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문제 정의
- albicans의 폴리스 티렌 표면으로의 부착 억제효과, G0/G1 arrest에 의한 출아 및 바이오필름 증식의 억제효과, 병적인 효모의 형성 등과 관련된 복합적인 항진균 활성에 의해 기인한 것으로 보인다. 따라서 본 연구의 결과는 C. chinensis 추출물이 바이오필름과 관련된 캔디다의 감염을 치료하고 제거하기 위한 천연물 기반 항진균제 개발에 대한 가능성을 가짐을 시사한다.
- 황련(Coptidis chinensis)의 뿌리는 극동지방 에서 의료용 목적으로 널리 사용되어 왔다. 본 연구의 목적은 임상에서 분리한 C. albicans 바이오필름 형성 균주가 형성한 바이오필름에 대한 C. chinensis 수용성 추출물의 효과와 C. albicans 바이오필름 형성을 저해하는 데 기여하는 항진균활성을 평가하는 데 있다. 바이오필름에 대한 효과는 XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)] 환원 분석법을 사용하였으며, 조사된 모든 균주에 대한 대사활성은 98 μg/ml의 C.
제안 방법
- 50℃에서 1시간 반응시킨 후, DNA 염색을 위해 50 μg의 propidium iodide를 넣고 30분간 어두운 곳에 놓아둔 후 MuseTM Cell Analyzer로 분석하였다.
- C. albicans cells (2 × 104 CFU/ml) were incubated with shaking in the absence and presence of C. chinensis (98 μg/ml) at 37℃, and a colony count assay was used to determine the candidacidal activity of the C. chinensis extract against C. albicans.
- C. albicans의 폴리스티렌 표면 부착에 대한 C. chinensis의영향을 알아보기 위해 3시간 동안 형성된 C. albicans 바이오필름에 C. chinensis 수용성 추출물을 처리한 후의 바이오필름 제거효과를 각각 3시간과 24시간 후에 위상차 현미경을 통해 분석 하였다(Fig. 1). Fig.
- C. chinensis 수용성 추출물이 C. albicans 세포에 미치는 효과를 관찰하기 위해 3시간 동안 수용성 추출물에 노출된 C. albicans를 FUN-1과 Calcofluor white로 동시에 염색시켜 triple pass filter가 장착된 형광현미경을 통해 관찰하였다. Calcofluor white는 셀룰로오스와 키틴에 결합하는 염료로서 식물이나 진균류의 세포벽을 밝은 파란색의 형광으로 염색시킨다.
- C. chinensis 수용성 추출물이 C. albicans의 세포주기에 변화를 주는지 알아보기 위해 C. chinensis 수용성 추출물을 처리한후 각각 1시간과 3시간 후의 세포주기의 변화를 MuseTM Cell Analyzer로 분석하였다. 대조군은 시간이 지남에 따라 Go/G1과 S기에 있는 세포들의 상대적 비율이 감소하면서 G2기에 있는 세포들이 많아져 활발한 세포분열이 일어남을 나타냈다(Fig.
- 다음의 실험에서 10 C. albicans 임상분리 균주들이 3시간 동안 형성한 바이오필름에 대해 C. chinensis 수용성 추출물의 바이오필름 제거효과를 XTT 환원법을 이용한 대사활성도로 조사 하였다. 24시간 동안 C.
- 발아관(germ tube)은 균사형으로 형태변화가 일어날 때 처음 나타나는 원통형 구조이다. 다음의 실험에서 C. albicans의 발아관 형성에 대한 C. chinensis 수용성추출물의 효과를 분석하였다. 3시간 후 관찰된 C.
- 대수기의 C. albicans를 2 × 106 CFU/ml로 희석한 후 음성 대조군을 포함하여 MIC의 C. chinensis 수용성 추출물을 처리하여 37℃, 200 rpm에서 각각 3시간과 6시간 동안 진탕 배양하였다.
- , 2001)에 따라 측정하였다. 모든 실험은 4개씩 3회 분석하였다. 데이터는 3회 실험 중의 하나를 나타낸다.
- 본 연구는 C. chinensis의 수용성 추출물이 캔디다증 환자들로부터 분리된 바이오필름 형성 임상 Candida 균주에 대해 우수한 항바이오필름 능력을 나타내며, 이러한 능력이 C. albicans의세포막 기능억제, 살진균 활성 그리고 Go/G1에서 S로의 세포주 기의 진행억제와 관련된 복합적 효과와 관련이 있음을 XTT 환원분석법, fluorescein diacetate와 propidium iodide 이중 염색법, time-kill assay, 세포주기 분석을 통해 연구하였다.
- albicans가 바이오필름을 형성하게 하였다. 부유상태의 효모를 제거하고 YNB/Glucose로 헹군 후 음성 대조군을 포함하여 C. chinensis가 포함된 0.2 ml의 YNB/Glucose를 각 well에 넣어 초기단계 바이오필름에 대한 C. chinensis 추출물의 저해효과를 조사하였다. 습도가 유지되는 조건에서 24시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 바이오필름의 생존력을 XTT 환원분석법 (Ramage et al.
- albicans가 바이오필름을 형성하게 하였다. 부유상태의 효모를 조심스럽게 제거하고 YNB/Glucose로 헹군 후 음성 대조군을 포함하여 C. chinensis가 포함된 0.2 ml의 YNB/Glucose를 각 well 에 넣어 3시간과 24시간 후에 부유세포를 조심스럽게 제거한 후폴리스티렌 바닥에 부착된 C. albicans를 위상차 현미경(Olympus, Japan)을 통해 분석하였다.
- Working solution은 PBS에 2 μg의 fluorescein diacetate (Sigma)와 1 μg의 propidium iodide (Sigma)를 넣어 준비하였다 (Jones and Senft, 1985). 상온에서 3분간 염색한 후 triple pass filter가 장착된 형광현미경을 통해 관찰하였다.
- chinensis 수용성 추출물을 넣은 후 37℃에서 3시간(Mackenzie, 1962)과 18시간 동안 배양하였다. 위상차현미경을 통해 germ tube 형성에 대한 C. chinensis 수용성 추출 물의 효과를 관찰하였다.
- 정해진 시간마다 100 μl의 배양액을 새로운 튜브에 옮긴 후 20 초 이상 교반하여 출아 직후의 결합된 효모를 분리하였다.
- 제조사(Molecular Probes, USA)에서 제공하는 방법에 따라 FUN-1 (20 μM)과 Calcofluor white (25 μM)를 넣어 상온의 암소에서 30분간 염색한 후 triple pass filter가 장착된 형광현미경(Olympus, Japan)으로 관찰하였다.
대상 데이터
- krusei (KCCM 11426, ATCC 32196)는 한국미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양 받아 사용하였다. C. albicans (KCCM 50235)는 바이오필름 실험을 제외한 모든 실험에 사용되었으며, 캔디다증 환자로부터 분리된 10 C. albicans 균주는 바이오필름 실험에 사용되었다 (Park et al., 2009). 모든 균주는 -70℃에 보관하였고 필요시 YM agar 또는 YM 액체배지에서 계대배양 후 사용하였다.
- Candida albicans (KCCM 50235, ATCC 18804), C. glabrata(KCCM 50044, ATCC 2001), C. tropicalis (KCCM 50075, ATCC 750), C. krusei (KCCM 11426, ATCC 32196)는 한국미생물 보존 센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양 받아 사용하였다. C.
- 05. The experiments were performed three times with four replicates. * p≤0.
- 건조된 황련(C. chinensis)의 뿌리를 jchanbang.com에서 구매하였다. 30 g의 황련을 600 ml의 증류수에 넣어 1시간 동안 불린 후 2시간 동안 끓였다.
- MIC는 3회의 분석 중 최소한 2회 일치하거나 3회 중 가장 높은 값을 채택하였다. 양성 대조군으로amphotericin B (Sigma, USA)를 포함시켰다.
데이터처리
- The differences in the optical density (mean ± standard deviation) of individual biofilms incubated with C. chinensis extract and control values were calculated using Paired Student's t-test, and were considered statistically significant when p-value was ≤0.05.
- 모든 실험은 2 또는 3회 반복하였으며 통계분석은 t-test로, 두그룹간의 차이는 Paired t-test로 SigmaPlot 10.0을 이용하여 분석하였다. p값이 0.
이론/모형
- C. chinensis 수용성 추출물을 넣고 배양한 C. albicans의 시간대별 생존한 개체에 대한 colony count 분석법을 시행하였다. 9시간 동안 C.
- chinensis 추출물의 저해효과를 조사하였다. 습도가 유지되는 조건에서 24시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 바이오필름의 생존력을 XTT 환원분석법 (Ramage et al., 2001)에 따라 측정하였다. 모든 실험은 4개씩 3회 분석하였다.
- 캔디다혈증의 주요 원인균인 C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis에 대한 C. chinensis 수용성 추출물의 항진균 활성을 CLSI M27-A3 미량희석법에 의해 분석하였다(Table 1). C.
- 항진균 감수성 검사는 CLSI M27-A3 미량희석법(CLSI, 2008a)에 따라 수행하였으며 MIC는 성장이 현저히 감소되는 가장 낮은 농도로 결정하였다. MIC는 3회의 분석 중 최소한 2회 일치하거나 3회 중 가장 높은 값을 채택하였다.
성능/효과
- 24시간 동안 C. chinensis 추출물에 노출된 바이오필름은 MIC (98 μg/ml)에서 57.3 ± 14.7%, 2MIC에서 67.3 ± 0.7% 의 대사활성도가 감소되었고, Paired t-test로 분석한 대조군과의 차이는 대부분의 균주에서 95% 또는 99% 수준에서 유의성을 나타냈다(Table 2).
- chinensis 수용성추출물의 효과를 분석하였다. 3시간 후 관찰된 C. chinensis 수용성 추출물의 C. albicans 발아관 형성에 대한 효과는 거의 없었다(자료 미제시). 그러나 18시간 후 관찰된 C.
- 9시간 동안 C. chinensis에 노출된 C. albicans의 생존률은 3.07 ± 0.49%이었고, 22시간 후의 생존률은 2.80 ± 0.02%로 98 μg/ ml의 C. chinesis 수용성 추출물은 C. albicans에 대해 약 97%의 살진균 활성을 나타냈다(Fig. 2).
- albicans의 세포막을 손상시켰다. C. chinensis 수용성 추출물은 살진균 활성을 나타냈고, C. albicans 바이오필름의 폴리스티렌 표면으로의 부착을 억제하였 으며 C. albicans를 G0/G1 기에 머무르게 하여 바이오필름이나 출아법에 의한 증식을 억제시켰다. 본 연구의 결과는 C.
- albicans 의 세포막이 손상되어 세포가 죽은 것을 암시한다. C. chinensis 추출물을 6시간 처리한 실험군의 경우 C. albicans의 세포막 손상 등으로 인한 죽은 세포의 수가 증가하여 붉은 색의 형광을 나타내는 세포의 수는 급격히 감소하였으며 세포파열 등에 의한 cell debris가 많이 관찰되었다(자료 미제시). Amphotericin B는세포막의 주성분인 ergosterol에 소수성 상호작용으로 결합한 후세포막의 구조적 재배열을 유도해 막채널 또는 구멍을 형성한다.
- 3A에 보여지는 바와 같이 대조군의 현미경적 이미지는 정상적인 출아 형태를 나타내고 있으며 붉은 색의 세포내 CIVS를 보여줌으로써 이들 세포가 대사적으로 활발한 살아있는 세포임을 시사한다. C. chinensis 추출물을 처리한 실험군(Fig. 3B)은 담황색의 세포질을 나타내는 세포가 많았고 붉은 색의 CIVS를 함유하는 세포는 상대적으로 적게 발견되었다. 이 실험의 결과로 3시간의 C.
- 1). Fig. 1B에 보여지는 바와 같이 3시간의 C. chinensis 처리만으로도 바이오필름이 상당히 제거된 것을 관찰할 수 있었고, 24시간 동안 C. chinensis에 노출된 바이오필름의 경우 부착된 세포들의 상대적 비율이 훨씬 낮은 것을 확인할 수있었다(Fig. 1D). 세포가 부착된 모습도 대조군의 세포들은 건강한 세포들로서 바닥에 잘 부착되어 크고 어둡게 관찰되었지만 C.
- 7%)되어 유의성 있는 항바이오필름 활성을 나타내었다. Fluorescein diacetate와 propidium iodide로 이중 염색한 결과 C. chinensis 추출물은 C. albicans의 세포막을 손상시켰다. C.
- albicans 발아관 형성에 대한 효과는 거의 없었다(자료 미제시). 그러나 18시간 후 관찰된 C. abicans의 형태는 상당한 형태적 차이를 나타냈다(Fig. 6). 통통하고 건강한 모습을 나타내는 대조군에 비해 C.
- 5A). 그러나 C. chinensis 수용성 추출물을 처리한 실험군에서는 1시간 후 대조군에 비해 오히려 Go/G1의 비율이 다소 감소하고 S기세포들의 비율이 증가하여 C. chinensis 수용성 추출물이 다소 세포분열을 촉진하는 효과를 보여주었으나, 3시간 후에는 1시간 후와 비슷한 패턴이 그대로 유지되면서 C. chinensis 수용성 추출물이 캔디다 세포들을 G0/G1에서 머무르게 하여(G0/G1 arrest), S기로의 세포주기 진행을 억제함을 알 수 있었다(Fig. 5B). Berberine은 전립선암세포(Mantena et al.
- 바이오필름에 대한 효과는 XTT [2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)] 환원 분석법을 사용하였으며, 조사된 모든 균주에 대한 대사활성은 98 μg/ml의 C. chinensis 수용성 추출물에 의해 현저하게 감소(57.3 ± 14.7%)되어 유의성 있는 항바이오필름 활성을 나타내었다.
- albicans를 G0/G1 기에 머무르게 하여 바이오필름이나 출아법에 의한 증식을 억제시켰다. 본 연구의 결과는 C. chinensis 추출물이 목표가 되는 C. albicans에 복합적으로 유해한 효과를 내어 궁극적으로는 C. albicans 바이오필름 형성을 억제함을 나타낸다. 따라서 C.
- 1D). 세포가 부착된 모습도 대조군의 세포들은 건강한 세포들로서 바닥에 잘 부착되어 크고 어둡게 관찰되었지만 C. chinensis 추출물에 노출된 세포들은 부착상태가 좋지 않아 약간 밝고 작게 관찰이 되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 Fig.
- 위의 결과들을 종합해보면, C. chinensis 수용성 추출물이 C. albicans 세포의 바이오필름 형성을 저해하는 것은 C. albicans의 세포막 손상유발로 인한 살진균 활성, C. albicans의 폴리스 티렌 표면으로의 부착 억제효과, G0/G1 arrest에 의한 출아 및 바이오필름 증식의 억제효과, 병적인 효모의 형성 등과 관련된 복합적인 항진균 활성에 의해 기인한 것으로 보인다. 따라서 본 연구의 결과는 C.
- 6B). 이 실험에서 C. albicans가 발아 관을 형성하는 데 대한 C. chinensis 추출물의 억제효과는 거의 없었지만 C. chinensis 추출물의 존재하에서 형성된 균사가 대부분 병적인 형태를 띠며 죽어있는 세포들이 많은 것으로 보아 세포막 기능의 손상이나 다른 필수적 기능의 저해에 의해 정상적인 삶의 유지를 어렵게 하는 것으로 생각된다.
- 3B)은 담황색의 세포질을 나타내는 세포가 많았고 붉은 색의 CIVS를 함유하는 세포는 상대적으로 적게 발견되었다. 이 실험의 결과로 3시간의 C. chinensis 노출에 의해 많은 C. albicans가 죽어감을 확인할 수있다.
- 인 C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis에 대한 23가지 약초의 MIC값이 0.1–0.5 mg/ml (Rukayadi et al., 2008)이고, 8가지 식물추출물의 C. albicans와 Aspergillus niger에 대한 MIC가 0.5–0.9 mg/ml (Mathur et al., 2011)인 것과 비교한다면, C. chinensis 수용성 추출물의 항진균 활성은 비교적 우수한 것으로 판단된다.
- 캔디다증 환자에서 분리한 10 C. albicans 균주에 대한 C. chinensis 수용성 추출물의 MIC값 또한 표준 C. albicans로 사용된 C. albicans ATCC18804 와 모두 동일한 98 μg/ml을 나타냈다(Table 1).
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