[논문]갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에서 분리한 광염성 해양 미생물 Bacillus sp. EBW4의 특성 및 유기물 분해능 분석

신세연; 이상석; 이동헌; 강경호; 강형일

doi:10.7845/kjm.2013.005

갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에서 분리한 광염성 해양 미생물 Bacillus sp. EBW4의 특성 및 유기물 분해능 분석
Characterization and Organic Hydrocarbons Degradation Potential of Euryhaline Marine Microorganism, Bacillus sp. EBW4 Isolated from Polychaete (Perinereis aibuhitensis) 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.49 no.1, 2013년, pp.38 - 45

신세연 (순천대학교 환경교육과) , (순천대학교 환경교육과) , 이상석 (순천대학교 동물자원학과) , 이동헌 (제주대학교 기초과학연구소) , 강경호 (전남대학교 수산양식학부) , 강형일 (순천대학교 환경교육과)

초록
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본 연구에서는 연안갯벌 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에서 분리한 광염성 미생물, Bacillus sp. EBW4의 특성과 다양한 환경조건에서 유기물 분해능을 분석하였다. 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 균주 EBW4는 Bacillus hemicentroti $JSM076093^T$와 98.3%, Bacillus hwajinponensis SW-$72^T$와 97.96% 그리고 Bacillus algicoa $KMM3737^T$와 96.28%의 상동성을 보였다. EBW4의 생장 가능한 온도 범위는 $4-40^{\circ}C$, 염분도 범위는 0-17%, pH 범위는 5-9로 나타나 EBW4는 광염성 균주로 밝혀졌다. EBW4의 세포막을 구성하는 주요 지방산으로는 anteiso $C_{15:0}$, iso $C_{16:0}$, anteiso $C_{17:0}$, iso $C_{14:0}$ 등으로 각각 48.2, 12.1, 11.6, 9.4% 비율로 나타났다. EBW4는 탄수화물, 단백질, 지방 등 다양한 고분자 유기물을 분해할 수 있는 DNase, amylase, protease, lipase 등의 효소 활성뿐만 아니라, alkaline phosphatase, esterase (C4), leucine arylamidase 그리고 ${\alpha}$-chymotrypsin 효소활성도 가지고 있었다. 다양한 염분 농도 조건에서 합성폐수를 이용한 실험에서 EBW4은 조사한 모든 범위의 염분 조건에서도 유기물 분해능이 우수하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, euryhaline marine microorganism, Bacillus sp. strain EBW4 isolated from polychaete (Perinereis aibuhitensis) of Suncheon Bay was physiologically, biochemically and genetically characterized. Based on 16S rRNA sequence, EBW14 was found to share 98.25% similarity with Bacillus hemicentroti $JSM076093^T$, 97.96% similarity with Bacillus hwajinponensis SW-$72^T$ and 96.28% similarity with B. algicoa $KMM3737^T$, respectively. The temperature range for the growth of strain EBW4 was $4-40^{\circ}C$, NaCl concentration range 0-17% and pH range pH 5-9, revealing that EBW4 was euryhaline bacterium. Major fatty acids in strain EBW4 were composed of anteiso $C_{15:0}$ (48.2%), iso $C_{16:0}$ (12.1%), anteiso $C_{17:0}$ (11.6%) and iso $C_{14:0}$ (9.4%). EBW4 was found to have DNase, amylase, protease and lipase for the degradation of macromolecules such as DNA, carbohydrates, proteins, lipids, etc. The enzyme activities of alkaline phosphatase, esterase (C4), leucine arylamidase and ${\alpha}$-chymotrypsin were also found in strain EBW4. Analysis of the biodegradation ability of EBW4 for organic hydrocarbons under different salinity conditions using synthetic water waste revealed that EBW4 exhibited the ability to degrade organic hydrocarbons very quickly, suggesting strain EBW4 may be a good candidate for the application to various industries.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Bacillus는 다양한 고분자 물질 분해능이 있는 것으로 알려져 있어, DNA, 셀룰로오스, 녹말, 카세인 그리고 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80이 포함된 MA 고체 배지에 본 연구에서 분리한 균주 EBW4를 접종한 후, 이들 고분자 물질 분해에 관련된 효소, DNase, cellulase, amylase, protease 그리고 lipase 활성이 있는지에 대해 조사하였다. 균주의 핵산 분해능은 DNA 물질이 포함된 배지에 접종 후 30℃에서 3일 배양 후 1 M HCl을 떨어뜨렸을 때 균체 주변에 생성되는 투명환으로, cellulose 분해능은 congo red로 30분간 염색 후 1 M NaCl을 이용하여 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로, 녹말 분해는 iodine으로 30분 염색 후 1 M NaCl로 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로 판단하였다.
본 연구에서는 배지별 생장여부와 온도, pH, 염도 등 세 가지 환경 조건을 달리하여 균주의 생장 여부를 조사하였다. 배지별 균 생장능은 Marine Ager (MA), Luria-Bertani (LB), Tryptic Soy Agar (TSA), Nutrient Agar (NA), R2A 배지에서 30℃에 배양하여 조사하였으며, 모두 Difco 제품을 사용하였다.

제안 방법

본 연구에서는 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에서 분리된 광염성 세균, Bacillus sp. EBW4균의 특성 및 다양한 유기물 분해능을 분석하였다.
Bacillus sp. EBW4를 30℃, 호기성 및 혐기성 조건에서 5개의 다른 배지를 이용하여 생장능을 시험하였다. 균주 EBW4는 MA와 R2A배지에서 호기성 조건에서 생장하였으나 혐기성 조건에서도 미약하게 생장하는 것으로 나타났다(Table 1).
본 연구에서는 연안갯벌 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에서 분리한 광염성 미생물, Bacillus sp. EBW4의 특성과 다양한 환경조건에서 유기물 분해능을 분석하였다. 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 균주 EBW4는 Bacillus hemicentroti JSM076093T 와 98.
세균의 16S rDNA를 증폭하기 위해 균주들을 액체 배지에서 30℃에서 2–3일 동안 배양한 후 이로부터 추출된 genomic DNA와 27F와 1522R로 이루어진 한 세트의 프라이머를 사용하여 이미 알려진 방법에 따라 PCR을 수행하였다(Lane, 1991). PCR 반 응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, CT)를 사용하여 수행하였고, 반응 조건은 95℃에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30번 반복하여 마지막에는 72℃에서 10분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. 증폭된 DNA는 1.
또한 고체배지에서의 효소 활성 시험과 함께 EBW4 균주의 일반 유기물 분해능을 시험하기 위하여, 이미 알려진 방법 (Kapdan and Erten, 2007)을 변형하여 BM buffer에 glucose와 peptone이 4:1 비율로 혼합된 10,000 mg/L의 고농도 합성 폐수를 제조하고 최종 NaCl 농도가 0, 3, 10, 15%가 되게 한 후, 30℃, pH 7 조건에서 120시간 EBW4를 배양하면서 유기물 분해능을 TOC양으로 조사하였다. TOC의 잔존량을 측정하기 위하여 합성 폐수가 포함된 1 LBM 배지에 균주 EBW4를 접종하여 배양하면서 매 24시간 마다 50 ml 시료를 채취한 후 일부는 OD (600 nm) 값을 측정하는데 사용하였고, 나머지는 10,000 rpm에서 10 분간 원심 분리한 후, 상징액 만을 취해 멸균된 50 ml conical tube에 옮겨 -70℃에서 TOC를 측정할 때까지 보관하였다. TOC 측정은 Phoenix 8000 TOC Analyzer (Teledyne Technologies Co.
Total DNA의 정제를 위해 crude DNA를 10 ml cesium chloride (CsCl) 용액에서 녹인 후 ethidium bromide (EtBr)를 첨가하여 구경의 직경이 0.2 μm 막 여과지를 이용하여 30분간 투석하여 DNA 용액을 회수하여 농축한 후 특정 유전자의 증폭 또는 클로닝을 위한 시료로 사용하였다.
갯지렁이 추출물을 접종한 MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)을 선별하여 순수 배양한 후 얻어진 여러 균주 중 광염성 신 균주이면서 고분자 유기물 분해능이 우수한 EBW4를 선별한 후 16S rRNA 염기서열 1,375-bp를 기초로 선별 균주들 간의 계통관계를 분석하였다(Fig. 1). EBW4는 같은 종으로 B.
균이 탄수화물을 산화하는지 발효하는지 알아보고자 OF medium (Hugh and Leifson's, 1953)을 만든 후 2개의 배지에 같은 균을 멸균된 백금선을 사용하여 수직으로 중앙에 2 cm 깊이까지 접종하고 하나의 배지는 paraffin을 이용해 즉시 차폐시켜 배양한 후 관찰하였다.
염도별 균 생장능은 배지 제조 시 NaCl가 전혀 포함되지 않은 MA 배지 조성 성분 외에 NaCl 농도를 0–12%로 조정하여 균주를 배양하여 확인하였다. 균주의 생장 여부는 균주 접종 후 각 균주의 적정 생장 온 도에서 5일간 배양하면서 생장여부를 확인하였다.
균주의 운동성은 0.4%의 agar를 포함시킨 semisolid 배지에서 확인하였고, 산소 대사와 관계된 oxidase는 Oxidase Reagent Kit (bioMérieux)를 이용하여 콜로니 색의 변화로 분석하였다.
먼저 5–7일 동안 배양하면서 형성되는 단일 콜로니의 형태, 색깔, 크기를 관찰하였다. 균주의 형태와 크기는 그람 염색을 실시한 후 그람 양성인지 음성인지 판별하고 광학현미경을 통해 크기와 형태를 관찰하였다. 그람 염색은 Hucker의 방법 (1923)을 따라 수행하였다.
기타 분리 균주의 생리 생화학적 특성은 여러 API kit (bioMérieux, USA)를 사용하였으며, API 20E, API 20NE, API 50CHB 그리고 API ZYM kit를 동시에 이용하여 균주의 특성을 조사하였다.
카세인과 Tween은 각각 2일, 3일 배양하여 별다른 염색과정을 거치지 않고 육안으로 관찰된 투명환으로 분해능을 확인하였다. 또한 고체배지에서의 효소 활성 시험과 함께 EBW4 균주의 일반 유기물 분해능을 시험하기 위하여, 이미 알려진 방법 (Kapdan and Erten, 2007)을 변형하여 BM buffer에 glucose와 peptone이 4:1 비율로 혼합된 10,000 mg/L의 고농도 합성 폐수를 제조하고 최종 NaCl 농도가 0, 3, 10, 15%가 되게 한 후, 30℃, pH 7 조건에서 120시간 EBW4를 배양하면서 유기물 분해능을 TOC양으로 조사하였다. TOC의 잔존량을 측정하기 위하여 합성 폐수가 포함된 1 LBM 배지에 균주 EBW4를 접종하여 배양하면서 매 24시간 마다 50 ml 시료를 채취한 후 일부는 OD (600 nm) 값을 측정하는데 사용하였고, 나머지는 10,000 rpm에서 10 분간 원심 분리한 후, 상징액 만을 취해 멸균된 50 ml conical tube에 옮겨 -70℃에서 TOC를 측정할 때까지 보관하였다.
주요 조사 항목으로는 nitrate 환원반응, esterase (C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-Bi-phosphohydrolase, glucose acidification, gelatin 액화, arginine dihydrolase, urease, β-glucosidase, β-galactosidase, alkalin phosphatase, lipase (C14) 등이 효소활성 유무, indole 생성 여부 등을 들 수 있다. 또한 탄소원 mannitol, gluconate, malate, citrate, glucose, arabinose, mammose, N-acetyl-glucosamine, maltose, caprate, adipate, phenyl-acetate 등의 동화 여부 등에 대하여 조사하였다.
먼저 5–7일 동안 배양하면서 형성되는 단일 콜로니의 형태, 색깔, 크기를 관찰하였다.
온도별 균 생장능은 MA 고체 배지에 접종 후 4–42℃ 범위에서 배양하여 조사하였다. 배양의 최적 pH는 액체상의 Marine Broth (MB) (Difco) 배지 제조 시 10 N NaOH와 6 N HCl을 이용하여 pH 3-11까지 pH 1씩 차이를 두고 9개 tube에 각각 접종 72시간 배양하여 하루에 한 번씩 자람의 유무를 체크하였다. 염도별 균 생장능은 배지 제조 시 NaCl가 전혀 포함되지 않은 MA 배지 조성 성분 외에 NaCl 농도를 0–12%로 조정하여 균주를 배양하여 확인하였다.
세포막의 지방산 분석

분리 균주에 대한 세포지방산 분석은 MIDI를 이용하여 수행하였다. 이를 위하여 분리 균주를 MA 배지에서 25℃에서 72시간 동안 배양하였다.
이를 위하여 분리 균주를 MA 배지에서 25℃에서 72시간 동안 배양하였다. 분석기기는 미생물 동정 시스템(Microbial Identification System MIDI, Microbial ID. Inc., USA)을 사용하였으며, 분석된 데이터는 TSBA40 (Sherlock Version 4.0; Microbial Identification System MIDI, Microbial ID. Inc.)에서 검색하였다. 배양제 40 mg을 루프로 캡 튜브에 취한 후 메탄올과 증류수를 1:1로 혼합한 용액에 15% 수산화나트륨이 포함된 시약 1 ml을 가하여 100℃에서 25분간 반응시켜 세포 내 지방산을 추출하였다.
염도별 균 생장능은 배지 제조 시 NaCl가 전혀 포함되지 않은 MA 배지 조성 성분 외에 NaCl 농도를 0–12%로 조정하여 균주를 배양하여 확인하였다.
온도별 균 생장능은 MA 고체 배지에 접종 후 4–42℃ 범위에서 배양하여 조사하였다.
5 ml TES buffer와 10 ml의 phenol을 첨가하여 잘 섞어주었다. 원심분리를 통하여 얻어진 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 동량의 phenol/choroform/isoamyl alcohol로 2회, chlorofrom으로 1회 처리하였다. 상징액을 취하여 새로운 tube 로 옮긴 후 1/10 volume의 3 M sodium acetate (pH 5.
이 때 균주는 LBSS 고체배지를 이용하여 25℃에서 2–3일간 배양 하였으며, 성장된 균체는 멸균된 3% sea salt 용액에 현탁하여 제조회사의 지시에 따라 수행하였다.
이어서 갯지렁이를 제거한 후 12,000 rpm으로 원심분리하여 침전물을 모은 후 2 ml의 BM buffer를 첨가하여 잘 섞은 후, 100 μl씩 Marine Agar (MA) (BD Difco, USA) 배지에 접종하여 미생물을 배양하였다.
균주의 핵산 분해능은 DNA 물질이 포함된 배지에 접종 후 30℃에서 3일 배양 후 1 M HCl을 떨어뜨렸을 때 균체 주변에 생성되는 투명환으로, cellulose 분해능은 congo red로 30분간 염색 후 1 M NaCl을 이용하여 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로, 녹말 분해는 iodine으로 30분 염색 후 1 M NaCl로 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로 판단하였다. 카세인과 Tween은 각각 2일, 3일 배양하여 별다른 염색과정을 거치지 않고 육안으로 관찰된 투명환으로 분해능을 확인하였다. 또한 고체배지에서의 효소 활성 시험과 함께 EBW4 균주의 일반 유기물 분해능을 시험하기 위하여, 이미 알려진 방법 (Kapdan and Erten, 2007)을 변형하여 BM buffer에 glucose와 peptone이 4:1 비율로 혼합된 10,000 mg/L의 고농도 합성 폐수를 제조하고 최종 NaCl 농도가 0, 3, 10, 15%가 되게 한 후, 30℃, pH 7 조건에서 120시간 EBW4를 배양하면서 유기물 분해능을 TOC양으로 조사하였다.
혐기적 조건에서 균이 생장할 수 있는지는 Oxoid 사의 혐기성 배양기 안에 AnaeroGen^TM을 넣어 혐기적 조건을 만들어주고 30℃에서 48시간 균을 배양하여 관찰하였다. 탄수화물로부터 산 생성여부는 본 연구에서는 10% lactose가 포함된 ASS (Ammonium Salt Sugars) 배지에 균을 접종하여 균의 생장과 산 생성 여부를 조사하였다. 균이 탄수화물을 산화하는지 발효하는지 알아보고자 OF medium (Hugh and Leifson's, 1953)을 만든 후 2개의 배지에 같은 균을 멸균된 백금선을 사용하여 수직으로 중앙에 2 cm 깊이까지 접종하고 하나의 배지는 paraffin을 이용해 즉시 차폐시켜 배양한 후 관찰하였다.
포자의 관찰은 슬라이드 글라스에 증류수를 한 방울 떨어뜨리고 MA 배지에서 배양한 균을 멸균된 이쑤시개로 떠서 준비된 슬라이드 글라스에 넓게 도말한 후 열고정을 한 후, Moeller의 방법(1891)에 따라 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 혐기적 조건에서 균이 생장할 수 있는지는 Oxoid 사의 혐기성 배양기 안에 AnaeroGen^TM을 넣어 혐기적 조건을 만들어주고 30℃에서 48시간 균을 배양하여 관찰하였다. 탄수화물로부터 산 생성여부는 본 연구에서는 10% lactose가 포함된 ASS (Ammonium Salt Sugars) 배지에 균을 접종하여 균의 생장과 산 생성 여부를 조사하였다.
coli JM109에 형질전환하였다. 형질전환된 클론의 플라스미드 DNA를 분리한 후 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 ABI 377 자동염기서열 분석기(Applied Biosystem, USA)에서 양방향으로 DNA sequencing을 수행하였다.

대상 데이터

결정된 염기서열은 Ribosomal Database Project-II (http://rdp. cme.msu.edu)와 GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov)의 database 를 이용하여 분석하였다. 염기서열이 결정된 미생물의 계통관계 는 EZtaxon server를 이용하여 type 균주들의 16S rRNA 염기서 열과의 관계를 나타내었다(Chun et al.
본 연구에서는 배지별 생장여부와 온도, pH, 염도 등 세 가지 환경 조건을 달리하여 균주의 생장 여부를 조사하였다. 배지별 균 생장능은 Marine Ager (MA), Luria-Bertani (LB), Tryptic Soy Agar (TSA), Nutrient Agar (NA), R2A 배지에서 30℃에 배양하여 조사하였으며, 모두 Difco 제품을 사용하였다. 온도별 균 생장능은 MA 고체 배지에 접종 후 4–42℃ 범위에서 배양하여 조사하였다.
본 연구에서는 갯벌 환경에서 환경정화 기능을 담당하는 것으로 알려져 있는 갯지렁이(P. aibuhitensis)를 순천만 갯벌에서 채취하여 이로부터 미생물을 분리하였다. 갯지렁이를 BM buffer (Mikesell et al.

데이터처리

Alignment는 CLUSTAL X 1.83 (Täubel et al., 2003)에 의해 수행되었으며, 염기서열 간 gap은 BioEdit 프로그램을 이용하여 편집하였다 (Hall, 2007).

이론/모형

TOC의 잔존량을 측정하기 위하여 합성 폐수가 포함된 1 LBM 배지에 균주 EBW4를 접종하여 배양하면서 매 24시간 마다 50 ml 시료를 채취한 후 일부는 OD (600 nm) 값을 측정하는데 사용하였고, 나머지는 10,000 rpm에서 10 분간 원심 분리한 후, 상징액 만을 취해 멸균된 50 ml conical tube에 옮겨 -70℃에서 TOC를 측정할 때까지 보관하였다. TOC 측정은 Phoenix 8000 TOC Analyzer (Teledyne Technologies Co., USA)를 이용하여 수행하였다.
, 2003)에 의해 수행되었으며, 염기서열 간 gap은 BioEdit 프로그램을 이용하여 편집하였다 (Hall, 2007). 계통도는 MEGA 5 program (Kumar et al., 2008) 의 neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987)으로 그렸고, 계통도의 지형은 bootstrap 분석을 통해 평가되었다(Felsenstein, 1985). 기타 언급하지 않은 분자생물학적 실험은 이미 잘 알려진 방법(Maniatis et al.
균주의 형태와 크기는 그람 염색을 실시한 후 그람 양성인지 음성인지 판별하고 광학현미경을 통해 크기와 형태를 관찰하였다. 그람 염색은 Hucker의 방법 (1923)을 따라 수행하였다. 항산성(acid-fastness)은 Ziehl-Neelsen 의 방법(Bishop and Neuman, 1970)에 따라 염색을 한 후 현미경으로 관찰하였다.
, 2008) 의 neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987)으로 그렸고, 계통도의 지형은 bootstrap 분석을 통해 평가되었다(Felsenstein, 1985). 기타 언급하지 않은 분자생물학적 실험은 이미 잘 알려진 방법(Maniatis et al., 1982)에 따라 수행하였다.
세균의 16S rDNA를 증폭하기 위해 균주들을 액체 배지에서 30℃에서 2–3일 동안 배양한 후 이로부터 추출된 genomic DNA와 27F와 1522R로 이루어진 한 세트의 프라이머를 사용하여 이미 알려진 방법에 따라 PCR을 수행하였다(Lane, 1991).
항산성(acid-fastness)은 Ziehl-Neelsen 의 방법(Bishop and Neuman, 1970)에 따라 염색을 한 후 현미경으로 관찰하였다. 포자의 관찰은 슬라이드 글라스에 증류수를 한 방울 떨어뜨리고 MA 배지에서 배양한 균을 멸균된 이쑤시개로 떠서 준비된 슬라이드 글라스에 넓게 도말한 후 열고정을 한 후, Moeller의 방법(1891)에 따라 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 혐기적 조건에서 균이 생장할 수 있는지는 Oxoid 사의 혐기성 배양기 안에 AnaeroGen^TM을 넣어 혐기적 조건을 만들어주고 30℃에서 48시간 균을 배양하여 관찰하였다.
그람 염색은 Hucker의 방법 (1923)을 따라 수행하였다. 항산성(acid-fastness)은 Ziehl-Neelsen 의 방법(Bishop and Neuman, 1970)에 따라 염색을 한 후 현미경으로 관찰하였다. 포자의 관찰은 슬라이드 글라스에 증류수를 한 방울 떨어뜨리고 MA 배지에서 배양한 균을 멸균된 이쑤시개로 떠서 준비된 슬라이드 글라스에 넓게 도말한 후 열고정을 한 후, Moeller의 방법(1891)에 따라 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.

성능/효과

0–15% NaCl 농도 별 유기물 분해능에는 큰 차이가 없어 광염성 조건에서도 유기물 분해에 필요한 효소활성이 잘 유지되는 것으로 나타났다.
EBW4의 특성과 다양한 환경조건에서 유기물 분해능을 분석하였다. 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 균주 EBW4는 Bacillus hemicentroti JSM076093T 와 98.3%, Bacillus hwajinponensis SW-72^T와 97.96% 그리고 Bacillus algicoa KMM3737^T와 96.28%의 상동성을 보였다. EBW4의 생장 가능한 온도 범위는 4–40℃, 염분도 범위는 0–17%, pH 범위는 5–9로 나타나 EBW4는 광염성 균주 밝혀졌다.
여러 종류의 Tween이 포함된 배지에서 균을 배양한 후 균체 주변이 뿌옇게 변하는 것을 확인한 결과, EBW4는 Tween 20, Tween 40 그리고 Tween 60을 분해할 수 있는 lipase 활성을 가지고 있는 것으로 조사되었으나 Tween 80을 이용하지는 못하는 것으로 조사되었다. Cellulose분해 여부를 관찰하고자 cellulose가 함유된 배지에 균을 48시간 배양한 뒤 congo-red (0.1%)로 염색, 30분 후 1 M NaCl로 세척을 해 색을 관찰한 결과 EBW4는 cellulose 분해에 필요한 cellulase 활성을 갖고 있지 않은 것으로 나타났다. 다양한 종류의 고분자 유기물질을 분해할 수 있는 효소들이 해양 생물 유래 Bacillus균들에서 생산되는 것으로 보고된 바 있다(Verschuere et al.
EBW4와 계통관계가 가장 가까운 B. hemicentroti (Chen et al., 2011)의 생장 온도 범위는 5–40℃, 생장 염도 범위는 0.5–25% (w/v) NaCl, 생장 pH 범위는 pH 6.0–10.5로 생장가능한 온도와 염도 범위가 균주 EBW4와 상당히 일치하는 것으로 나타났으나, pH 조건에서는 균주 EBW4가 약한 산성 조건에서 생장가능한 호중성 균주인 반면, B. hemicentroti는 상대적으로 강한 알칼리성 조건에서 생장가능한 호중성 균주로 나타났다.
EBW4의 생장 가능한 온도 범위는 4–40℃, 염분도 범위는 0–17%, pH 범위는 5–9로 나타나 EBW4는 광염성 균주 밝혀졌다. EBW4의 세포막을 구성하는 주요 지방산으로는 anteiso C15:0, iso C_16:0, anteiso C_17:0, iso C_14:0 등으로 각각 48.2, 12.1, 11.6, 9.4% 비율로 나타났다. EBW4는 탄수화물, 단백질, 지방 등 다양한 고분자 유기물을 분해할 수 있는 DNase, amylase, protease, lipase 등의 효소 활성뿐만 아니라, alkaline phosphatase, esterase (C4), leucine arylamidase 그리고 α-chymotrypsin 효소 활성도 가지고 있었다.
, 1957) EBW4는 뚜렷한 투명대를 형성하여 DNAse 활성이 매우 높음을 알 수 있었다. Starch와 Casein을 함유한 배지를 이용하여 그 분해능을 시험한 결과 EBW4는 다당류인 Starch 분해에 필요한 amylase와 단백질인 Casein 분해에 필요한 효소 활성이 있음을 알 수 있었다. 여러 종류의 Tween이 포함된 배지에서 균을 배양한 후 균체 주변이 뿌옇게 변하는 것을 확인한 결과, EBW4는 Tween 20, Tween 40 그리고 Tween 60을 분해할 수 있는 lipase 활성을 가지고 있는 것으로 조사되었으나 Tween 80을 이용하지는 못하는 것으로 조사되었다.
4% 비율로 나타났다(Table 3). 계통학적 관계가 가장 가까운 B. hemocentroti와 B. hwajinponensis 주요 지방산 및 그 비 율에 있어 유사한 양상을 보였다. 균주 EBW4와 16S rRNA 염기서열에서 96.
고분자 물질을 사용하여 각 물질 분해에 관련된 효소 활성을 측정한 결과 균주 EBW4는 DNAse, amylase, protease, lipase 등의 활성을 가지고 있었다(Fig. 2 and Table 4). DNA 물질이 포함된 배지에 1 M HCl을 떨어뜨렸을 때 DNAse 활성을 갖고 있는 균주는 DNA를 분해하여 균체 주변이 투명하게 변하는데(Jeffries et al.
이러한 사실은 균주 EBW4가 조건적 호기성균(facultative aerobe)임을 제시해준다. 균주 EBW4가 glucose를 첨가한 산화 발효(oxidation-fermentation; OF) 배지를 이용한 탄수화물을 이용방 법을 조사한 결과 EBW4는 발효를 통해 당을 이용하는 것으로 나타났다.
균주 EBW4는 MA와 R2A배지에서 호기성 조건에서 생장하였으나 혐기성 조건에서도 미약하게 생장하는 것으로 나타났다(Table 1).
균주 EBW4의 단일 탄소원으로 다양한 기질의 이용 여부를 시험한 결과, EBW4는 N-acetyl-glucosamine, amygdalin, arbutin, cellobiose, D-turanose, esculin, fructose, galactose, gluconate, 2-keto-gluconate, 5-keto-gluconate, glucose, glycerol, glycogen, maltose, mannitol, mannose, mellibiose, melezitose, raffinose, ribose, salicin, starch, sucrose, trehalsose, α-methyl-D-glucoside 등을 잘 이용할 수 있는 것으로 나타났다(Table 2).
균주 EBW4의 세포막을 구성하는 주요 지방산으로 anteiso C_15:0, iso C_16:0, anteiso C_17:0, iso C_14:0 등으로 각각 48.2, 12.1, 11.6, 9.4% 비율로 나타났다(Table 3). 계통학적 관계가 가장 가까운 B.
균주 EBW4의 주요 효소 활성을 시험한 결과, EBW4는 alkaline phosphatase, gelatinase esterase (C4), leucine arylamidase, α-chymotrypsin 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다(Table 1).
Starch와 Casein을 함유한 배지를 이용하여 그 분해능을 시험한 결과 EBW4는 다당류인 Starch 분해에 필요한 amylase와 단백질인 Casein 분해에 필요한 효소 활성이 있음을 알 수 있었다. 여러 종류의 Tween이 포함된 배지에서 균을 배양한 후 균체 주변이 뿌옇게 변하는 것을 확인한 결과, EBW4는 Tween 20, Tween 40 그리고 Tween 60을 분해할 수 있는 lipase 활성을 가지고 있는 것으로 조사되었으나 Tween 80을 이용하지는 못하는 것으로 조사되었다. Cellulose분해 여부를 관찰하고자 cellulose가 함유된 배지에 균을 48시간 배양한 뒤 congo-red (0.
, 2004). 특히 균주 EBW4는 B. hemocentroti 와 약간의 차이는 있었으나 여러 고분자 활성에 필요한 amylase, protease 그리고 lipase 등의 효소 활성을 가지고 있다는 점에서 두 균주 간 생화학적 특성이 상당 부분 일치하는 것으로 나타났다. 이러한 사실은 균주 EBW4의 환경정화나 의약학 분야 등 산업적 활용 범위가 매우 클 것임을 제시해준다.
특히 극호 염성 세균(extremohalophile)의 생장범위가 15–30%라는 점을 고려해본다면, 균주 EBW4는 극호염성 환경에서도 살아가는 균으로 염분이 없는 환경에서부터 극고염성 환경에 이르기까지 매우 폭 넓은 범위 염도 조건에서 생장할 수 있는 광염성 세균 (euryhaline bacterium)으로 밝혀졌다.
Figure 3은 3% NaCl 농도가 더해진 10,000 mg/L의 높은 농도의 합성폐수를 사용하여 30℃에서 120시간 배양하면서 TOC의 변화 추이로 유기물의 이용능을 조사한 결과이다. 합성폐수 안의 유기물의 잔존양은 24시간 배양 시간대에 68%, OD (600 nm)값이 약간 감소하면서 정지기 상태인 48시간 배양 시간대에 46%, 72시간대 30%로 급속한 감소를 보였다. 0–15% NaCl 농도 별 유기물 분해능에는 큰 차이가 없어 광염성 조건에서도 유기물 분해에 필요한 효소활성이 잘 유지되는 것으로 나타났다.

후속연구

aibuhitensis)의 미생물상에 대해서는 처음으로 보고하는 것으로 파악되고 있다. 따라서 본 연구에서 해양 갯벌의 갯지렁이로부터 다양한 유기물 분해능이 우수하고 광염성 신균주로 여겨지는 Bacillus 균주, EBW4에 대한 연구의 가치가 크다고 할 수 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Bacillus 종들이 숙주에게 이로운 능력을 가진 것으로 연구된 사례는 무엇이 있는가?	Gatesoupe (1999)는 Bacillus가 소화계와 면역계를 촉진하는 능력이 있어 프로바이오틱스(probiotics)로 사용할 수 있음을 보고한 바 있으며, Bacillus subtilis는 단백질, 탄수화물, 지질 분해 효소 등 다양한 효소들을 생산할 수 있는 능력으로 인하여 숙주의 자연적 소화 활동에 기여하는 것으로 알려져 있다(Verschuere et al., 2000; Ziaei-Nejad et al., 2006). 이외에도 B. subtilis는 항미생물제를 생산하거나 영양과 공간에 대한 경쟁을 통하여 잠재적 병원미생물에 의한 피해를 방지하는 기능도 있는 것으로 알려져 있다(Vaseeharan and Ramasamy, 2003). 해양 어류에서 흔하게 나타나는 B. pumilus (Sugita et al., 1998)는 세포외 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 등 소화 활동에 관련된 주요 효소를 (Ghosh et al., 2002), 그리고 B. licheniformis는 항바이러스제를 생산하는 것으로 보고되어 있다(Arena et al., 2006). Bacillus는 어류 및 새우와 같은 수산양식에도 유용하게 활용할 수 있는 것으로 알려져 있으며, B. subtilis를 B. licheniformis 또는 B. pumilus와 함께 송어에 투여하였을 때 송어의 성장과 면역 저항 성을 향상시킬 수 있음이 알려져 있고(Raida et al., 2003; Bagheri et al., 2008), Bacillus의 몇몇 종은 새우 양식에서 항생제 대체제로 제안되고 있다(Banerjee et al., 2007).
	갯지렁이 Sabella spallanzanii는 세균에 관하여 어떤 능력이 있다고 보고되었는가?	, 2000). 갯지렁이 Sabella spallanzanii는 주위 환경으로부터 Bacillus를 비롯하여 다양한 세균을 축적하고 농축할 수 있는 능력이 있음이 보고된 바 있다 (Stabili et al., 2006).
	Bacillus subtilis는 숙주에서 어떤 역할을 하는가?	Gatesoupe (1999)는 Bacillus가 소화계와 면역계를 촉진하는 능력이 있어 프로바이오틱스(probiotics)로 사용할 수 있음을 보고한 바 있으며, Bacillus subtilis는 단백질, 탄수화물, 지질 분해 효소 등 다양한 효소들을 생산할 수 있는 능력으로 인하여 숙주의 자연적 소화 활동에 기여하는 것으로 알려져 있다(Verschuere et al., 2000; Ziaei-Nejad et al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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