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문제 정의
- 본 연구는 식물의 가뭄 스트레스 피해를 해결하기 위해 스트레스 상황에서 식물의 정상적인 생장을 방해하는 stress ethylene을 감소시키는 효소 ACC deaminase를 생성하고 더불어 식물생장촉진 효과가 있는 식물호르몬을 생성하는 균주를 선별하는 것을 목적으로 하였다. 그리고 실제로 선별된 균주들이 식물의 가뭄 스트레스 극복을 돕는지 토마토를 대상으로 조사하였다.
제안 방법
- 60 mm)(Phenomenex, USA)을 이용하였고, flow rate는 1 ml/min로 설정하였다. ABA는 0.1 M acetic acid를 첨가한 55% methanol, 그리고 cytokinin은 70% methanol을 이동상으로 사용하였고 각각 265 nm와 254 nm 파장에서 분석하였다(Karadeniz et al., 2006). 균주의 모든 식물호르몬 생성능은 단백질 대비값(μg/mg protein)으로 나타내었다.
- ACC deaminase 활성은 toluenized cell을 이용하여 측정하였는데 활성 정도는 표준 α-ketobutyrate (α-KB)로 0.2–10 mM 범위의 표준곡선을 만들어 조사하였다.
- ACC deaminse와 식물호르몬 생성능을 지닌 균주들을 대상으로 토마토 종자발아 시 뿌리신장을 조사하였다. 균주 m-2, m-4, BD2-26과 BD3-35는 발아된 토마토 유묘의 뿌리길이를 각각 유의성 있게 132, 171, 161과 102% 증가시켰는데, 이는 각 균주가 지니는 ACC deaminase 작용에 의한 에틸렌 억제능과 각 식물호르몬 작용에 따른 식물생장 촉진능이 영향을 준 것으로 보인다(Fig.
- ACC를 유일 질소원으로 사용하여 생장하는 능력에 근거하여 균주를 선별하였다. 질소원이 존재하지 않는 DF salts 최소한 천배지(Penrose and Glick, 2003)에 10 mM ACC 100 µl를 도말하여 실험군으로 사용하였다.
- 30℃에서 계대배양을 반복하여 균주들을 순수분리하였다. 갯씀바귀와 통보리사초 근권에서 각각 순수분리한 균주 BD3-35와 BD2-26, 맥문동 근권에서 분리한 m-2와 m-4를 동정하기 위해 (주)마크로젠에 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 의뢰하였고, 얻어진 16S rRNA 유전자의 전체 염기서열을 EzTaxon server 2.1 (http://147.47.212.35.8080/index.jsp)을 이용하여 동정하였다.
- 균주가 에틸렌 생성을 억제하여 뿌리생장을 촉진하는 것을 조사하기 위해 에틸렌 생성 억제물질인 CoCl2를 대조군으로 처리하여 실험을 진행하였다. 멸균된 Whatman No.
- 균주들의 다른 식물호르몬인 ABA와 cytokinin 생성능을 조사하였는데 균주들을 brain heart broth (BHB; Difco Lab.) 배지 100 ml에서 선배양 후(72 h, 30℃) 분광광도계를 이용하여 OD600이 1이 되도록 보정하였다. 90 ml BHB 배지에 보정한 균주 10 ml를 접종하고 빛이 없는 조건에서 배양하였다(30℃, 200 rpm).
- 단백질 정량은 toluenized cell을 Bradford assay를 이용하여 측정하였는데 정량은 bovine serum albumin으로 100–1,000 ppm 범위의 표준곡선을 만들어 측정하였다.
- 5 cm인 플라스틱 용기 3개에 각각 담았다. 뿌리길이가 1 cm 이하의 유사한 길이로 발아한 토마토 유묘 4개씩을 약 2 cm 깊이로 심고 7일간 plant growth chamber에서 광조건(12 h, 30℃, 6,000 lux)과 암 조건(12 h, 24℃) 하에 2일에 한 번씩 증류수 20 ml를 공급하여 토양 수분보유능의 20%가 되게 하며 재배하였다. 균주는 LB 배지(Difco Lab)에서 배양(72 h, 30℃, 200 rpm) 후 원심분리(3000×g, 4℃, 20 min)를 통해 멸균 증류수로 세척하고, 토양 1 g 당 균주 108 cell로 토마토 유묘에 처리하였다.
- 선발균주가 토마토 식물의 가뭄 스트레스 극복을 돕는 것을 조사하기 위해 소규모 토양재배 실험을 진행하였다. 먼저 토양을 2 mm 체로 거른 후 토양과 시판되는 부산물 퇴비의 비율이 70:30이 되도록 혼합한 후 250 g씩을 직경 7.
- 식물의 가뭄 스트레스 하의 생장을 돕는 균주를 분리하기 위해, 수분 결핍과 염분 스트레스를 받는 사구식물의 근권에서 균주를 분리하였다. 경기도 을왕리 해수욕장에서 갯씀바귀(Lxeris repens)와 통보리사초(Carex kobomugi)를 채취하였고 강원도 경포해변 사구에서 맥문동(Liriope platyphylla)을 채취하였다.
- 이를 원심분리(16,000×g, 4℃, 5 min)하여 상등액을 제거하고 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) 600 µl와 toluene 30 µl를 첨가하여 toluenized cell을 만들었다.
- 갯씀바귀와 통보리사초 근권에서 각각 분리한 균주 BD3-35와 BD2-26, 맥문동 근권에서 분리한 균주 m-2와 m-4가 질소원이 없는 음성 대조군 배지에서 생장하지 않았으나 ACC를 유일질소원으로 첨가한 실험군 배지에서 생장하였고, 질소원을 첨가한 양성 대조군 배지와 비교하여 대등하게 생장하였으므로 균주들이 ACC를 질소원으로 이용하여 배양되었다는 것을 알 수 있었다. 이에 따라 각 균주들을 ACC deaminase 생성능이 있는 균주로 선별하였다. 이들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 NCBI 등록 균주들과 비교한 결과, BD3-35는 Pseudomonas brassicacearum subsp.
- 정량분석은 high performance liquid chromatograph (Waters Co., USA)로 Luna 5 μ C18 column(250×4.60 mm)(Phenomenex, USA)을 이용하였고, flow rate는 1 ml/min로 설정하였다.
대상 데이터
- 식물의 가뭄 스트레스 하의 생장을 돕는 균주를 분리하기 위해, 수분 결핍과 염분 스트레스를 받는 사구식물의 근권에서 균주를 분리하였다. 경기도 을왕리 해수욕장에서 갯씀바귀(Lxeris repens)와 통보리사초(Carex kobomugi)를 채취하였고 강원도 경포해변 사구에서 맥문동(Liriope platyphylla)을 채취하였다. 채취한 식물의 뿌리에 붙어 있는 토양을 털어내고 생리식염수(0.
- 본 연구는 식물의 가뭄 스트레스 피해를 해결하기 위해 스트레스 상황에서 식물의 정상적인 생장을 방해하는 stress ethylene을 감소시키는 효소 ACC deaminase를 생성하고 더불어 식물생장촉진 효과가 있는 식물호르몬을 생성하는 균주를 선별하는 것을 목적으로 하였다. 그리고 실제로 선별된 균주들이 식물의 가뭄 스트레스 극복을 돕는지 토마토를 대상으로 조사하였다.
- 순수분리한 균주들을 획선접종하여 3–14일 동안 30℃에서 배양하였고, 음성 대조군에선 생장하지 않았으나 양성 대조군과 대등하게 실험군에서 생장한 균주들을 선별하여(Govindasamy et al., 2009) 이들을 대상으로 실험을 수행하였다.
- 질소원이 존재하지 않는 DF salts 최소한 천배지(Penrose and Glick, 2003)에 10 mM ACC 100 µl를 도말하여 실험군으로 사용하였다.
데이터처리
- 2 여과지가 깔린 멸균된 유리 페트리 접시에 70% 알코올로 5분간 소독한 토마토종자 20개씩을 놓은 후 균주(5×107 cells/ml) 6 ml와 2 μM CoCl2 6 ml 그리고 멸균 증류수 6 ml를 각각 처리하였다. 6일 동안 30℃에서 암 조건으로 배양한 후에 발아된 토마토 유묘의 뿌리길이를 측정하였고, 결과는 Analysis of Variance (ANOVA, SYSTAT ver. 10, 2000, Systat Software, USA)를 이용하여 통계처리 하였다.
- 균주는 LB 배지(Difco Lab)에서 배양(72 h, 30℃, 200 rpm) 후 원심분리(3000×g, 4℃, 20 min)를 통해 멸균 증류수로 세척하고, 토양 1 g 당 균주 108 cell로 토마토 유묘에 처리하였다. 재배 7일 후에 전체 식물을 회수하여 뿌리길이, 줄기길이와 건조중량을 측정하였으며 결과는 ANOVA를 이용하여 통계처리 하였다.
성능/효과
- 가뭄 조건 하의 소규모 토양재배 실험은 토양 수분보유능의 20% 조건에서 수행하였는데 10%인 경우 토마토가 자라지 못하고 모두 말라 죽었기 때문이다. 7일 재배 후 토마토 식물의 뿌리 길이는 m-4 균주가 대조군에 비해 유의성 있게 35% 증가시켜 유묘 뿌리신장 결과와 동일하게 균주들 중에서 가장 높았다(Fig. 3). 이는 m-4가 다른 균주에 비해 더 많이 생성하는 옥신의 뿌리 생장 촉진능과 더불어 ACC deaminase 활성이 가뭄 스트레스에 노출된 식물에 작용해 뿌리생장을 촉진한 것으로 보인다.
- ACC deaminse 생성능을 가진 4개의 균주들에 대해 전구물질 L-tryptophan을 3 mM 첨가하여 옥신 IAA와 IBA 생성을 측정했을 때 m-4 균주가 가장 높은 생성능을 나타냈는데 IAA는 배양 2일째에 763 μg/mg protein으로 최대 생성능을 보이며 IBA는 3일째 426 μg/mg으로 최대 생성능을 나타내었다(Fig. 1).
- BD3-35 균주의 효소 활성도는 우수활성 균주로 보고된 Enterobacter cloacae UW4의 21.23 μM α-KB/mg/h (Ma et al., 2003)와 비교할 때 거의 유사하여 활성이 우수한 균주임을 알 수 있었다.
- 이들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 NCBI 등록 균주들과 비교한 결과, BD3-35는 Pseudomonas brassicacearum subsp. neoaurantiaca와 100%, BD2-26은 Pseudomonas thivervalensis 와 99.886%, m-2는 Escherichia hermannii와 98.579%, 그리고 m-4는 Enterobacter asburiae와 99.774%의 상동성을 나타내어 각각의 균주로 동정되었다. 그러나 정확한 종 수준까지의 동정을 위해서는 생화학적 특성과 DNA-DNA 혼성화 실험이 필요하다.
- 각 균주들의 ACC deaminase 활성은 BD3-35 균주가 20.26 μM α-KB/mg protein/h로 가장 높았으며, BD2-26 균주는 6.31 μM/mg/ h, m-4는 0.41 μM/mg/h, 그리고 m-2는 0.36 μM/mg/h로 가장 낮았다.
- 갯씀바귀와 통보리사초 근권에서 각각 분리한 균주 BD3-35와 BD2-26, 맥문동 근권에서 분리한 균주 m-2와 m-4가 질소원이 없는 음성 대조군 배지에서 생장하지 않았으나 ACC를 유일질소원으로 첨가한 실험군 배지에서 생장하였고, 질소원을 첨가한 양성 대조군 배지와 비교하여 대등하게 생장하였으므로 균주들이 ACC를 질소원으로 이용하여 배양되었다는 것을 알 수 있었다. 이에 따라 각 균주들을 ACC deaminase 생성능이 있는 균주로 선별하였다.
- 26 α-ketobutyrate μM/mg protein/h을 나타내었다. 균주 BD3-35와 BD2-26는 식물호르몬 시토키닌, m-4는 옥신 IAA와 IBA, 그리고 균주 m-2는 ABA 생성능을 가졌다. 이 균주들은 모두 토마토종자 발아 시 유묘의 뿌리신장을 유의성 있게 촉진하였다.
- 균주들의 ABA 생성능을 조사한 결과 m-2 균주가 배양 4일째 1.83 μg/mg protein (0.32 μg/ml)의 생성능을 보였다.
- 또한 7일간 자란 토마토 식물에 처리하고 가뭄 스트레스 하에서 7일간 재배하였을 때 비접종 대조군에 비해 균주 BD3-35, m-2와 m-4는 토마토 뿌리의 길이를 각각 14, 15와 35% 증가시켰으며, m-2, BD2-26와 BD3-35는 토마토 식물의 건조중량을 각각 22, 33과 68% 증가시켰다. 따라서 이 균주들은 가뭄 스트레스 하의 식물을 위한 미생물 비료로 사용될 수 있는 가능성을 보였다.
- 이 균주들은 모두 토마토종자 발아 시 유묘의 뿌리신장을 유의성 있게 촉진하였다. 또한 7일간 자란 토마토 식물에 처리하고 가뭄 스트레스 하에서 7일간 재배하였을 때 비접종 대조군에 비해 균주 BD3-35, m-2와 m-4는 토마토 뿌리의 길이를 각각 14, 15와 35% 증가시켰으며, m-2, BD2-26와 BD3-35는 토마토 식물의 건조중량을 각각 22, 33과 68% 증가시켰다. 따라서 이 균주들은 가뭄 스트레스 하의 식물을 위한 미생물 비료로 사용될 수 있는 가능성을 보였다.
- 본 연구를 통해 ACC deaminse와 식물호르몬 생성능을 지닌 분리균주 m-2, m-4, BD2-26와 BD3-35가 가뭄 스트레스에 노출된 식물체의 생장을 촉진하는데 작용하는 것을 알 수 있었다. 실제 수분 결핍 환경에서의 후속연구를 통해 건조한 지역에 있는 작물이나 나대지 식물에 미생물 비료 등으로 활용 시 식물생장을 지속시킬 수 있을 것으로 예상된다.
- 4) 이는 이 균주가 ACC deaminase 활성이 가장 높을 뿐만 아니라 식물의 세포 분열을 촉진하는 시토키닌 생성능을 가졌기 때문에 생장이 활발하게 일어나는 유묘 상태의 토마토에 작용해 세포분열을 더욱 촉진시켜 건조중량이 증가한 것으로 보인다. 한편 시토키닌 생성능이 있는 BD2-26 균주와 ABA 생성능이 있는 m-2 균주는 건조중량을 대조군 대비 각각 33%와 22% 증가시켰는데(Fig. 4) 실험 개체수를 증가시키면 통계적 유의성이 나타날 것으로 기대되며 이들 균주 또한 식물체가 가뭄 스트레스를 극복하고 생장하는데 도움을 줄 것이 예상된다.
후속연구
- 8% 긴 것으로부터 알 수 있다. 그러나 균주들의 ACC deaminase의 활성과 뿌리신장의 정도는 일치하지 않았는데 종자발아와 세포분열 및 길이 생장에 다양한 식물호르몬이 작용할 뿐만 아니라 상호작용할 수 있으므로(Ahmad et al., 2008) 이에 대해 더 많은 연구가 필요하다.
- 본 연구를 통해 ACC deaminse와 식물호르몬 생성능을 지닌 분리균주 m-2, m-4, BD2-26와 BD3-35가 가뭄 스트레스에 노출된 식물체의 생장을 촉진하는데 작용하는 것을 알 수 있었다. 실제 수분 결핍 환경에서의 후속연구를 통해 건조한 지역에 있는 작물이나 나대지 식물에 미생물 비료 등으로 활용 시 식물생장을 지속시킬 수 있을 것으로 예상된다.
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