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문제 정의
- 단삼 에탄올추출물의 바이오필름에 대한 영향을 분석하기 위해 본 연구에서는 qRT-PCR의 방법을 사용하여 바이오필름 또는 균사에 특이적인 유전자발현의 변화를 분석하였다. 바이오필름 발달에서 표면부착은 필수적인 단계이므로 Candida Genome Database (CGD, http://www.
- albicans의 세포막 기능과 세포벽 integrity에 영향을 끼침을 밝혔다[12]. 본 연구에서는 단삼 에탄올추출물이 캔디다증 환자로부터 분리한 10개의 C. albicans 임상균주가 형성하는 바이오필름에 미치는 영향을 관찰하고, 유전자 서열이 알려진 C. albicans SC5314를 이용하여 바이오필름에 특이적인 유전자의 발현에 미치는 영향을 분석하고자 하였다. CLSI M27-A3의 기준에 따라 MIC 를 분석해보니, C.
- albicans의 막투과성을 변화시켜 세포막의 기능을 교란시키고 세포벽의 성분 중 (1,3)-β-D-glucan polymer의 형성에 관여하는 (1,3)-β-D-glucan synthase의 활성을 억제하여 세포벽의 기능을 약화시킴을 밝혔다[12]. 본 연구에서는 단삼의 에탄올추출물이 캔디다증 환자에서 분리한 10개 C. albicans 균주의 바이오필름 발달에 미치는 영향과 C. albicans SC5314의 바이오필름에 특이적인 유전자 EAP1, HWP1, ALS1, ALS3, ECE1의 발현에 미치는 효과를 연구하였다.
- 여기에 단삼 에탄올추출물(0, 39 μg/ml and 78 μg/ml)이 들어 있는 YNB/glucose (0.2 ml)를 넣고 37℃에서 16시간 동안 추가로 배양하여 단삼이 바이오필름 성장에 미치는 영향을 보고자 하였다.
제안 방법
- 10개 C. albicans 임상균주가 형성한 바이오필름의 양은 XTT (Sigma) 환원분석법으로 측정하였고[16], 바이오필름은 3시간 동안 형성된 초기 단계의 바이오필름(early stage of preformed biofilms)을 대상으로 실험을 진행하였다[17]. YNB/glucose (yeast nitrogen base with 50 mM glucose) 배지를 사용하여 각 C.
- C. albicans SC5314 배양액을 YNB/glucose 액체배지를 사용하여 5 × 10 6 cells/ml로 희석한 cell suspension을 flatbottom 96-well polystyrene plate에 넣고, 최종 농도 0, 39 μg/ml 또는 78 μg/ml의 단삼 에탄올추출물을 첨가한 후 37℃에서 3시간 배양하여 캔디다 바이오필름이 발달하도록 하였다.
- albicans는 두꺼운 바이오필름 구조를 형성하기 보다는 adhesion을 선호한다[19]. C. albicans SC5314 세포를 단삼 에탄올추출물이 포함된 YNB/glucose 배지에 3시간 노출시킨 후, 폴리스티렌 표면에 부착된 세포를 위상차 현미경으로 관찰하였다. 대조군에 비해 39 μg/ml (Figs.
- org/)의 정보에 기초하여 효모의 표면부착과 바이오필름 형성에서 중요한 역할을 하는 유전자인 EAP1, HWP1, ALS1, ALS3, ECE1의 발현량 변화를 분석하였다. housekeeping gene인 actin 유전자 ACT1의 발현량으로 normalization을 하여 단삼처리 실험군의 유전자 발현을 비교하였다(Fig. 3).
- 각 well에 최종 농도 0, 39 μg/μl 또는 195 μg/ml 단삼 에탄올추출물을 넣은 후 3시간 동안 37℃에서 배양하여, C. albicans가 germ tube를 형성하는 데 단삼 에탄올추출물이 어떤 영향을 미치는지 inverted microscope을 이용하여 200배로 관찰하였다.
- 그 후 바이오필름에 0 또는 39 μg/ml 단삼 에탄올추출 물을 처리하여 37℃에서 90분간 배양하였다. 다음으로 각 바이오필름에서 total RNA를 분리한 후 cDNA를 합성하였고, 바이오필름과 관련된 EAP1, HWP1, ALS1, ALS3, ECE1 유전자에 대한 forward and reverse primers를 넣어 DNA를증폭시켰다. 각 유전자의 fold regulation은 ACT1 Ct를 기준으로 comparative Ct method를 사용하여 계산하였고, DMSO를 처리한 solvent control을 Ct 값을 결정하는 reference 값으로 데이터를 분석하였다.
- albicans의 생물학적 또는 비활성 표면으로의 부착은 바이오필름 형성에서 필수적인 단계이다. 단삼 에탄올추출 물이 C. albicans의 폴리스티렌 표면부착 단계에 대한 영향을 adhesion assay로 분석하였다. C.
- albicans가 바이오필름을 형성하기 위해서는 표면부착 후 germ tube라는 짧은 관을 출아포자에 내어 가균사를 형성하는데, germ tube의 형성은 균사로 진입하기 위한 필수적인 과정이다. 단삼 에탄올추출물이 germ tube 형성을 얼마나 효과적으로 억제하는지 알아보기 위해 C. albicans SC5314 세포를 germ tube 형성을 유도하는 FBS와 RPMI 1640 배지에 노출시켜 37℃에서 배양하였다. 1x MIC 에 해당하는 39 μg/ml 단삼 추출물을 넣은 경우 germ tube 형성은 억제되지 않았다(Fig.
- 따라서 다음에 이어지는 모든 실험에서는 C. albicans SC5314를 이용하여 단삼 에탄올추출물에 대한 MIC인 39 μg/ml 또는 이의 배수 농도로 처리하여 단삼 에탄올추출물의 효과에 대한 결과를 분석하였다.
- 바닥에 부착되지 않은 부유세포와 배지를 제거하고 PBS로 헹군 후 40 μl PBS를 넣어 inverted microscope로 관찰하였다.
- 단삼 에탄올추출물의 바이오필름에 대한 영향을 분석하기 위해 본 연구에서는 qRT-PCR의 방법을 사용하여 바이오필름 또는 균사에 특이적인 유전자발현의 변화를 분석하였다. 바이오필름 발달에서 표면부착은 필수적인 단계이므로 Candida Genome Database (CGD, http://www.candidagenome.org/)의 정보에 기초하여 효모의 표면부착과 바이오필름 형성에서 중요한 역할을 하는 유전자인 EAP1, HWP1, ALS1, ALS3, ECE1의 발현량 변화를 분석하였다. housekeeping gene인 actin 유전자 ACT1의 발현량으로 normalization을 하여 단삼처리 실험군의 유전자 발현을 비교하였다(Fig.
- albicans 집단의 주변을 완벽하게 감싸는 바이오필름을 형성한다[7]. 본 연구에 사용된 단삼 에탄올추출물은 초기 단계의 바이오필름 억제에 대한 효과가 좋았기 때문에 10개의 C. albicans 임상균주가 형성한 초기 단계의 바이오필 름을 이용하여 단삼 추출물이 바이오필름 발달에 미치는 영향을 정량하였다. 바이오필름의 정량은 XTT 환원분석법에 의하며, 이는 살아있는 세포의 미토콘드리아 효소가 tetrazolium salt XTT를 환원시켜 생성한 formazan derivatives의 양을 흡광도(A 492 )로 측정하는 방법으로서, 바이오필름의 대사 활성(metabolic activity)양을 바이오필름의 양으로 간주하였다[18].
- 2 ml)를 넣고 37℃에서 16시간 동안 추가로 배양하여 단삼이 바이오필름 성장에 미치는 영향을 보고자 하였다. 부유 세포를 제거하고 PBS로 헹군 후 발달된 바이오필름의 양을 XTT 환원분석법을 시행하여 정량하였다. 실험은 각 샘플당 5배수로 진행하였고 각 실험당 단삼 에탄올추출물을 넣지 않은 대조군을 100으로 하여 바이오필름 활성의 억제율을 % 로 표현하였다.
- 부유 세포를 제거하고 PBS로 헹군 후 발달된 바이오필름의 양을 XTT 환원분석법을 시행하여 정량하였다. 실험은 각 샘플당 5배수로 진행하였고 각 실험당 단삼 에탄올추출물을 넣지 않은 대조군을 100으로 하여 바이오필름 활성의 억제율을 % 로 표현하였다.
- 폴리스티렌 표면에 부착된 C. albicans의 입체 적인 형태를 관찰하기 위해 5 μl의 0.05% Calcofluor-White 용액(Sigma)을 추가적으로 well에 넣은 후 inverted epifluorescence microscope를 이용하여 자외선하에서 400배로 관찰하였다.
- 항진균 감수성 검사는 기본적으로 CLSI M27-A3 미량희석법[14]에 따라 배지의 혼탁도를 기준으로 MIC를 결정하였고, 동시에 배지에 살아있는 세포 활동의 지표인 resazurin (Sigma)을 포함시켜 24시간 후 resazurin의 청색이 붉은 색으로 변하지 않는 최저농도를 MIC로 판단하여 데이터의 결과를 이중으로 검증하였다[15].
대상 데이터
- albicans 균주는 캔디다증 환자로부터 분리한 것을 연세대학교 원주의과대학에서 기증받았다[13]. C. albicans SC5314 (ATCC MYA-2876TM ) 는 미국 American Type Culture Collection에서 구입하였다. C.
- 바이오필름 연구에 사용된 10개 C. albicans 균주는 캔디다증 환자로부터 분리한 것을 연세대학교 원주의과대학에서 기증받았다[13]. C.
데이터처리
- 각 유전자 발현에 대한 표준편차(standard deviation, SD)와 그룹간의 차이는 Sigma plot 13.0의 Student's t-test를 사용하였고, 결과는 p < 0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
이론/모형
- miltiorrhiza against Candida spp. were determined by the modified CLSI M27-A3 protocol of the colorimetric broth microdilution method using resazurin [14, 15].
- 다음으로 각 바이오필름에서 total RNA를 분리한 후 cDNA를 합성하였고, 바이오필름과 관련된 EAP1, HWP1, ALS1, ALS3, ECE1 유전자에 대한 forward and reverse primers를 넣어 DNA를증폭시켰다. 각 유전자의 fold regulation은 ACT1 Ct를 기준으로 comparative Ct method를 사용하여 계산하였고, DMSO를 처리한 solvent control을 Ct 값을 결정하는 reference 값으로 데이터를 분석하였다. 각 유전자 발현에 대한 표준편차(standard deviation, SD)와 그룹간의 차이는 Sigma plot 13.
- 단삼이 바이오필름 형성에 관여하는 유전자들의 mRNA 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해 qPCR 분석을 하였고, Lee and Kim의 논문에 기술한 것과 동일한 PCR primer와방법을 사용하였다[17]. 간단하게 기술하면, 6 well plate에서 RPMI 1640 배지내의 C.
성능/효과
- C. albicans 세포들이 폴리스티렌 표면에 부착하거나 germ tube를 형성하는 과정에서의 단삼 에탄올추출물의 영향을 현미경으로 분석하니, 39 μg/ml 단삼 에탄올추출물에 의해 부착된 세포의 밀도는 현저하게 감소하였으나 germ tube 형성은 거의 억제하지 못했다.
- CLSI M27-A3의 기준에 따라 MIC 를 분석해보니, C. albicans SC5314에 대한 단삼 에탄올추출물의 MIC는 39 μg/ml, 10개 C. albicans 임상균주에 대한 MIC는 19.5 μg/ml에서 39 μg/ml의 범위로 이들 모두 단삼 추출물에 대해 비슷한 감수성을 나타냈다(Table 1).
- 006) 억제하였다. 결론적으로 단삼의 에탄올추출물은 초기단계의 C. albicans 바이오필름 발달을 효율적으로 저해하며, 이는 EAP1, ALS1, ALS3 유전자의 발현억제에 따른 세포부착 억제와 관련이 있다. 더불어 단삼 에탄올추출물의 C.
- 그러나 78 μg/ml 단삼 에탄올추출물에 노출된 10개 C. albicans 임상균주의 바이오필름은 평균 51.3%의 대사율의 감소를 나타냈고 모두 통계적으로 유의하여, 단삼 에탄올추출물이 초기 단계의 바이오필름의 양을 줄이는 데 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
- Als1 (agglutininlike sequence 1)과 Als3 (agglutinin-like sequence 3) 단백질은 균사발달을 시작하게 하고 바이오필름의 표면 부착과 세포벽의 integrity 유지에 관여한다[23]. 단삼 에탄올추출물을 처리한 바이오필름에서 ALS1과 ALS3 유전자의 mRNA 양은 각각 0.55배와 0.519배로 감소하였다(Fig. 3). 이 결과는 Fig.
- 단삼 에탄올추출물이 C. albicans SC5314 세포의 균사에 특이적인 유전자 발현에 미치는 영향을 qPCR로 분석한 결과, EAP1은 34.7% (p < 0.001), ALS1은 45.0% (p < 0.001), ALS3는 48.1% (p < 0.001), ECE1은 21.3% (p = 0.006) 억제하였다.
- albicans는 동물모델에서 점막감염을 유발하지 않는 것으로 관찰되었다[25]. 단삼은 C. albicans 바이오필름의 ECE1의발현양을 0.787배로 낮추었는데(p = 0.006) (Fig. 3), 이 결과는 단삼이 C. albicans 초기 단계 바이오필름에서의 신장을 억제하며 숙주 감염시 독성을 낮추는 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
- 단삼의 양을 증가시켜 5x MIC에 해당하는 195 μg/ml 단삼 추출물을 처리했을 때 germ tube 형성이 억제되어 효모형만이 관찰되었으며 반복된 실험에서도 고용량의 단삼 에탄올추출물의 존재하에서만 germ tube 형성에 대한 억제효과가 있었다.
- 대조군에 비해 39 μg/ml (Figs. 1B and 1E) 또는 78 μg/ml (Figs. 1C and 1F)의 단삼 에탄올추출물을 처리한 실험군에서는 바닥에 부착된 C. albicans 세포의 양이 현저하게 감소하였다.
- albicans 균주들의 amphotericin B에 대한 감수성 또한 비슷하였다. 더불어 이들 균주는 모두 단삼 에탄올추출물보다 amphotericin B에대해 39배 또는 78배 더 민감하였다(Table 1). 따라서 다음에 이어지는 모든 실험에서는 C.
- albicans의 표면 부착을 저해한다. 둘째, EAP1 발현을 억제하여 세포와 세포간 또는 세포와 표면 부착을 억제한다. 이 밖에도 세포막 지질성분 변화로 인한 삼투변화와 (1,3)-D-glucan synthase 활성 감소로 인한 부실한 세포벽 구조 또한 세포부착능 감소에 기여할 것으로 추정된다.
- 본 연구에서는 10개 C. albicans 임상균주가 형성한 초기단계의 바이오필름을 대상으로 XTT 환원분석법으로 대사활성을 측정하니, 78 μg/ml 단삼 에탄올추출물에 의해 바이오필름의 대사활성이 평균 51.3% 감소되었다.
후속연구
- albicans 바이오필름 발달을 효율적으로 저해하며, 이는 EAP1, ALS1, ALS3 유전자의 발현억제에 따른 세포부착 억제와 관련이 있다. 더불어 단삼 에탄올추출물의 C. albicans 세포막 기능저해와 세포벽 합성억제에 의한 구조변화 또한 세포부착단계에서의 바이오필름 발달억제에 기여할 것으로 추정된다.
- 둘째, EAP1 발현을 억제하여 세포와 세포간 또는 세포와 표면 부착을 억제한다. 이 밖에도 세포막 지질성분 변화로 인한 삼투변화와 (1,3)-D-glucan synthase 활성 감소로 인한 부실한 세포벽 구조 또한 세포부착능 감소에 기여할 것으로 추정된다.
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