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문제 정의
- 딱지꽃의 chloroform 분획물의 NO와 PGE2의 합성 저해효과가 유전자의 조절에 의한 것인지 확인해보기 위하여 두 효소의 발현 억제효과를 RT-PCR을 통해 확인해 보았다. iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.
- 본 연구는 항염증 효과를 나타내는 기능성 식품 및 의약품 소재 개발을 위한 기초 연구로서 딱지꽃의 NO와 PGE2 합성 억제효과를 규명하기 위해 용매 분획별 NO와 PGE2에 대한 저해 활성을 조사하였으며, 최종적으로 선정된 딱지꽃의 chloroform 분획 추출물에 대한 iNOS와 COX-2의 발현 억제 효과를 확인하였다.
- NO는 NO 합성효소에 의해 L-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체로 면역반응, 세포독성, 신경전달계 및 혈관이완 등 여러 생물학적인 과정에 관여하며 농도에 따라 세포기능 유지에 중요한 작용을 하기도 하고 세포독성을 일으키기도 한다 [15]. 본 연구에서는 딱지꽃 추출물이 NO와 PGE2의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 마우스의 대식세포인 RAW264.7에 LPS의 단독처리 또는 용매 분획별 추출농도별로 동시에 처리하여 NO 저해 활성을 조사하였다 (Fig. 1).
제안 방법
- 시료의 NO 생성 저해 활성은 Nitrite assay를 사용하여 측정하였다 [14]. NO합성의 indicator로 사용되는 NO2농도는 Griess reagent (1% Sulfonic acid, 0.1% N-1-napthylethyl- enediamine dihydrochloride, 2.5% phosphoric acid)을 이용하여 배양배지에서 측정하였다. RAW264.
- Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 사용하여 딱지꽃 chloroform 추출물의 농도별 mRNA 상에서의 발현 정도를 확인하였다. 다음과 같은 조건으로 RT-PCR을 실시하였다.
- cDNA 합성 45°C, 30분 denaturation 94°C, 5분 denaturation 94°C, 5분 annealing 50~55°C, 1분 elongation 72°C, 2분을 25 cycles한 다음, final elongation step을 72°C에서 5분간 수행하였다.
- 따라서 chloroform 분획물의 처리농도를 독성을 보이지 않은 20, 40, 80, 100, 200, 300 μg/mL로 하여 NO와 PGE2의 생성 억제 효과 실험을 진행하였다.
- 얻은 여액은 45°C 수욕상에서 진공회전 농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)로 감압 농축한 후 건조하여 냉장 보관하며 에탄올 추출물 시료로 사용하였다. 또한 에탄올 추출물에서 증류수로 현탁시킨 후 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, water순으로 용매 분획을 하여 실험에 사용하였다.
- 그 외의 시약과 용매는 일급 또는 특급을 사용하였다. 사용 기기로는 흡광도 측정을 위하여 microplate reader (Biorad Model 550, CA, USA)를 사용하였으며, DNA의 상대적인 발현 비율을 측정하기 위하여 densitometer (Bio-Rad Lab., CA, USA)를 이용하였다.
- 본 실험에 사용한 딱지꽃은 서울경동시장 약재도매 상가에서 원산지를 확인한 후 구입하였으며, 건조 및 마쇄하여 사용하였다. 시료의 추출은 시료 100 g에 에탄올 (95% EtOH, 시약용 1급)을 가하여 실온에서 24시간 동안 방치하고 여과하여, 다시 잔사에 에탄올을 가하여 침지한 후 여과하는 과정을 3회 반복하여 실행하였다. 얻은 여액은 45°C 수욕상에서 진공회전 농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)로 감압 농축한 후 건조하여 냉장 보관하며 에탄올 추출물 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 300 μg/mL의 농도까지 세포 생존력에서 독성을 보이지 않는 것을 확인할 수 있었으며 (Fig. 2), 최종 시료로 chloroform 분획물을 선정하였다.
- Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium(DMEM)은 Gibco (Rckville, MD, USA) 제품을 구입하여 사용하였고, PGE2 assay kit는 R&D system (Minneapolis, MN, USA) 제품을, Maxim RT-PCR kit는 Quiagen 제품을 사용하였다.
- RAW264.7 대식세포는 한국세포주은행 (KCLB, Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포는 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin을 포함하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 딱지꽃은 서울경동시장 약재도매 상가에서 원산지를 확인한 후 구입하였으며, 건조 및 마쇄하여 사용하였다. 시료의 추출은 시료 100 g에 에탄올 (95% EtOH, 시약용 1급)을 가하여 실온에서 24시간 동안 방치하고 여과하여, 다시 잔사에 에탄올을 가하여 침지한 후 여과하는 과정을 3회 반복하여 실행하였다.
- 본 실험에 사용한 시약은 Sulfonic acid, phosphoric acid, N-1- napthylethylenediamine dihydrochloride, Lipopolysaccharides (LPS), N-monomethyl-L-arginine (L-NMMA), 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), Fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin, TRIzol reagent, dimethy sulfoxide (DMSO)등은 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을 이용하였다. Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium(DMEM)은 Gibco (Rckville, MD, USA) 제품을 구입하여 사용하였고, PGE2 assay kit는 R&D system (Minneapolis, MN, USA) 제품을, Maxim RT-PCR kit는 Quiagen 제품을 사용하였다.
- 얻은 여액은 45°C 수욕상에서 진공회전 농축기 (EYELA, Tokyo, Japan)로 감압 농축한 후 건조하여 냉장 보관하며 에탄올 추출물 시료로 사용하였다.
데이터처리
- One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p < 0.05, **p < 0.01).
- 모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 10.0 프로그램을 이용하여 각 처리구 간의 유의성(p < 0.05, 0.01)검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 tukey test로 다중 비교를 실시하였다.
이론/모형
- 모든 실험에서 fresh culture medium을 blank로 사용되었다. PGE2의 생성량을 측정하기 위해 nitrite를 측정하였던 동일한 배지로 PGE2 assay를 사용하여 enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA)를 이용하여 제조사에서 제시한 방법으로 실험하였다.
- 세포에 대한 독성 측정은 MTT 환원방법을 이용하여 측정하였다 [13]. RAW264.
- 시료의 NO 생성 저해 활성은 Nitrite assay를 사용하여 측정하였다 [14]. NO합성의 indicator로 사용되는 NO2농도는 Griess reagent (1% Sulfonic acid, 0.
성능/효과
- Fig. 3을 보면, 100 μg/mL이상의 농도에서 NO합성 저해제인 L-NMMA와 유사한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, PGE2 저해활성에서는 80 μg/mL 에서 60%, 100 μg/mL이상의 농도에서 90% 정도의 저해효과를 나타냈다 (Fig. 4).
- LPS를 처리한 RAW264.7 대식세포에서 생성된 NO의 함량이 14.42 μM 수준으로 증가하였으며, 딱지꽃의 각 용매 분획별 추출물을 농도별 (50, 100, 300, 500 μg/mL)로 처리하였을 때 chloroform 분획물에서 다른 분획물보다 높은 NO 생성 저해 활성을 보였다 (p < 0.05).
- 딱지꽃 에탄올 추출물에서 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, water 순으로 용매 분획을 실시한 후 NO 생성 저해 활성을 측정한 결과, chloroform 분획물에서 가장 높은 저해 활성을 보여 최종 분리 시료로 선정하였으며, PGE2에 대한 합성 저해 효과를 확인한 결과 100 μg/mL 이상의 농도에서 PGE2합성 저해제인 indomethacin과 유사한 효과를 보였다. NO와 PGE2의 합성저해효과가 유전자의 조절에 의해서인지 알아보기 위해 iNOS와 COX-2 gene의 발현 조절효과를 RT-PCR을 통하여 확인해본 결과 두 유전자의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 딱지꽃 추출물이 독성과 부작용이 적은 염증 치료제로 활용될 수 있는 가능성이 높음을 제시한다.
- 합성을 저해하는 물질을 찾기 위해 항염증 효과가 있다고 알려져 있는 딱지꽃에서 69%의 높은 NO 저해활성이 있다는 것을 확인하였다. 딱지꽃 에탄올 추출물에서 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, water 순으로 용매 분획을 실시한 후 NO 생성 저해 활성을 측정한 결과, chloroform 분획물에서 가장 높은 저해 활성을 보여 최종 분리 시료로 선정하였으며, PGE2에 대한 합성 저해 효과를 확인한 결과 100 μg/mL 이상의 농도에서 PGE2합성 저해제인 indomethacin과 유사한 효과를 보였다. NO와 PGE2의 합성저해효과가 유전자의 조절에 의해서인지 알아보기 위해 iNOS와 COX-2 gene의 발현 조절효과를 RT-PCR을 통하여 확인해본 결과 두 유전자의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.
- 딱지꽃의 용매별 수율을 분석한 결과, 에탄올 추출물은 4.34% (w/w)를 나타냈으며, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol로 용매 분획한 결과 각각 2.34, 1.28, 0.57, 0.59% (w/w)의 수율을 보였다.
- 염증발현 유도물질인 LPS 처리군과 비교해 보았을 때 iNOS의 경우 100 μg/mL이상의 농도에서 높은 발현 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, COX-2의 경우 50 μg/ mL이상의 농도에서 높은 발현 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 4). 위 결과는 딱지꽃의 chloroform 분획물이 독성을 나타내지 않으면서 LPS에 의해 생성 및 분비가 증가된 NO와 PGE2를 효과적으로 억제시킨다는 것을 나타낸다.
- 염증발현 유도물질인 LPS 처리군과 비교해 보았을 때 iNOS의 경우 100 μg/mL이상의 농도에서 높은 발현 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었으며, COX-2의 경우 50 μg/ mL이상의 농도에서 높은 발현 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이를 통해 딱지꽃의 chloroform 분획물을 처리한 양쪽 group 모두 농도에 따라 iNOS와 COX-2 유전자의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). 추후 딱지꽃의 chloroform 분획부분의 물질을 구조적으로 밝히고, 항염증 활성을 나타내는 기전을 규명하는 연구가 추가적으로 수행되어야 한다고 사료된다.
- 항염증 효과가 있는 기능성 식품 및 의약품 소재의 개발을 위하여 천연 식물 자원으로부터 NO와 PGE2 합성을 저해하는 물질을 찾기 위해 항염증 효과가 있다고 알려져 있는 딱지꽃에서 69%의 높은 NO 저해활성이 있다는 것을 확인하였다. 딱지꽃 에탄올 추출물에서 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol, water 순으로 용매 분획을 실시한 후 NO 생성 저해 활성을 측정한 결과, chloroform 분획물에서 가장 높은 저해 활성을 보여 최종 분리 시료로 선정하였으며, PGE2에 대한 합성 저해 효과를 확인한 결과 100 μg/mL 이상의 농도에서 PGE2합성 저해제인 indomethacin과 유사한 효과를 보였다.
후속연구
- NO와 PGE2의 합성저해효과가 유전자의 조절에 의해서인지 알아보기 위해 iNOS와 COX-2 gene의 발현 조절효과를 RT-PCR을 통하여 확인해본 결과 두 유전자의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 딱지꽃 추출물이 독성과 부작용이 적은 염증 치료제로 활용될 수 있는 가능성이 높음을 제시한다.
- 5). 추후 딱지꽃의 chloroform 분획부분의 물질을 구조적으로 밝히고, 항염증 활성을 나타내는 기전을 규명하는 연구가 추가적으로 수행되어야 한다고 사료된다.
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