DC, USA)에서는 다양한 분자유전학적인 방법을 screening method로 적용하여, 4-8시간 가량 균을 증균하고 PCR을 수행하여 양성인 경우에만 배지검출법으로 검출하고 있다(15).
- 05). 결론적으로 real-time PCR은 식품 시료와 관계없이 표준검출법인 배지검출법과 비교하여 동등하거나 우수한 민감도를 지닌 신속검출기법인 것으로 사료되며, 배지검출법에 앞서 선별검사로 사용할 경우 시간, 비용, 노동력 절감에 있어서 매우 유효한 방법이 될 것으로 판단된다.
- 신선야채는 가열과정 없이 섭취되는 경우가 많고, 조리과정에서 다른 식품과 교차오염이 가능하기 때문에 식중독 감염의 큰 위험요인으로 지적되고 있다(8,11,13). 따라서 신선야채에서의 증균억제 현상은 Y. enterocolitica 식중독 발생에 있어서 잠재적인 위험요소가 될 수 있을 것으로 판단된다.
- 소시지에서는 g 당 2.5×102 CFU 수준의 정상 세균총이 검출되었고, 야채 샐러드에서는 g 당 1.5×106 CFU 수준의 정상 세균총을 보여 야채 샐러드가 소시지에 비해 104배 가량 높은 수준의 정상 세균총을 보였다.
- 소시지의 경우 배지검출법에서는 총 60개의 시료 중 총 49개가 양성을 보였고, real-time PCR에서는 60개중 50개의 양성을 보여 두 방법은 거의 동일한(p>0.05) 검출감도를 보여주었다(Table 3).
- 실험결과, real-time PCR은 소시지에서 배지검출법과 비교하여 동일한 검출력을 보였으나 야채 샐러드에서는 훨씬 더 많은 양성을 검출하였다(p< 0.05).
- 5×106 CFU 수준의 정상 세균총을 보여 야채 샐러드가 소시지에 비해 104배 가량 높은 수준의 정상 세균총을 보였다. 한편 20개의 시료가 부분양성과 부분음성이 되기 위한 Y. enterocolitica의 접종량은 소시지에서는 g당 0.06-0.30 CFU 수준이었으나, 야채 샐러드에서는 g당 4.5-4.8 CFU 가량으로 15-100배 가량 더 높았다(Table 3).
후속연구
- 현재 미국 농림부 식품검사국(United States Department of Agriculture/Food Safety and Inspection Service, Washington, DC, USA)에서는 다양한 분자유전학적인 방법을 screening method로 적용하여, 4-8시간 가량 균을 증균하고 PCR을 수행하여 양성인 경우에만 배지검출법으로 검출하고 있다(15). 이와 같이 realtime PCR을 표준검출법인 배지검출법에 앞서 음성시료를 신속하게 배제 할 수 있는 screening test에 사용한다면 빠르고 정확한 균의 선별이 가능하여, 시간과 노동력을 절감하며 정확한 검출을 수행할 수 있을 것으로 보인다.
- 측정된 Ct값은 Table 2에 제시되어 있으며 검출 가능한 한계농도는 103 CFU/mL 수준으로 나타났다. 해당 검출한계는 증균을 거치는 정성실험에서 활용가능 할 것으로 보이며 정량실험에서의 활용여부에 대해서는 추가적인 정량평가 실험이 필요할 것으로 보인다.
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