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문제 정의
- 카네이션과 같은 영양번식성 작물의 경우, 증식하는 과정 중에 바이러스의 확산과 전파가 용이한데, 우리나라에서는 카네이션괴저바이러스(CNFV)와 카네이션둥근반점바이러스(CRSV)를 식물검역 바이러스로 지정하여 수입검사를 수행하고 있다. 본 연구에서는 CNFV와 CRSV를 신속, 정밀하고 쉽게 진단할 수 있는 특이적인 프라이머를 고안하였으며, 높은 검출 감도를 가지는 nested 프라이머 조합을 개발하였다. CNFV를 검사하기 위해 최종 선발된 특이적인 프라이머는 2 세트로 288과 447 bp를, CRSV를 검사하기 위해 최종 선발된 특이적인 프라이머는 2 세트로 503과 549 bp를 증폭하였다.
- 본 연구에서는 CNFV와 CRSV에 종특이적인 염기서열을 이용하여 RT-PCR과 nested PCR을 위한 primer set와 실험 시 양성대조구로 사용할 수 있는 돌연변이-양성대 조구를 고안하였다. 돌연변이-양성대조구는 실험 시 양성대조구로 사용될 것이며, 염기서열을 분석하면 6개의 염기서열 삽입 유무에 따라 plasmid에서 시료로 부터의 오염을 확인할 수 있을 것이다.
제안 방법
- SolGent RNA mini prep kit (Solgent, Korea)를 사용하여 감염시료의 잎에서 total RNA의 추출하였으며, DNeasy® Plant mini kit (Qiagen, Netherlands)를 사용 하여 카네이션의 genomic DNA를 추출하였다(Woo, 2002).
- 1−4차 선발에 합격한 primer 조합 중 민감도가 가장 높은 primer 조합을 선발 하기 위하여 total RNA를 원액~10−8까지 희석하였으며, 각각 1 µl를 주형으로 one-step RT-PCR로 반응하여 민감도가 가장 좋은 primer set를 두 개씩 선발하였다.
- 설계한 CNFV와 CRSV의 primer는 PCR 증폭이 가능한 21가지와 54가지로 조합하였으며, 이후 4단계에 걸쳐 선발하였다. 1차 선발로 primer 조합들과 대상 바이러스와의 특이적 반응여부를 보고, 2차 선발로 유연관계에 있는 바이러스와의 비특이적 반응여부를 확인하였다. 3차 선발로 기주관련 바이러스와의 비특이적 반응여부를 확인한 후, 4차 선발로 기주 genomic DNA와의 비특이적 반응여부를 확인하였다.
- 3차 선발로 기주관련 바이러스와의 비특이적 반응여부를 확인한 후, 4차 선발로 기주 genomic DNA와의 비특이적 반응여부를 확인하였다. 2차와 3차 선발은 각각 바이러스들의 cDNA를 사용하였으며, CNFV는 ArMV, CRSV와의 비특이적 반응을 확인하였고, CRSV는 Tobacco necrosis virus (TNV), TBSV, ArMV 및 CNFV와의 비특이적 반응을 확인하였다. 이 때, target의 예상 크기 이외에 추가로 형성된 밴드는 모두 비특이적인 반응이라고 간주 하였다.
- 1차 선발로 primer 조합들과 대상 바이러스와의 특이적 반응여부를 보고, 2차 선발로 유연관계에 있는 바이러스와의 비특이적 반응여부를 확인하였다. 3차 선발로 기주관련 바이러스와의 비특이적 반응여부를 확인한 후, 4차 선발로 기주 genomic DNA와의 비특이적 반응여부를 확인하였다. 2차와 3차 선발은 각각 바이러스들의 cDNA를 사용하였으며, CNFV는 ArMV, CRSV와의 비특이적 반응을 확인하였고, CRSV는 Tobacco necrosis virus (TNV), TBSV, ArMV 및 CNFV와의 비특이적 반응을 확인하였다.
- 효율성 검증. 4단계 선발을 거친 CNFV 조합 7가지 모두와 CRSV 조합 6가지 중 nested primer 조합을 많이 만들 수 있는 조합 2가지를 대상으로 희석한계 실험을 실시하였다. 실험 결과, CNFV primer 조합 1, 3 및 18에서 10−2의 민감도를 보였고, 나머지 조합들은 모두 10−1 이하의 민감도를 보였으며(Fig.
- 0; Lynnon Biosoft, Canada)를 사용하여 sequence alignment 후 annealing temperature 51−59℃를 조건으로 종 특이적인 염기서열을 탐색하였다(Pan 등, 2000). CNFV는 정방향 8가지와 역방향 7가지, CRSV는 정방향 9가지와 역방향 8가지 primer를 설계하였으며(data not shown), 설계한 primer 정보는 Table 1에 기재하였다.
- 4). Nested PCR primer는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, primer set와의 사이즈 차이 등을 고려하여 최종 선발하였다(Table 2). 최종 선발된 nested PCR primer set는 CNFV의 경우 두 개의 primer set 공통으로 CNF_N10/C70 (147 bp)이 선발되었고, CRSV의 경우 조합 50에 대해서는 CRS_N80/C30 (395 bp)이, primer set 54에 대해서는 CRS_N30/C70 (347 bp)이 선발되었다.
- RNA를 주형으로 cDNA 합성은 42℃에서 60분 후 60℃에서10분 반응시켰으며, PCR은 RT-PCR의 역전사반응을 제외한 나머지와 동일하게 반응시켰다. PCR 산물은 1X TAE buffer를 이용하여 1.2% agarose gel에서 80분 전기영동후 ethidium bromide (SIGMA-ALDRICH)로 염색하여 UV 하에서 확인하였다.
- PCR은 카네이션 genomic DNA 1 µl를 주형으로 정방향과 역방향 primer (25 pmol)를 각각 1 µl, deionized distilled water 7 µl 및 Fast PCR PreMixture 10 µl, 전체 20 µl로 실시하였다.
- RNA에서 cDNA 합성은 감염시료의 잎에서 추출한 total RNA 2 µl를 주형으로, M-MuLV Reverse transcriptase (Roche, Switzerland) 4 µl, N25 primer (50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N) 3 µl, 2 mM dNTP (Enzynomics, Korea) 2 µl, RNasin® (Promega, USA) 0.7 µl, M-MuLV (Roche, Switzerland) 1.6 µl 및 DW 6.7 µl로 총 볼륨 20 µl로 수행 하였다.
- RNA에서 one-step RT-PCR을 위에서 추출한 total RNA 1 µl를 주형으로, 설계한 정방향과 역방향 primer (25 pmol)를 각각 1 µl, deionized distilled water (Sigma, USA) 7 µl 및 RT-PCR PreMixture (Plutos, Korea) 10 µl를 넣어 총 볼륨 20 µl로 수행하였다.
- 각 시료 0.1 g을 멸균된 막자사발에 담아 액체질소를 첨가하여 마쇄하였고, 최종적으로 nucleic acid free water 20 µl에 녹인 후 RT-PCR과 PCR의 주형으로 사용하였다.
- 각각의 다운로드한 염기서열들은 DNAMAN DNA analysis software package (DNAMAN version 6.0; Lynnon Biosoft, Canada)를 사용하여 sequence alignment 후 annealing temperature 51−59℃를 조건으로 종 특이적인 염기서열을 탐색하였다(Pan 등, 2000).
- 따라서 2011년까지 국내 수입되는 카네이션 시료에서 CNFV와 CRSV의 검사는 모두 ELISA로 이루어졌다. 검사에 많은 시간이 소요되며, 민감도가 낮다는 문제점이 있는 ELISA는 (Caruso 등, 2003; Priou 등, 2006) 최근에 2단계 PCR 검사방법(RT-PCR과 nested PCR)으로 대체되었으며, 2012년부터는 본 연구에서 개발한 검사 방법을 도입하여 CNFV 와 CRSV를 검사하고 있다.
- 또한 CNFV에 감염된 잎은 감염된 바이러스의 농도가 너무 낮아, 1과 3 µl를 사용하여 1차 선발을 수행하였다.
- 본 연구에서는 카네이션에 감염될 수 있는 식물검역 바이러스 중, 카네이션괴저바이러스(CNFV)와 카네이션둥근반점바이러스(CRSV)를 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 종 특이적인 primer를 각각 두 set씩 고안하였고, 더 높은 민감도로 검출이 가능하면서 1차 PCR을 검증할 수 있는 nested PCR primer set를 선발하였다. 또한 실험 시 검사의 신뢰도를 높일 수 있도록 돌연변이-양성대조구 클론(mutation-positive control)을 제작하였다.
- CNFV의 nested는 2 세트 모두 147 bp로 동일하며, CRSV는 각각 395와 347 bp 의 밴드를 증폭하였다. 또한, 실험의 신뢰도를 높이기 위하여, 증폭산물에 염기서열 6개를 삽입한 플라스미드를 제작하여 양성대조구로 활용하였다. 본 연구에서 개발한 방법은, 향후 CNFV와 CRSV에 대한 신속, 정밀한 국경검역을 지원할 수 있을 것이라고 기대된다.
- 본 연구에서는 카네이션에 감염될 수 있는 식물검역 바이러스 중, 카네이션괴저바이러스(CNFV)와 카네이션둥근반점바이러스(CRSV)를 간편하고 신속하게 진단할 수 있는 종 특이적인 primer를 각각 두 set씩 고안하였고, 더 높은 민감도로 검출이 가능하면서 1차 PCR을 검증할 수 있는 nested PCR primer set를 선발하였다. 또한 실험 시 검사의 신뢰도를 높일 수 있도록 돌연변이-양성대조구 클론(mutation-positive control)을 제작하였다.
- Nested PCR primer 선발. 선발된 CNFV 조합 1, 3 및 18에 대하여 각각 3가지, 7가지 및 2가지의 nested primer 조합을 설계하였고, CRSV 조합 50과 54에 대하여 각각 4가지와 13가지의 nested primer 조합을 설계하였다. 설계한 모든 조합에서 밴드가 형성되었으며, 일부 흐리거나 target 하는 크기에 맞지 않거는 비특이적인 밴드도 나타났다(Fig.
- Primer 선발. 설계한 CNFV와 CRSV의 primer는 PCR 증폭이 가능한 21가지와 54가지로 조합하였으며, 이후 4단계에 걸쳐 선발하였다. 1차 선발로 primer 조합들과 대상 바이러스와의 특이적 반응여부를 보고, 2차 선발로 유연관계에 있는 바이러스와의 비특이적 반응여부를 확인하였다.
- 양성대조구 제작을 위하여 최종 선발된 primer set 두 개의 구간을 모두 포함하는 PCR 산물을 증폭하였으며, 이것을 pGEM®-T Easy Vector를 사용하여 클로닝 하였다(Promega, USA).
- 1B). 염기서열 유사 바이러스와 유연관계 바이러스에서의 비특이적인 밴드가 나타나는 primer 조합을 제외하기 위한 2, 3차 선발에서 CNFV의 조합들은 ArMV와 CRSV에 비특이적인 밴드를 형성하지 않아 7가지 모두 선발하였으나(Fig. 2A), CRSV는 3차 선발 중 ArMV에서 조합 28과 46 및 49에서 비특이적인 밴드가 형성되어 이를 제외시킨 6가지 조합을 선발하였다(Fig. 2B). 기주 genomic DNA 와의 비특이적 반응여부를 확인하는 4차 선발에서 CNFV 의 7가지 조합들은 카네이션의 genomic DNA와 비특이적인 밴드를 형성하지 않았으며, CRSV의 7가지 조합들 역시 카네이션과 금낭화에서도 CRSV를 선발하기 위한 primer 조합들은 비특이적인 밴드를 형성하지 않았다(data not shown).
- 이후 합성된 cDNA를 주형으로, Fast PCR PreMixture (Plutos, Korea) 10 µl를 포함하여 총 볼륨 20 µl에 맞춰 nested PCR을 실시하였다.
- 염기서열분석과 양성대조구 제작. 최종 선발된 nested primer set의 PCR 증폭 산물에 대해 염기서열 분석을 의뢰하였으며(Bioneer, Korea), 분석된 염기서열에서 primer binding site를 확인하였다. 양성대조구 제작을 위하여 최종 선발된 primer set 두 개의 구간을 모두 포함하는 PCR 산물을 증폭하였으며, 이것을 pGEM®-T Easy Vector를 사용하여 클로닝 하였다(Promega, USA).
- 최종 선발된 primer set에 대하여 각각의 nested primer 조합을 설계하였으며, 1차 PCR 산물을 1/100 희석하여 1 µl를 주형으로, 위에서 사용한 PCR 조건과 동일하게 반응시켰다.
대상 데이터
- Primer 제작. CNFV와 CRSV의 진단용 primer를 설계하기 위하여 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)로부터 CNFV (EU884443), CRSV (L18870) 그리고 CNFV와 분류학적으로 유사한 클로스터비리데(Closteroviridae) 3종(Beet yellow stunt virus, Beet yellows virus 및 Citrus tristeza virus) 및 CRSV와 분류학적으로 유사한 토버스비리데(Tombusviridae) 7종 (Furcraea necrotic streak virus, Red clover necrotic mosaic virus, Sweet clover necrotic mosaic virus, Maize chlorotic mottle virus, Tomato bushy stunt virus, Tobacco necrosis virus 및 Carnation mottle virus)의 염기서열을 다운로드 하였다. 각각의 다운로드한 염기서열들은 DNAMAN DNA analysis software package (DNAMAN version 6.
- 표준시료. 금지품 수입허가를 통해 검사법 개발대상 바이러스인 CNFV와 CRSV가 감염된 시료를 수집하였으며(ADGEN, England), 2차와 3차 선발에 사용된 cDNA 시료는 국내 기업(PLUTOS, Korea)에서 구매하여 실험에 활용하였다.
- 금지품 허가를 통해 구입한 CNFV와 CRSV 감염 시료에서 total RNA를 각각 155.04 ng/µl와 345.36 ng/µl 추출하였다.
- Nested PCR primer는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, primer set와의 사이즈 차이 등을 고려하여 최종 선발하였다(Table 2). 최종 선발된 nested PCR primer set는 CNFV의 경우 두 개의 primer set 공통으로 CNF_N10/C70 (147 bp)이 선발되었고, CRSV의 경우 조합 50에 대해서는 CRS_N80/C30 (395 bp)이, primer set 54에 대해서는 CRS_N30/C70 (347 bp)이 선발되었다. Primer set와 nested primer set의 자세한 정보는 Table 3에 기재하였다.
- 카네이션은 1996년부터 2012년까지 17년간, 종자 6건 (1,000 kg 미만), 묘 1,413건(75,154,600개), 삽수 103건 (4,700 kg + 317,710개) 및 절화 1,632건(333,390 kg +84,612,770개)의 수입검사가 이루어졌다(Pest information system, 농림검역검사본부 인트라넷; http://10.110.128.100). 이 중 묘에서 Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, Uromyces dianthi, Cladosporium echinulatum, Stemphylium botryosum 및 Botrytis cinerea와 같은 곰팡이 6종, 9건과 절화에서 Uromyces dianthi, Cladosporium echinulatum, Alternaria dianthi, Cladosporium herbarum, Stemphylium botryosum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Epicoccum purpurascens 및 Fusarium avenaceum 과 같은 곰팡이 10종 185건 등 많은 곰팡이 검출 실적을 보였다.
이론/모형
- 양성대조구 제작을 위하여 최종 선발된 primer set 두 개의 구간을 모두 포함하는 PCR 산물을 증폭하였으며, 이것을 pGEM®-T Easy Vector를 사용하여 클로닝 하였다(Promega, USA). 양성대조구로 선발된 클론에 nested primer 증폭부위 안쪽으로 제한효소 Xho I이 반응할 수 있는 염기서열인 CTCGAG (6 bp)를 Site-Directed Mutagenesis Kit를 사용하여 삽입하였으며 (Nelson과 McClelland, 1992), 제품의 프로토콜에 따라 수행하였다.
성능/효과
- 1A). CRSV의 최적 진단용 primer set를 선발하기 위해 설계한 54가지 조합들로 1차 선발을 진행한 결과, onestep과 two-step RT-PCR 모두에서 좋은 결과를 나타낸 밴드는 조합 2(CRS_N10/C80, 435 bp), 조합 3(CRS_N10/ C70, 518 bp), 조합 27(CRS_N40/C70, 294 bp), 조합 28 (CRS_N40/C60, 365 bp), 조합 29(CRS_N40/C50, 457 bp), 조합 46(CRS_N70/C30, 564 bp), 조합 49(CRS_N80/C30, 395 bp), 조합 50(CRS_N80/C20, 503 bp) 및 조합 54 (CRS_N08/C70, 547 bp)로 9가지가 선발되었다(Fig. 1B). 염기서열 유사 바이러스와 유연관계 바이러스에서의 비특이적인 밴드가 나타나는 primer 조합을 제외하기 위한 2, 3차 선발에서 CNFV의 조합들은 ArMV와 CRSV에 비특이적인 밴드를 형성하지 않아 7가지 모두 선발하였으나(Fig.
- 2B). 기주 genomic DNA 와의 비특이적 반응여부를 확인하는 4차 선발에서 CNFV 의 7가지 조합들은 카네이션의 genomic DNA와 비특이적인 밴드를 형성하지 않았으며, CRSV의 7가지 조합들 역시 카네이션과 금낭화에서도 CRSV를 선발하기 위한 primer 조합들은 비특이적인 밴드를 형성하지 않았다(data not shown).
- 양성대조구 제작을 위해 primer set가 제작된 영역을 포함하는 부분인 CNFV 610 bp와 CRSV 1331 bp의 밴드를 증폭시켜 클로닝 후 염기서열을 분석한 결과, 모두 binding site가 확인되었다(data not shown). 돌연변이-양성대조구는 염기서열을 삽입 후 제한 효소 Xho I을 처리하여 확인한 결과, 6개의 nucleotide가 삽입되어 각각 616 bp와 1,337 bp가 증폭되었으며, plasmid에 제한 효소 염기서열의 삽입은 CNFV(Fig. 5A)와 CRSV(Fig. 5B)에서 각각 확인하였다.
- 선발된 CNFV 조합 1, 3 및 18에 대하여 각각 3가지, 7가지 및 2가지의 nested primer 조합을 설계하였고, CRSV 조합 50과 54에 대하여 각각 4가지와 13가지의 nested primer 조합을 설계하였다. 설계한 모든 조합에서 밴드가 형성되었으며, 일부 흐리거나 target 하는 크기에 맞지 않거는 비특이적인 밴드도 나타났다(Fig. 4). Nested PCR primer는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, primer set와의 사이즈 차이 등을 고려하여 최종 선발하였다(Table 2).
- 실험 결과, CNFV primer 조합 1, 3 및 18에서 10−2의 민감도를 보였고, 나머지 조합들은 모두 10−1 이하의 민감도를 보였으며(Fig. 3A), CRSV는 조합 50과 54에서 각각 10−3과 10−4의 민감도를 보였다(Fig. 3B).
- 염기서열 분석과 돌연변이-양성대조구 제작. 양성대조구 제작을 위해 primer set가 제작된 영역을 포함하는 부분인 CNFV 610 bp와 CRSV 1331 bp의 밴드를 증폭시켜 클로닝 후 염기서열을 분석한 결과, 모두 binding site가 확인되었다(data not shown). 돌연변이-양성대조구는 염기서열을 삽입 후 제한 효소 Xho I을 처리하여 확인한 결과, 6개의 nucleotide가 삽입되어 각각 616 bp와 1,337 bp가 증폭되었으며, plasmid에 제한 효소 염기서열의 삽입은 CNFV(Fig.
- 100). 이 중 묘에서 Fusarium moniliforme, Alternaria alternata, Uromyces dianthi, Cladosporium echinulatum, Stemphylium botryosum 및 Botrytis cinerea와 같은 곰팡이 6종, 9건과 절화에서 Uromyces dianthi, Cladosporium echinulatum, Alternaria dianthi, Cladosporium herbarum, Stemphylium botryosum, Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Epicoccum purpurascens 및 Fusarium avenaceum 과 같은 곰팡이 10종 185건 등 많은 곰팡이 검출 실적을 보였다. 반면, 지난 17년간 CNFV와 CRSV는 각각 1,968,830건의 검사가 이루어졌으나, 이를 포함하여 바이러스가 검출되어 검역처분을 한 경우는 아직 한 번도 없었다.
후속연구
- 또한, 실험의 신뢰도를 높이기 위하여, 증폭산물에 염기서열 6개를 삽입한 플라스미드를 제작하여 양성대조구로 활용하였다. 본 연구에서 개발한 방법은, 향후 CNFV와 CRSV에 대한 신속, 정밀한 국경검역을 지원할 수 있을 것이라고 기대된다.
- 돌연변이-양성대조구는 실험 시 양성대조구로 사용될 것이며, 염기서열을 분석하면 6개의 염기서열 삽입 유무에 따라 plasmid에서 시료로 부터의 오염을 확인할 수 있을 것이다. 본 연구에서 개발한 방법이 카네이션 절화, 종자, 묘, 삽수 등 수입검역 시료에서 CNFV 와 CRSV를 신속, 정확 그리고 특이적으로 검출 가능하여 검역검사에 기여할 것이라고 예상된다.
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