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문제 정의
- 추출물 속의 주요 성분을 high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분리정제 후 mass spectroscopy 및 nuclearmagnetic resonance (NMR)를 통해 주요 물질을 동정하였다. 또한, 추후 딱지꽃 뿌리 추출물의 산업적 이용을 위해 동정된 주요물질이 용매 별로 얼마나 추출되는지 확인하였다.
제안 방법
- HPLC를 통해 정제된 딱지꽃 뿌리추출물의 22.2분 주요 피크를 1H NMR 분석을 수행하였다. 그 결과 δ4.
-
NMR 및 MALDI-TOF MS를 통한 딱지꽃 뿌리추출물의 주요 피크 구조 분석.
- 따라서, 본 연구는 강원도 정선의 고랭지에서 자생하는 딱지꽃의 뿌리를 다양한 용매를 사용하여 추출하여 유효성분의 차이를 비교 분석 하였고, 그 중 주요성분이 가장 많이 추출되는 용매인 methanol을 사용하여 딱지꽃의 뿌리를 추출하였다. 추출물 속의 주요 성분을 high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분리정제 후 mass spectroscopy 및 nuclearmagnetic resonance (NMR)를 통해 주요 물질을 동정하였다.
- 딱지꽃 뿌리 추출물을 추출용매에 따른 주요성분을 HPLC로 분석하였다. 분석 조건은 0.
-
딱지꽃 뿌리 추출물의 HPLC 분석.
-
딱지꽃 뿌리에서 용매별 추출물의 2,3,8-tri-O-methylellagic acid (1) 함량 분석.
- 딱지꽃 뿌리에서 용매별 추출물의 주요 성분 차이를 비교하기 위하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과 아세트산에틸과 헥산을 이용하여 추출한 추출물과 달리 정제수, 메탄올, 부탄올에서 추출된 추출물에서 일정한 주요 피크(22.
- 본 연구에서는 그 동안 연구가 미비했던 딱지꽃의 뿌리의 추출물의 주요성분을 2,3,8-Tri-O-methylellagic acid로 분리동정 하였다. 화합물 (1)은 문헌 조사결과 항균활성에 중요한 역할을 미치는 물질임이 알려져 있었다.
- 1). 본 연구에서는 정제수 및 알코올류 용매에서 주요하게 추출되는 주요성분(retention time: 22.2분)을 분리 동정하였다.
- 용매에 따른 딱지꽃 뿌리추출물에서의 화합물 (1)의 함량을 분석하기 위해 시중 구입 가능한 화합물 (1)을 100, 200, 300 ppm 농도로 제조 후 HPLC를 이용하여 표준곡선(standard curve)를 만들었다. 이를 이용하여 각 용매별로 추출된 화합물 (1) 양을 정량한 결과 메탄올 643.
- 이러한 결과를 토대로 문헌상에 확인된 딱지꽃 성분 중 가장 유사한 NMR 결과를 가진 물질이 2,3,8-tri-Omethylellagic acid (1)임을 확인 할 수 있었다(Kim, 1989). 이를 확인하기 위해 시중 구입 가능한 2,3,8-Tri-O-methylellagic acid (1)를 구입하여 동일한 조건으로 1H NMR data를 확인한 결과 비슷한 결과를 확인하였다(Table 1).
- 정제된 딱지꽃 뿌리 추출물 주요 피크를 동결건조 시킨 후 연한 노란색의 파우더를 확보한 다음 메탄올에 녹인 후 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid와 섞고 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석을 수행하였다.
- 정제된 딱지꽃뿌리 추출물 주요 피크를 동결건조 시킨 후 연한 노란색의 파우더를 확보한 다음 CDCl3 에 녹여 분석을 수행하였다. 화합물(1) (400 MHz NMR, CDCl3) δ 4.
- 추가적으로 분리된 주요물질의 분자량을 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석 함으로써 화합물 (1)과 동일한 물질인지 확인하였다. 그 결과 분자량 [M+H]+=345.
- 따라서, 본 연구는 강원도 정선의 고랭지에서 자생하는 딱지꽃의 뿌리를 다양한 용매를 사용하여 추출하여 유효성분의 차이를 비교 분석 하였고, 그 중 주요성분이 가장 많이 추출되는 용매인 methanol을 사용하여 딱지꽃의 뿌리를 추출하였다. 추출물 속의 주요 성분을 high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분리정제 후 mass spectroscopy 및 nuclearmagnetic resonance (NMR)를 통해 주요 물질을 동정하였다. 또한, 추후 딱지꽃 뿌리 추출물의 산업적 이용을 위해 동정된 주요물질이 용매 별로 얼마나 추출되는지 확인하였다.
- 추출을 위하여 딱지꽃 시료를 60℃에서 2일 동안 건조하였고, 각각 정제수(2 L), 메탄올(2 L), 아세트산에틸(2 L), 헥산(2 L)을 사용하여 추출하였다. 추출 시 농도는 2 g/L로 추출한 후, 여과하여 그 액을 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 2×300 mm) column을 사용하였다. NMR 분석은 Bruker사의 400 MHz NMR을 사용하였다. 그리고 Mass 분석은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight)를 이용하였으며 Perseptive Biosystem 사의 Voyager-De STR의 모델을 사용하였으며 matrix로 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 사용하였다.
- 그리고 주요성분을 분리정시에는 waters 600E system, waters 484 detector, phenomenex C18 (5 µm, 20.2×300 mm) column을 사용하였다.
- 딱지꽃의 HPLC 분석은 waters 1525µ binary HPLC pump, waters 996 photodiode array detector를 사용하였고, 사용된 컬럼은 gemini C18 (5µm, 4.6×250 nm, phenomenex, Madrid Avenue Torrance, CA, USA) column을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 딱지꽃은 정선 배서영농조합과 진주 영농조합법인 이노플랜트 두 곳에서 수급하여 사용하였다.
- 딱지꽃 뿌리 추출물을 추출용매에 따른 주요성분을 HPLC로 분석하였다. 분석 조건은 0.1% 삼불화아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)를 포함한 정제수(용매A)와 아세토나이트릴(용매B)를 사용하였고 1 mL/min (분석시) 혹은 5 mL/min (분리동정시) 유속으로 254 nm 파장에서 분석하였다.
이론/모형
- 그리고 Mass 분석은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight)를 이용하였으며 Perseptive Biosystem 사의 Voyager-De STR의 모델을 사용하였으며 matrix로 α-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 사용하였다.
성능/효과
- 그 결과 δ4.10, 4.23, 4.40 ppm에서 단일선과 7.51, 7.76 ppm에서 단일선의 수소 피크를 확인하였다.
- 추가적으로 분리된 주요물질의 분자량을 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석 함으로써 화합물 (1)과 동일한 물질인지 확인하였다. 그 결과 분자량 [M+H]+=345.8를 확인함으로써 화합물(1)의 분자량과 일치함을 알 수 있었다.
- 딱지꽃 뿌리에서 용매별 추출물의 주요 성분 차이를 비교하기 위하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 결과 아세트산에틸과 헥산을 이용하여 추출한 추출물과 달리 정제수, 메탄올, 부탄올에서 추출된 추출물에서 일정한 주요 피크(22.2 분)를 확인할 수 있었다(Fig. 1). 본 연구에서는 정제수 및 알코올류 용매에서 주요하게 추출되는 주요성분(retention time: 22.
- 화합물 (1)은 문헌 조사결과 항균활성에 중요한 역할을 미치는 물질임이 알려져 있었다. 또한 산업적응용을 위해 용매별로 화합물 (1)의 추출양을 정량함에 따라 메탄올이 최적의 추출용매임을 확인하였다.
- 위 결과들을 바탕으로 딱지꽃의 뿌리에서 추출된 주요 물질이 2,3,8-Tri-O-methylellagic acid (1)임을 확인하였다(Fig. 2). 문헌 화합물 (1)은 주로 항균작용을 물질로 알려져 있음을 확인하였다(Ndukwe와 Zhao, 2007).
- 8 ppm, 헥산 0 ppm으로 확인되었다. 이 결과를 바탕으로 화합물 (1)은 뿌리에서 메탄올을 이용하여 추출 시 가장 많은 양이 추출된다는 것을 알 수 있다(Table 2).
- 용매에 따른 딱지꽃 뿌리추출물에서의 화합물 (1)의 함량을 분석하기 위해 시중 구입 가능한 화합물 (1)을 100, 200, 300 ppm 농도로 제조 후 HPLC를 이용하여 표준곡선(standard curve)를 만들었다. 이를 이용하여 각 용매별로 추출된 화합물 (1) 양을 정량한 결과 메탄올 643.5 ppm, 정제수 319.0 ppm, 부탄올 153.1 ppm, 아세트산에틸 2.8 ppm, 헥산 0 ppm으로 확인되었다. 이 결과를 바탕으로 화합물 (1)은 뿌리에서 메탄올을 이용하여 추출 시 가장 많은 양이 추출된다는 것을 알 수 있다(Table 2).
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