[논문]맥문동(麥門冬)이 4-HNE에 의해 유도된 Apoptosis에 미치는 영향

박수환; 김연섭

doi:10.6116/kjh.2013.28.2.33.

맥문동(麥門冬)이 4-HNE에 의해 유도된 Apoptosis에 미치는 영향
Effects of Liriopis Tuber on 4-HNE-induced Apoptosis in PC-12 Cells 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.28 no.2, 2013년, pp.33 - 38

박수환 (가천대학교 한의과대학 해부경혈학교실) , 김연섭 (가천대학교 한의과대학 해부경혈학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Objects : Apoptosis leads to the death of a cell. The mitochondrial pathway of apoptosis, a process regulated by the Bcl-2 family of proteins, plays a key role in various biological processes. The tuber of Liriope platyphylla Wang et TANG (Liliaceae), also known as Liriopis tuber, is famous in Oriental medicine owing to its tonic, antitussive, expectorant and anti-asthmatic properties. The purpose of this study was to observe the effect of the Liriopis tuber on mitochondrial-mediated apoptosis in PC-12 cells. Method : A cytotoxic test on Liriopis Tuber water extract was conducted and another MTT assay was conducted to observe the cytoprotective effect against 4-HNE 25 ${\mu}M$ that causes oxidative stress in PC-12 cells for 24 hours. In addition, in order to observe the expression of Bcl-2 and Bax protein involved with apoptosis, western blot was conducted. Results : The LT water extract had no toxicity for PC-12 cell. In the cytoprotective effect against 4-HNE, both of the group treated with 50 ${\mu}g/m{\ell}$ and 100 ${\mu}g/m{\ell}$ of LT water extract showed a significant increase in comparison with the control group. In Bax protein expression, all the experimental groups treated with LT water extract showed a decrease in comparison with the control group but had no significance. In Bcl-2 protein expression, all the experimental groups treated with LT water extract showed a significant increase in comparison with the control group. Conclusion : These results suggest that LT is effective in reducing apoptosis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이에 저자는 맥문동에 신경보호 효능이 있어 mitochondrial (intrinsic) pathway를 통한 apoptosis에도 효과가 있을 것으로 생각하여 이를 검증하기 위하여 맥문동물 추출물의 세포독성을 검사하기 위해 세포를 배양하여 MTT 방법으로 세포의 생존율을 측정하였다. 그리고 산화적 스트레스를 일으켜 apoptosis를 촉진하는 4-Hydroxynonenal (4-HNE)^20,21)을 투여하여 손상된 PC-12 cell의 세포 생존율을 측정하고, apoptosis에 관여하는 Bax와 Bcl-2 단백질의 발현을 western blot분석으로 관찰한바 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
본 연구에서 맥문동이 apoptisis에 미치는 영향을 관찰하였다. 맥문동의 세포독성에 대한 검사를 하고 산화스트레스를 일으키는 4-HNE에 대한 세포보호 효과를 관찰하기 위해 MTT assay를 실시하였다.
이에 저자는 맥문동에 신경보호 효능이 있어 mitochondrial (intrinsic) pathway를 통한 apoptosis에도 효과가 있을 것으로 생각하여 이를 검증하기 위하여 맥문동물 추출물의 세포독성을 검사하기 위해 세포를 배양하여 MTT 방법으로 세포의 생존율을 측정하였다. 그리고 산화적 스트레스를 일으켜 apoptosis를 촉진하는 4-Hydroxynonenal (4-HNE)^20,21)을 투여하여 손상된 PC-12 cell의 세포 생존율을 측정하고, apoptosis에 관여하는 Bax와 Bcl-2 단백질의 발현을 western blot분석으로 관찰한바 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

가설 설정

1. 맥문동물추출물은 PC-12 cell에 대한 세포 독성이 없었다.

제안 방법

LT의 PC-12 세포 생존율을 측정하기 위해 96 well plate에 각 well당 4 × 104 개/ml를 성장 배지에 seeding 하고 24시간 후에 serum-free RPMI 1640 배지로 갈아주고 LT를 처리하지 않은 정상군(Normal)과 LT를 각각 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml 의 농도로 24시간 처리한 실험군으로 나누었다.
각 단백질의 발현을 비교하기 위해서 발색된 band의 밀도는 Gel Documentation (Bio-Rad, USA)의 Quantity One Analysis Software (Bio-Rad)로 측정을 하였다. 통계분석은 4-HNE와 4-HNE+맥문동 투여 group 간의 유의성검증 Graphpad Prism (USA)으로 Student's t-test를 사용하였으며, 실험 결과는 평균 ± 평균의 표준오차[means ± standard error of the mean (SEM)]로 나타내었다.
그 후 media를 제거하고 DMSO 100 μl를 넣은 후 70℃ incubator에서 10분간 녹여서 ELISA reader를 이용하여 흡광도 570 ㎚에서 세포의 생존율을 측정하였다.
그룹은 5개 군으로, 정상군 (Normal)과 4-HNE 25 μM을 처리한 대조군(Control), LT를 각각 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml을 24시간 처리 후 4-HNE를 25 μM의 농도로 24시간 동한 처리한 3개의 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다.
Nitrocellulose membrane으로 단백질 이동은 4℃ 냉장고 안에서 실시하였다. 단백질 밴드 검출은 ECL detection Reagent (Amersham, UK)를 사용하여 발색시켰다.
그리고 세포분해용액(iNtRON Biotechnology, Korea)을 넣은 후 초음파 분쇄기로 세포를 균질화 하고 다시 원심분리기를 이용하여 30분 동안 12,000 rpm으로 원심 분리하였다. 단백질 정량은 Bio-Rad의 protein assay dye reagent (Bio-Rad, USA)를 사용하여 흡광도로 측정하였다. 80 μg의 단백질을 Mini-PROTEANⓇ TGXTM Gel (Bio-Rad, USA)에 loading하여 분리한 다음 nitrocellulose membrane (Bio-Rad, USA)으로 이동시켰다.
본 실험에 사용한 국산 맥문동(Liriope platyphylla WANG et TANG)은 (주)허브메디에서 구입하여 사용하였다. 맥문동 50 g에 물 500 ml를 가하여 환류추출기에서 2시간 동안 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압농축한 후 동결건조 하였다. 맥문동은 28.
본 연구에서 맥문동이 apoptisis에 미치는 영향을 관찰하였다. 맥문동의 세포독성에 대한 검사를 하고 산화스트레스를 일으키는 4-HNE에 대한 세포보호 효과를 관찰하기 위해 MTT assay를 실시하였다. 또한 apoptosis에 관여하는 Bcl-2와 Bax 단백질의 발현을 관찰하기 위해 western blot을 실시한 결과 다음과 같다.
맥문동이 4-HNE 손상에 의한 PC-12 cell에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 세포에 맥문동물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 생존율을 측정하였다. 정상군(Normal)의 세포율을 100%로 하였으며 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 PC-12 cell 생존율은 63.
맥문동이 PC-12 cell에 독성이 있는 가를 관찰하기 위해, 세포에 맥문동물추출물을 처리하고 세포의 생존율을 측정하였다. 정상군(Normal)의 세포 생존율을 100%로 하였다.
맥문동이 antiapoptosis 인자인 Bcl-2에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 맥문동물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 Bcl-2 단백질 발현양을 측정하였다. 정상군(Normal)의 Bcl-2 단백질 발현양을 100%로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 Bcl-2단백질 발현양은 78 ± 7.
맥문동이 proapoptosis 인자인 Bax에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 맥문동물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 Bax 단백질 발현양을 측정하였다. 정상군(Normal)의 Bax 단백질 발현양을 100%로 하였으며, 4-HNE만 투여한 대조군(Control)의 Bax 단백질 발현양은 132 ± 22.

대상 데이터

1차 항체로 sheep actin antibody (1:500; R&D Systems, USA)와 mouse Bax antibody (1:500; Trevigen, USA), mouse Bcl-2 antibody (1:1500; R&D Systems, USA)를 사용하였다.
2차 항체로는 Bax와 Bcl-2용 horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody (1:1000; R&D Systems, USA)를 사용하였다.
본 실험에 사용된 시약은 RPMI Medium 1640 (Gibco, USA), Fetal Bovine Serum (Gibco, USA), Horse Serum (Gibco, USA), 4-Hydroxy Nonenal (Cayman, USA), MTT (Sigma, USA), Sodium Bicarbonate (Sigma, USA), Trizma Base (Sigma, USA), Sodium Chloride (Sigma, USA), Dimethyl Sulfoxide (Amresco, USA) 등을 구입하여 사용하였다.
본 실험에 사용한 PC-12(rat adrenal pheochromocytoma cell) 세포는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다. 세포의 배양을 위해 10% horse serum과 5% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin, 2% NaHCO3가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37℃의 온도와 5% CO₂가 포함된 공기가 공급되는 CO₂ incubator에서 세포를 배양하였다.
본 실험에 사용한 국산 맥문동(Liriope platyphylla WANG et TANG)은 (주)허브메디에서 구입하여 사용하였다. 맥문동 50 g에 물 500 ml를 가하여 환류추출기에서 2시간 동안 전탕하고, 여과액을 rotary evaporator로 감압농축한 후 동결건조 하였다.
본 실험을 위해 사용된 기기는 Clean Bench (Nuaire, USA), CO₂ Incubator (Nuaire, USA), Microplate Reader (Dynex, USA), Spectrophotometer (Implen, Grrmany), Water Purification(High-Q, USA), Freezing dryer (Eyela, Japan), Auto clave (sam woo, Korea), Balance (Mettler, Switzerland), Centrifuge (Hanil. Korea), Sonicator (Sonics, USA) 등이다.
본 실험에 사용한 PC-12(rat adrenal pheochromocytoma cell) 세포는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하였다. 세포의 배양을 위해 10% horse serum과 5% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin, 2% NaHCO3가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37℃의 온도와 5% CO₂가 포함된 공기가 공급되는 CO₂ incubator에서 세포를 배양하였다.

데이터처리

통계분석은 4-HNE와 4-HNE+맥문동 투여 group 간의 유의성검증 Graphpad Prism (USA)으로 Student's t-test를 사용하였으며, 실험 결과는 평균 ± 평균의 표준오차[means ± standard error of the mean (SEM)]로 나타내었다.

이론/모형

그룹은 5개 군으로, 정상군 (Normal)과 4-HNE 25 μM을 처리한 대조군(Control), LT를 각각 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml을 24시간 처리 후 4-HNE를 25 μM의 농도로 24시간 동한 처리한 3개의 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. LT가 4-HNE로 자극된 PC-12 cell에서 LT의 세포 생존율 측정을 위해서 MTT Assay를 이용하였다.
세포 생존율을 측정하기 위해 MTT (3-[4,5 – Dimethylthiazol - 2- yl]-2,5 – diphenyl – tetrazolium bromide) assay를 사용하였다.

성능/효과

2. 맥문동물추출물 50 μg/ml과 100 μg/ml을 주입한 군 모두 4-HNE만 투여한 대조군에 비해 유의한 증가를 나타내었다.
3. 맥문동물추출물을 주입한 실험군 모두 대조군에 비해 Bax 단백질 발현양 감소를 나타내었지만 유의성은 없었다.
4. 맥문동물추출물을 주입한 실험군 모두 대조군에 비해 유의한 Bcl-2 단백질 발현양 증가를 나타내었다.
맥문동물추출물 200 μg/ml주입군(LT200)의 PC-12 cell 생존율은 109 ± 6.35%였고, 맥문동물추출물 400 μg/ml주입군(LT400)의 PC-12 cell 생존율은 101 ± 6.87%로 실험군 모두 대조군에 비해 증가하였으나 유의성은 없었다(Fig 1).
맥문동물추출물 50 μg/ml 과 4-HNE를 주입한 군(LT50)의 PC-12 cell 생존율은 69.75 ± 4.56%였으며, 맥문동물추출물 100 μg/ml과 4-HNE를 주입한 군(LT100)의 PC-12 cell 생존율은 70.25 ± 3.10%로 두 군 모두 대조군에 비해 유의한 증가를 나타내었다.
맥문동물추출물 50 μg/ml과 4-HNE를 주입한 군(LT50)에서 Bax 단백질 발현양은119 ± 5.76%, 맥문동물 추출물 100 μg/ml과 4-HNE를 주입한 군(LT100)에서 Bax 단백질 발현양은 123 ± 14.17% 및 맥문동물추출물 200 μg/ml과 4-HNE를 주입한 군(LT200)에서 Bax 단백질 발현양은 108 ± 6.97%로 실험군 모두 대조군에 비해 감소를 나타내었지만 유의성은 없었다(Fig 3).
맥문동물추출물 50 μg/ml과 4-HNE를 주입한 군(LT50)에서 Bcl-2 단백질 발현양은 105 ± 6.30%, 맥문동물추출물 100 μg/ml과 4-HNE를 주입한 군(LT100)에서 Bcl-2 단백질 발현양은 109 ± 7.26% 및 맥문동물추출물 200 μg/ml과 4-HNE를 주입한 군(LT200)에서 Bcl-2 단백질 발현양은 106 ± 6.31%로 실험군 모두 대조군에 비해 유의한 증가를 나타내었다(Fig 4).
맥문동물추출물 50 μg/ml주입군(LT50)에서 PC-12 cell 생존율은 101 ± 6.83%였고, 맥문동물추출물 100 μg/ml주입군(LT100)의 PC-12 cell 생존율은 105 ± 5.21%이였다.
맥문동이 4-HNE에 의한 PC-12 cell 손상에 미치는 영향을 관찰한 결과, 맥문동물추출물 50 μg/ml과 100 μg/ml 두 군에서만 대조군에 비해 유의한 증가를 보여 4-HNE에 대한 세포손상에 대해 보호 효과가 있는 것으로 나타났다.
맥문동이 proapoptosis 인자인 Bax에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 맥문동물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 Bax 단백질 발현양을 측정한 결과 맥문동물추출물 50, 100 및 200 μg/ml 실험군 모두대조군에 비해 유의성은 없었으나 감소를 나타내었다.
맥문동이 proapoptosis 인자인 Bcl-2에 미치는 영향을 관찰하기 위해 세포에 맥문동물추출물을 처리한 다음 4-HNE를 주입하고 세포의 Bcl-2 단백질 발현양을 측정한 결과 맥문동물추출물 50, 100 및 200 μg/ml 실험군 모두 대조군에 비해 유의한 증가를 나타내었다.
이상의 결과들로 보아 맥문동이 세포손상에 의한 apoptosis를 억제하는 효능이 있는 것으로 생각된다.
이상의 결과를 종합해 보면 맥문동은 세포손상으로 인한 Bax 단백질양의 증가를 억제시키고 Bcl-2 단백질양의 감소를 회복시키는 작용이 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	proapoptotic 대 antiapoptotic 분자의 비율이 세포의 운명을 결정하는 이유는?	Antiapoptic과 proapoptotic 단백질들 간의 비율이 깨지게 되면 미토콘드리아로부터 cytosol로 cytochorome c를 방출하여 caspase를 활성화하여 apoptosis를 유발시킨다. 따라서 proapoptotic 대 antiapoptotic 분자의 비율은 세포의 운명을 결정한다9).
	세포의 죽음은 어떻게 나뉠 수 있나?	세포의 죽음은 세포의 손상이 심하면, 세포에서 부종이 일어나고 용해가 일어나 세포 내용물이 밖으로 분출되는 괴사와 죽음을 조절하기 위해 유전적, 생화학적 프로그램을 활성화 하는 과정인 apoptosis로 나뉠 수 있다1).
	Apoptosis이 하는 일은?	Apoptosis는 미토콘드리아 내 cytochrome c 등을 미토콘드리아 외막구멍(apoptotic pore)을 통해 세포질로 내보내는 역할을 하여2), 세포질의 수축, 세포와 세포결합 파괴, 세포질 내 부피 감소, 일부 세포 소기관의 수축, 염색질 응축, 핵분열 및 식세포작용에 의한 탐식 등이 일어나게 한다3).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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