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문제 정의
- 본 연구는 도축장에서 폐기되는 도축 반추위 내용물을 사일리지 혹은 TMR (total mixed ration) 사료 첨가용 효소제로 개발하기 위한 목적으로 수행되었다. 도축 반추위 내용물에는 상당한 수분이 함유되어 있어, 적절한 건조과정을 거치지 않고서는 그 활용이 원활하지 않다.
- 본 연구에서는 SRC를 가축사료, 특히 사일리지 및 TMR(total mixed ration)과 같은 반추동물 급여용 사료에 효소가 풍부한 첨가제 또는 대체사료로 활용하기 위한 방법을 개발하기 위한 기초자료로써 다양한 가열 조건들이 도축 반추위 내용물에 함유된 효소들에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 각 변수들이 도축 반추위액에 포함된 효소들의 활성에 미치는 효과들은 각 변수들의 주효과와 곡률효과 및 상호작용 효과 등을 분석하기 위하여 부분 요인 실험설계법 중 하나인 Box-Behnken design(BBD)을 이용하였다. BBD에 따라서 총 15개의 서로 다른 변수들의 조합을 설계하였고, 각 실험당 3반복으로 구성하여 총 45개의 실험을 구성하였다. 실험설계법에 의하여 얻어진 총 45개의 실험들에서 분석된 효소활성은 (xylan 분해 효소, 셀룰로오스 분해효소, 전분 분해효소) Table 1에서 보는 것과 같다.
- 준비된 도축 반추위 내용물은 실험설계에 따라서 부형제 (말분)와 혼합한 후에 250 mL용량의 유리용기(aluminum seal stopper)에 실용량 100 mL로 담아 실험설계에 따라 정해진 온도와 시간 동안 가열처리 하였다. 가열처리는 항온수조에서 온도를 달리하여 수행하였다. 실험설계의 조건은 Table 1에 표기하였다.
- 도축 반추위 내용물을 분쇄한 후, 부형제와 혼합하였고 다양한 온도에서 가열한 후에 효소활성을 분석하였다. 도축 반추위 내용물과 부형제의 혼합비율, 가열온도 및 가열 시간을 변수로 설정하였다. 각 변수들이 도축 반추위액에 포함된 효소들의 활성에 미치는 효과들은 각 변수들의 주효과와 곡률효과 및 상호작용 효과 등을 분석하기 위하여 부분 요인 실험설계법 중 하나인 Box-Behnken design(BBD)을 이용하였다.
- 도축 반추위 내용물을 분쇄한 후, 부형제와 혼합하였고 다양한 온도에서 가열한 후에 효소활성을 분석하였다. 도축 반추위 내용물과 부형제의 혼합비율, 가열온도 및 가열 시간을 변수로 설정하였다.
- 본 연구에서는 통계적 방법을 이용하여 가열온도(60, 75, 90°C), 가열시간(12, 30, 48시간) 및 부형제의 비율(12, 22.5, 33%)이 도축 반추위 내용물에 함유된 다양한 효소활성에 미치는 효과를 분석하였다.
- 마지막으로 부형제의 비율은 12%에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 실험에 사용된 요인들간의 상호작용은 반응표면모형 근사화 결과에서 얻어진 유의성을 바탕으로 온도와 부형제 그리고 시간과 부형제의 함량을 분석하였고, 그 결과는 각각 Fig. 2C와 2D에서 보는 것과 같다. 온도 60°C 미만과 부형제 함량 20% 미만에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다.
- 실험이 완료된 혼합물들의 효소활성을 평가하였다. 효소활성의 분석은 Son et al.
- 경상북도 구미에 소재한 도축장에서 채취된 반추위 내용물을 보온병에 담아서 실험실로 옮긴 후에 건조과정 없이 cutter miller로 분쇄하여 입자도를 작게 하였다. 이때 공기중의 산소 유입을 최소화하기 위하여 이산화탄소를 주사하며 분쇄 작업을 수행하였다. 준비된 도축 반추위 내용물은 실험설계에 따라서 부형제 (말분)와 혼합한 후에 250 mL용량의 유리용기(aluminum seal stopper)에 실용량 100 mL로 담아 실험설계에 따라 정해진 온도와 시간 동안 가열처리 하였다.
- 전분 분해효소 활성에 대한 변수들의 효과에 대한 분산 분석에서 변수들의 효과 회귀모형, 선형효과, 곡률효과 및 상호관계 모두에서 95% 이상의 통계적 유의성이 나타났다(Table 6). 이에 보다 정확한 변수들의 효과를 조사하기 위하여, 총 45개의 실험들에서 얻어진 xylan 분해효소 활성값들을, 적용된 변수들의 수준들을 이용하여 반응표면모형을 근사화 하였고, 그 결과로 얻어진 회귀계수들과 그 확률값들은 Table 7에서 보는 것과 같다. 주효과 및 곡률효과 모두에서 가열시간만이 유의적인 효과를 나타내었다(p<0.
- Xylan 분해효소활성에 대한 변수들의 효과에 대한 분산 분석에서 변수들의 효과, 회귀모형, 선형효과, 곡률효과 및 상호관계 모두에서 95% 이상의 통계적 유의성이 나타났다(Table 2). 이에 보다 정확한 변수들의 효과를 조사하기 위하여, 총 45개의 실험들에서 얻어진 xylan 분해효소 활성값들을, 적용된 변수들의 수준들을 이용하여 반응표면모형을 근사화하였고, 그 결과로 얻어진 회귀계수들과 그 확률값들은 Table 3에서 보는 것과 같다. 주 효과에서는 모든 변수들에서 유의성이 나타났다 (p<0.
- 셀룰로오스 분해효소 활성에 대한 변수들의 효과에 대한 분산분석에서 변수들의 효과 회귀모형, 선형효과, 곡률효과 및 상호관계 모두에서 95% 이상의 통계적 유의성이 나타났다 (Table 4). 이에 보다 정확한 변수들의 효과를 조사하기 위하여, 총 45개의 실험들에서 얻어진 셀룰로오스 분해 효소 활성값들을, 적용된 변수들의 수준들을 이용하여 반응표면모형을 근사화하였고, 그 결과로 얻어진 회귀계수들과 그 확률값들은 Table 5에서 보는 것과 같다. 주 효과에서는 온도와 시간에서 유의성이 나타났으며(p<0.
- 전분 분해효소 측성 시에는 soluble starch (Difco), 셀룰로오스 분해효소 측정 시에는 carboxymethyl cellulose (CMC, Sigma) 그리고 xylan 분해효소 측정 시에는 birch wood xylan (Sigma)을 기질로 사용하였다. 전분 분해효소와 xylan 분해효소 측정 시에는 기질을 10 mM Tris-HCl (pH 7.0)에 1% 혼합하여 기질 용액을 제조하였고, 셀룰로오스 분해효소의 경우에는 기질을 0.5% 혼합하여 제조하였다. 효소반응은 시료 1 g에 기질용액 9 ml을 혼합한 후에 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 후(150 rpm)에 원심분리(10,000 rpm-5 min)하여 상등액을 분리하였다.
- 이때 공기중의 산소 유입을 최소화하기 위하여 이산화탄소를 주사하며 분쇄 작업을 수행하였다. 준비된 도축 반추위 내용물은 실험설계에 따라서 부형제 (말분)와 혼합한 후에 250 mL용량의 유리용기(aluminum seal stopper)에 실용량 100 mL로 담아 실험설계에 따라 정해진 온도와 시간 동안 가열처리 하였다. 가열처리는 항온수조에서 온도를 달리하여 수행하였다.
- 0) 용액과 반응한 용액의 흡광도를 이용하여 배제하였다. 효소반응을 통하여 유리된 당(sugar)의 농도는 회귀방정식을 이용하여 평가하였으며, 각 효소 별로 사용된 표준물질로서 전분 분해효소와 셀룰로오스 분해효소는 포도당을 사용하였고, xylan 분해효소는 xylose를 표준물질로 사용하였다. 효소활성 단위 1 unit (U)는 분당 시료 1 g으로부터 생성된 1 µM glucose 혹은 xylose로 나타내었다.
대상 데이터
- 경상북도 구미에 소재한 도축장에서 채취된 반추위 내용물을 보온병에 담아서 실험실로 옮긴 후에 건조과정 없이 cutter miller로 분쇄하여 입자도를 작게 하였다. 이때 공기중의 산소 유입을 최소화하기 위하여 이산화탄소를 주사하며 분쇄 작업을 수행하였다.
- 실험설계법에 따라서 구성된 실험들과 각 실험들에 배치된 요인들의 수준은 Table 1에서 보는 것과 같다. 모든 실험은 블록 없이 3반복으로 하여 총 45개의 실험을 구성하였다 (Table 1).
- (2006)의 방법에 따라 분석하였으며 이를 요약하면 다음과 같다. 전분 분해효소 측성 시에는 soluble starch (Difco), 셀룰로오스 분해효소 측정 시에는 carboxymethyl cellulose (CMC, Sigma) 그리고 xylan 분해효소 측정 시에는 birch wood xylan (Sigma)을 기질로 사용하였다. 전분 분해효소와 xylan 분해효소 측정 시에는 기질을 10 mM Tris-HCl (pH 7.
데이터처리
- 각 요인들의 효과에 대한 유의성은 분산분석을 통하여 검정하였으며, 각 요인들의 개별적인 주 효과, 곡률효과 및 상호관계는 반응표면모형(response surface model)을 근사화하여 산출하였다. 실험결과의 분석은 Minitab, version 14(Minitab Inc.
- 각 요인들의 효과에 대한 유의성은 분산분석을 통하여 검정하였으며, 각 요인들의 개별적인 주 효과, 곡률효과 및 상호관계는 반응표면모형(response surface model)을 근사화하여 산출하였다. 실험결과의 분석은 Minitab, version 14(Minitab Inc., 2010) 통계 프로그램을 사용하였다.
- 마지막으로 부형제의 비율은 12%에서 33% 중간 정도에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 실험에 사용된 요인들간의 상호작용은 반응표면모형 근사화 결과에서 얻어진 유의성을 바탕으로 온도와 시간 그리고 시간과 부형제의 함량을 분석하였고, 그 결과는 각각 Fig. 2A와 2B에서 보는 것과 같다. 요인들의 개별적인 효과는 그림에서와 같이 온도 85°C 이상과 열처리 20시간 미만에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다.
이론/모형
- 도축 반추위 내용물과 부형제의 혼합비율, 가열온도 및 가열 시간을 변수로 설정하였다. 각 변수들이 도축 반추위액에 포함된 효소들의 활성에 미치는 효과들은 각 변수들의 주효과와 곡률효과 및 상호작용 효과 등을 분석하기 위하여 부분 요인 실험설계법 중 하나인 Box-Behnken design(BBD)을 이용하였다. BBD에 따라서 총 15개의 서로 다른 변수들의 조합을 설계하였고, 각 실험당 3반복으로 구성하여 총 45개의 실험을 구성하였다.
- 다양한 가열 조건에 대한 요인들로 열처리온도 (60, 75, 90℃) 열처리시간 (12, 30, 48시간) 및 부형제와의 혼합비율(12, 22.5, 33%)을 선택하였고, 실험설계는 부분요인 분석법 중 하나인 Box-Behnken 실험설계법(Box and Behnken, 1960)에 따라서 수행하였다. 실험설계법에 따라서 구성된 실험들과 각 실험들에 배치된 요인들의 수준은 Table 1에서 보는 것과 같다.
- 실험이 완료된 혼합물들의 효소활성을 평가하였다. 효소활성의 분석은 Son et al. (2006)의 방법에 따라 분석하였으며 이를 요약하면 다음과 같다. 전분 분해효소 측성 시에는 soluble starch (Difco), 셀룰로오스 분해효소 측정 시에는 carboxymethyl cellulose (CMC, Sigma) 그리고 xylan 분해효소 측정 시에는 birch wood xylan (Sigma)을 기질로 사용하였다.
성능/효과
- Xylan 분해효소에 대한 온도의 효과는 60°C에서 90°C로 증가할수록, 효소활성이 향상되는 것으로 나타났다.
- Xylan 분해효소활성에 대한 변수들의 효과에 대한 분산 분석에서 변수들의 효과, 회귀모형, 선형효과, 곡률효과 및 상호관계 모두에서 95% 이상의 통계적 유의성이 나타났다(Table 2). 이에 보다 정확한 변수들의 효과를 조사하기 위하여, 총 45개의 실험들에서 얻어진 xylan 분해효소 활성값들을, 적용된 변수들의 수준들을 이용하여 반응표면모형을 근사화하였고, 그 결과로 얻어진 회귀계수들과 그 확률값들은 Table 3에서 보는 것과 같다.
- 가열온도를 증가할수록 효소활성은 급격하게 낮아짐을 알 수 있었다. 가열시간은 양극점에서 활성이 높은 형태를 나타내었으나, 12시간에서 비교적 높은 활성을 나타내었다. 마지막으로 부형제의 함량이 증가할수록 효소활성이 높게 나타났다.
- 1C에서 보는 것과 같다. 가열온도를 증가할수록 효소활성은 급격하게 낮아짐을 알 수 있었다. 가열시간은 양극점에서 활성이 높은 형태를 나타내었으나, 12시간에서 비교적 높은 활성을 나타내었다.
- 실험설계법에 의하여 얻어진 총 45개의 실험들에서 분석된 효소활성은 (xylan 분해 효소, 셀룰로오스 분해효소, 전분 분해효소) Table 1에서 보는 것과 같다. 가장 우수한 활성을 나타낸 효소는 전분분해효소로서 실험들간의 평균(표준편차)은 325.2 (51.9) U로 나타났다. 다음으로는 xylan 분해효소 활성이 우수하였으며 실험들간의 평균은 244.
- 곡률효과에 있어서는 시간 (time)과 부형제 혼합비율(filler)에서 유의적인 효과가 나타났다(p<0.05).
- 9) U로 나타났다. 다음으로는 xylan 분해효소 활성이 우수하였으며 실험들간의 평균은 244.1 (28.8) U로 나타났다. 셀룰로 오스 분해효소 활성은 가장 낮게 나타났으며, 실험들간의 평균은 69.
- 온도 60°C 미만과 부형제 함량 20% 미만에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 또한 15시간 이하의 열처리시간과 22%미만의 부형제 함량 조건 그리고 45시간 이상의 열처리시간과 22% 이상의 부형제 함량에서 효소활성이 높게 나타났다.
- 반면 열처리시간은 12시간에서 48시간으로 증가할수록 효소활성이 낮아지는 것으로 나타났다. 마지막으로 부형제의 비율은 12%에서 33% 중간 정도에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 실험에 사용된 요인들간의 상호작용은 반응표면모형 근사화 결과에서 얻어진 유의성을 바탕으로 온도와 시간 그리고 시간과 부형제의 함량을 분석하였고, 그 결과는 각각 Fig.
- 열처리시간 또한 12시간에서 48시간으로 증가할수록 효소활성이 낮아지는 것으로 나타났다. 마지막으로 부형제의 비율은 12%에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 실험에 사용된 요인들간의 상호작용은 반응표면모형 근사화 결과에서 얻어진 유의성을 바탕으로 온도와 부형제 그리고 시간과 부형제의 함량을 분석하였고, 그 결과는 각각 Fig.
- 가열시간은 양극점에서 활성이 높은 형태를 나타내었으나, 12시간에서 비교적 높은 활성을 나타내었다. 마지막으로 부형제의 함량이 증가할수록 효소활성이 높게 나타났다. 실험에 사용된 요인들간의 상호작용은 반응표면모형 근사화 결과에서 얻어진 유의성을 바탕으로 온도와 부형제 그리고 시간과 부형제의 함량을 분석하였고, 그 결과는 각각 Fig.
- Xylan 분해효소에 대한 온도의 효과는 60°C에서 90°C로 증가할수록, 효소활성이 향상되는 것으로 나타났다. 반면 열처리시간은 12시간에서 48시간으로 증가할수록 효소활성이 낮아지는 것으로 나타났다. 마지막으로 부형제의 비율은 12%에서 33% 중간 정도에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다.
- 요인들의 개별적인 효과는 그림에서와 같이 온도 85°C 이상과 열처리 20시간 미만에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 반면, 열처리시간과 부형제 함량과의 관계에서는 40시간 미만의 가열시간과 15~30%사이의 조건에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다.
- 본 실험의 결과들을 종합해보면 처리과정을 달리할 경우 도축 반추위 내용물을 폐기물로 처리하지 않고 가축사료 첨가용 효소제의 생산 기질로 재활용할 수 있는 잠재성이 있는 것으로 여겨진다. 반추위 내용물에 포함된 다양한 미지영양인자까지 고려하면 반추동물 사료효율 개선 및 생산성 향상, 그리고 사료비 절감을 통한 생산비의 절감에 기여하는, 특히 사료분해 효소가 풍부한, 사료첨가제로서 이용이 가능할 것으로 사료된다.
- 상호작용에 있어서는 열처리온도와 시간에서 유의적인 효과가 나타났다(p<0.05).
- 상호작용에 있어서는 온도와 부형재 함량 그리고 기간과 부형제의 함량에서 유의적인 효과가 나타났다 (p<0.05).
- 상호작용에 있어서는 온도와 시간(heat × time) 그리고 시간과 부형제 혼합비율(time × filler)에서 유의성이 나타났다(p<0.05).
- 8) U로 나타났다. 셀룰로 오스 분해효소 활성은 가장 낮게 나타났으며, 실험들간의 평균은 69.5 (17.6) U로 나타났다.
- 셀룰로 오스 분해효소와 전분 분해효소의 활성은 가열온도가 증가함에 따라 감소하였으며(p<0.05), xylan 분해해소는 열에 대한 안전성이 다른 효소들에 비하여 우수하였다.
- 셀룰로오스 분해효소 활성에 대한 변수들의 효과에 대한 분산분석에서 변수들의 효과 회귀모형, 선형효과, 곡률효과 및 상호관계 모두에서 95% 이상의 통계적 유의성이 나타났다 (Table 4). 이에 보다 정확한 변수들의 효과를 조사하기 위하여, 총 45개의 실험들에서 얻어진 셀룰로오스 분해 효소 활성값들을, 적용된 변수들의 수준들을 이용하여 반응표면모형을 근사화하였고, 그 결과로 얻어진 회귀계수들과 그 확률값들은 Table 5에서 보는 것과 같다.
- 셀룰로오스 분해효소에 대한 온도의 효과는 60°C에서 90°C로 증가할수록, 효소활성이 급격하게 감소하는 것으로 나타났다.
- 마지막으로 부형제의 함량이 증가할수록 효소활성이 높게 나타났다. 실험에 사용된 요인들간의 상호작용은 반응표면모형 근사화 결과에서 얻어진 유의성을 바탕으로 온도와 부형제 그리고 시간과 부형제의 함량을 분석하였고, 그 결과는 각각 Fig. 2E에 표기하였는데 열처리온도와 열처리시간은 각각의 요인들이 가질 수 있는 최소값에서 가장 우수한 효소활성이 나타났다.
- 셀룰로오스 분해효소에 대한 온도의 효과는 60°C에서 90°C로 증가할수록, 효소활성이 급격하게 감소하는 것으로 나타났다. 열처리시간 또한 12시간에서 48시간으로 증가할수록 효소활성이 낮아지는 것으로 나타났다. 마지막으로 부형제의 비율은 12%에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다.
- 온도 60°C 미만과 부형제 함량 20% 미만에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다.
- 요인들의 개별적인 효과는 그림에서와 같이 온도 85°C 이상과 열처리 20시간 미만에서 가장 우수한 효소활성을 나타내었다.
- 05), xylan 분해해소는 열에 대한 안전성이 다른 효소들에 비하여 우수하였다. 자일란, 셀룰로오스, 전분 분해효소를 증가시키는 적정 부형제의 비율은 22.5, 12 그리고 33%로 나타났다. 비록 3가지 효소들의 제형화에 있어 공통적으로 적용될 수 있는 최적점을 도출하지는 못하였으나, 본 연구결과에서 얻어진 효소들의 반응 값들을 이용하여 목적하는 효소에 따라서 다양한 방법으로 적용이 가능할 것으로 판단된다.
- 전분 분해효소 활성에 대한 변수들의 효과에 대한 분산 분석에서 변수들의 효과 회귀모형, 선형효과, 곡률효과 및 상호관계 모두에서 95% 이상의 통계적 유의성이 나타났다(Table 6). 이에 보다 정확한 변수들의 효과를 조사하기 위하여, 총 45개의 실험들에서 얻어진 xylan 분해효소 활성값들을, 적용된 변수들의 수준들을 이용하여 반응표면모형을 근사화 하였고, 그 결과로 얻어진 회귀계수들과 그 확률값들은 Table 7에서 보는 것과 같다.
- 주효과 및 곡률효과 모두에서 가열시간만이 유의적인 효과를 나타내었다(p<0.05).
- 총 3가지 효소, xylan 분해효소, 셀룰로오스 분해효소 및 전분 분해효소를 검토하였고, 각 효소활성들에 대한 각 요인들의 효과가 매우 다양하게 나타났다 (p<0.05).
후속연구
- 본 실험의 결과들을 종합해보면 처리과정을 달리할 경우 도축 반추위 내용물을 폐기물로 처리하지 않고 가축사료 첨가용 효소제의 생산 기질로 재활용할 수 있는 잠재성이 있는 것으로 여겨진다. 반추위 내용물에 포함된 다양한 미지영양인자까지 고려하면 반추동물 사료효율 개선 및 생산성 향상, 그리고 사료비 절감을 통한 생산비의 절감에 기여하는, 특히 사료분해 효소가 풍부한, 사료첨가제로서 이용이 가능할 것으로 사료된다. 그러나 도축 반추위 내용물의 수거과정에서 발생하는 비용 또한 고려하여야 하며, 내용물에 존재하는 휘발성지방산의 영향으로 인한 가축의 섭취량 문제 또한 현장 적용 시에 고려되어야 할 사항이다.
- 5, 12 그리고 33%로 나타났다. 비록 3가지 효소들의 제형화에 있어 공통적으로 적용될 수 있는 최적점을 도출하지는 못하였으나, 본 연구결과에서 얻어진 효소들의 반응 값들을 이용하여 목적하는 효소에 따라서 다양한 방법으로 적용이 가능할 것으로 판단된다.
- 그러나 도축 반추위 내용물의 수거과정에서 발생하는 비용 또한 고려하여야 하며, 내용물에 존재하는 휘발성지방산의 영향으로 인한 가축의 섭취량 문제 또한 현장 적용 시에 고려되어야 할 사항이다. 향후 적절한 발효 또는 가공과정 및 제형과정을 거친 후사일리지, TMR 등 반추동물의 사료에 첨가하여 사양실험을 통한 유, 육 생산성에 미치는 효과를 분석하고, 개발된 기술의 효능을 검증하는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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